豆芽中氟喹諾酮和硝基咪唑類藥物的測定液相色譜-質(zhì)譜質(zhì)譜法

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ICS67.120.30 B 50 T/ZACA 團體標(biāo)準(zhǔn) T/ZACA XXXXX—XXXX 豆芽中氟喹諾酮和硝基咪唑類藥物殘留量測定液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法 Determinationof residues of fluoroquinolones and nitroimidazoles in beansprout-Liquid chromatography-tandem mass spectrometry XXXX - XX - XX發(fā)布 XXXX - XX - XX實施 浙江省質(zhì)量合格評定協(xié)會發(fā)布 T/ZACA XXXXX—XXXX 目次 前言 II 1　范圍 1 2　規(guī)范性引用文件 1 3　原理 1 4　試劑和材料 1 5　儀器 2 6　試樣的制備與保存 2 7　分析步驟 2 8　精密度、靈敏度和準(zhǔn)確度 5 附錄A（資料性附錄）　氟喹諾酮類及硝基咪唑類藥物中英文名稱、CAS號、分子式和相對分子質(zhì)量 6 附錄B（資料性附錄）　氟喹諾酮類及硝基咪唑類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液選擇離子流圖(20　μg/kg) 7 前言 本標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)GB/T 1.1-2009給出的規(guī)則起草。 請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別這些專利的責(zé)任。 本標(biāo)準(zhǔn)由浙江省質(zhì)量合格評定協(xié)會提出。 本標(biāo)準(zhǔn)由浙江省質(zhì)量合格評定協(xié)會歸口。 本標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位：綠城農(nóng)科檢測技術(shù)有限公司、浙江省疾病預(yù)防控制中心。 本標(biāo)準(zhǔn)參與起草單位：浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所、湖州市農(nóng)畜水產(chǎn)品檢測中心、麗水藍城農(nóng)科檢測技術(shù)有限公司。 本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：余鵬飛、何曉明、章舒祺/徐小民、楊魯瓊、洪琳、倪娟楨、田佩琪、徐杰、沈東強、朱萌萌、周婷婷、盧軍、陳志民、朱麗婷。 本標(biāo)準(zhǔn)為首次發(fā)布。 9 豆芽中氟喹諾酮和硝基咪唑類藥物的測定液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法 1　 范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豆芽中恩諾沙星、諾氟沙星、培氟沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、達氟沙星、洛美沙星、甲硝唑、二甲硝咪唑、異丙硝唑、洛硝噠唑含量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于豆芽中恩諾沙星、諾氟沙星、培氟沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、達氟沙星、洛美沙星、甲硝唑、二甲硝咪唑、異丙硝唑、洛硝噠唑含量的測定。 2　 規(guī)范性引用文件 下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。 GB/T 6682 分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法。 3　 原理 試樣用1%乙酸乙腈提取，經(jīng)均質(zhì)提取、濃縮、正己烷凈化、離心后，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定，用基質(zhì)外標(biāo)法定量。 4　 試劑和材料 除特殊注明外，所有試劑均為分析純，水為符合GB/T 6682規(guī)定的一級水。 4.1　 試劑 4.1.1　 乙腈：色譜純。 4.1.2　 乙腈：分析純。 4.1.3　 乙酸：分析純。 4.1.4　 氯化鈉：分析純。 4.1.5　 甲醇：色譜純。 4.1.6　 甲酸：色譜純。 4.1.7　 甲酸銨：色譜純。 4.1.8　 正己烷：色譜純 4.2　 試劑配制 4.2.1　 1%乙酸乙腈：移取5 mL乙酸（4.1.3）和495 mL乙腈（4.1.2）混合。 4.2.2　 復(fù)溶液（0.1%甲酸30%甲醇水溶液）：300 mL甲醇（4.1.5）、1mL甲酸和699mL水混合。 4.3　 標(biāo)準(zhǔn)品 氟喹諾酮類8種、4種硝基咪唑類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：純度均大于等于90%（詳見附錄A） 4.4　 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 4.4.1　 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液 標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取適量每種氟喹諾酮和硝基咪唑類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（4.3）于25.00mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，混合均勻，轉(zhuǎn)移至儲液瓶中，-18℃以下避光保存，有效期為6個月。 4.4.2　 標(biāo)準(zhǔn)中間液 標(biāo)準(zhǔn)中間液：分別準(zhǔn)確移取每種標(biāo)準(zhǔn)儲備液（4.4.1）于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成10.0mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液，混合均勻，轉(zhuǎn)移至儲液瓶中，-18℃以下避光保存，有效期為3個月。 4.4.3　 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液 分別準(zhǔn)確移取每種1.00 mL標(biāo)準(zhǔn)中間液（4.4.2）于10.00mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成1.00mg/mL混合均勻，轉(zhuǎn)移至儲液瓶中，4℃以下避光保存，有效期為7天。 4.4.4　 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線 移取一定體積的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（4.4.3）用空白基質(zhì)液分別配制成含4.00μg/L、20.0μg/L、50.0μg/L、100μg/L、250μg/L、500 μg/L的8種氟喹諾酮類和4種硝基咪唑類標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，濃度由低到高進樣檢測，以定量子離子的峰面積為縱坐標(biāo)，對應(yīng)濃度為橫坐標(biāo)，采用直線擬合的方式繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。實際檢測中，經(jīng)驗證后可適當(dāng)調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度范圍。 5　 儀器 5.1　 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧（ESI）離子源。 5.2　 高速組織搗碎機。 5.3　 分析天平，感量0.01g和0.00001g. 5.4　 氮吹儀。 5.5　 渦旋混勻器（2500 r/min）。 5.6　 離心機：轉(zhuǎn)速≥12000 r/min。 5.7　 超聲清洗儀。 5.8　 10mL試管。 5.9　 離心管：50 mL。 5.10　 容量瓶：25 mL。 5.11　 尼龍膜:0.22 μm。 6　 試樣的制備與保存 取代表性豆芽樣品約500 g，將其切碎后（不可用水洗），經(jīng)高速組織搗碎機均勻搗碎，均分成兩份，裝入潔凈容器內(nèi)，密封，-18℃以下保存。 7　 分析步驟 7.1　 樣品處理 稱取5 g（精確至0.01g）試樣，于50 mL離心管中，加入5mL水和10mL1%乙酸乙腈（4.2.1）均質(zhì)1 min，超聲提取20min，加入5g氯化鈉（4.1.4）渦旋1min，12000 r/min離心3min，上層有機相轉(zhuǎn)移到25 mL容量瓶中。殘渣再用10 mL1%乙酸乙腈（4.2.1）重復(fù)提取一次，合并兩次提取液，用1%乙酸乙腈（4.2.1）定容到25mL，混合均勻，準(zhǔn)確移取10mL提取液于10mL試管中，40℃氮吹至近干。加入1mL復(fù)溶液（4.2.2），超聲3min、渦旋3min，溶解殘渣，再加入1 mL正己烷，渦旋30s，12000 r/min離心3min，取下層清液過0.22 μm尼龍膜于樣品瓶中，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。 7.2　 測定 7.2.1　 液相色譜條件 7.2.1.1　 色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3，2.1100mm（i.d.），1.8 m，或性能相當(dāng)者。 7.2.1.2　 進樣量：5μL。 7.2.1.3　 流速為：0.35mL/min。 7.2.1.4　 柱溫：35℃ 7.2.1.5　 流動相：A為0.1%甲酸2 mmol甲酸銨水溶液；B為0.1%甲酸乙腈。梯度洗脫條件見表1。 表1　 梯度洗脫程序 時間/min 流速/（mL/min） 流動相A/（%） 流動相B/（%） 0.00 0.35 93 7 0.50 0.35 93 7 3.00 0.35 75 25 4.50 0.35 5 95 5.00 0.35 5 95 5.01 0.35 93 7 7.00 0.35 93 7 7.3　 質(zhì)譜條件 7.3.1　 離子源為電噴霧離子源（ESI）。 7.3.2　 掃描方式為正離子掃描。 7.3.3　 檢測方式為多反應(yīng)監(jiān)測。 7.3.4　 干燥氣流量：8.0L/min。 7.3.5　 加熱氣流量：10L/min。 7.3.6　 接口溫度：300℃。 7.3.7　 霧化氣流量：2.8L/min。 7.3.8　 DL管溫度：250℃。 7.3.9　 加熱塊溫度：400℃。 7.3.10　 毛細管電壓：4000V。 7.3.11　 定性離子對、定量離子對、碰撞能量（CE）和偏轉(zhuǎn)電壓（Q1、Q3）見表2。 表2　 多反應(yīng)監(jiān)測條件 被測物名稱 參考保留時間/min 母離子（m/z） 子離子（m/z） Q1電壓/V CE Q3電壓/V 恩諾沙星 4.36 360.20 316.20* -13.0 -19.0 -15.0 342.20 -13.0 -21.0 -16.0 諾氟沙星 4.02 320.20 302.15* -12.0 -20.0 -22.0 231.05 -12.0 -38.0 -25.0 培氟沙星 4.08 334.20 316.15* -26.0 -21.0 -22.0 290.15 -26.0 -18.0 -14.0 環(huán)丙沙星 4.10 332.20 314.15* -23.0 -20.0 -23.0 231.10 -23.0 -37.0 -25.0 氧氟沙星 4.05 362.20 318.20* -14.0 -19.0 -21.0 261.15 -14.0 -27.0 -13.0 沙拉沙星 4.48 386.20 368.05* -14.0 -23.0 -26.0 342.10 -14.0 -19.0 -24.0 洛美沙星 4.26 352.20 265.10* -27.0 -23.0 -12.0 308.20 -27.0 -16.0 -21.0 達氟沙星 4.26 358.20 340.15* -30.0 -30.0 -30.0 82.10 -30.0 -50.0 -29.0 甲硝唑 2.94 172.10 128.10* -22.0 -13.0 -24.0 82.15 -22.0 -25.0 -29.0 二甲硝咪唑 3.46 142.10 96.15* -10.0 -17.0 -18.0 81.15 -10.0 -25.0 -30.0 洛硝噠唑 3.31 201.10 140.10* -14.0 -14.0 -14.0 55.20 -14.0 -23.0 -24.0 異丙硝唑 4.80 170.10 109.15* -21.0 -25.0 -22.0 124.20 -21.0 -21.0 -23.0 注： 帶“*”的離子為定量離子；對于不同質(zhì)譜儀，儀器參數(shù)可能存在差異，測定前應(yīng)將質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化到最佳。 7.4　 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定 7.4.1　 定量測定 采用基質(zhì)加標(biāo)單點法或者基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線法定量。根據(jù)試樣中被測組分的含量，選取響應(yīng)值適宜的標(biāo)準(zhǔn)工作液進行分析。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和待測樣液中8種氟喹諾酮和4種硝基咪唑的響應(yīng)均在方法的線性響應(yīng)范圍內(nèi)。如果含量超過標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，可調(diào)整取樣量、定容體積，重新處理樣品后進行測定。在上述色譜條件下，參考保留時間參見表2；標(biāo)準(zhǔn)溶液多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖見附錄B中B.1。 7.4.2　 定性測定 在相同的實驗條件下，樣液中被測物的色譜峰保留時間與標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜峰的保留時間相比較，變化范圍應(yīng)在2.5%之內(nèi)；并且在扣除背景后的樣液圖譜中，所選的離子對均出現(xiàn)，各定性離子的相對豐度與標(biāo)準(zhǔn)品離子的相對豐度相比，偏差不超過表3規(guī)定的范圍，則可判斷樣品中存在對應(yīng)的被測物。 表3　 定性確證時相對離子豐度的最大允許偏差 相對離子豐度/% ≥50 ＞20至50 ＞10至20 ≤10 允許的相對偏差/% 20 25 30 50 7.4.3　 空白試驗 除不加試樣外，均按上述測定步驟進行。 7.4.4　 結(jié)果計算和表述 試樣中被測組分含量按式（1）計算，計算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。 X=CV1000m10001025 …………………………………………（1） 式中： X——試樣中被測組分的含量，單位為微克每千克（mg/kg）； c——標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出的試樣上機液中被測組分的濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）； V——試樣的定容體積，單位為毫升（mL）; m——試樣的質(zhì)量，單位為克（g）。 8　 精密度、靈敏度和準(zhǔn)確度 8.1　 精密度 在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的20%。 8.2　 靈敏度 本方法定量限為2.0 μg/kg。 8.3　 準(zhǔn)確度 本方法中被測組分的添加濃度在2.00mg/kg~250mg/kg時，回收率為70.0%~120%。 A A 附　錄　A （資料性附錄） 氟喹諾酮類及硝基咪唑類藥物中英文名稱、CAS號、分子式和相對分子質(zhì)量 表A.1　 氟喹諾酮類及硝基咪唑類藥物中英文名稱、CAS號、分子式和相對分子質(zhì)量 序號 中文名稱 英文名稱 CAS號 分子式 相對分子質(zhì)量 1 恩諾沙星 Enrofloxacin 93106-60-6 C19H22FN3O3 359.4 2 諾氟沙星 Norfloxacin 70458-96-7 C16H18FN3O3 319.3 3 培氟沙星二水甲磺酸鹽 Pefloxacin mesylate 70458-95-6 C18H24FN3O6S 429.5 4 環(huán)丙沙星 Ciprofloxacin 85721-33-1 C17H18FN3O3 331.3 5 洛美沙星 Lomefloxacin 98079-51-7 C17H20ClF2N3O3 387.8 6 氧氟沙星 Ofloxacin 82419-36-1 C18H20FN3O4 361.4 7 鹽酸沙拉沙星 Sarafloxacin Hydrochloride 91296-87-6 C20H18ClF2N3O3 421.8 8 甲磺酸達氟沙星 Danofloxacin Mesylate 119478-55-6 C20H24FN3O6S 453.5 9 甲硝唑 metronidazole 443-48-1 C6H9N3O3 171.2 10 二甲硝咪唑 Dimetridazol 551-92-8 C5H7N3O2 141.1 11 異丙硝唑 Ipronidazole 14885-29-1 C7H11N3O2 169.2 12 洛硝噠唑 Ronidazole .7681-76-7 C6H8N4O4 200.1 B B 附　錄　B （資料性附錄） 氟喹諾酮類及硝基咪唑類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液選擇離子流圖(20 μg/kg) 表B.1氟喹諾酮類及硝基咪唑類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液選擇離子流圖(20 μg/kg) a) 甲硝唑 b）二甲硝咪唑 c)異丙硝唑 d）洛硝噠唑 e）諾氟沙星 f）氧氟沙星 g）培氟沙星 h）環(huán)丙沙星 i）洛美沙星 j）沙拉沙星 k）達氟沙星 l）恩諾沙星 _________________________________