《儀器分析》第十四章分子發(fā)光光譜法.ppt

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1、分子發(fā)光光譜法 基本要求： 1. 理解分子熒光和分子磷光的基本原理 2. 理解分子熒光激發(fā)光譜、發(fā)射光譜、同步光譜 和三維熒光光譜的含義 3. 掌握分子熒光發(fā)射光譜的特性 4. 了解熒光光譜儀的組成和各部分作用 5. 掌握熒光分析法和磷光分析法的主要應(yīng)用范圍 6. 了解化學(xué)發(fā)光分析法的原理和應(yīng)用 分子發(fā)光光譜法包括： 光致發(fā)光 分子熒光 分子磷光 化學(xué)發(fā)光 生物發(fā)光 靈敏度較紫外 -可見吸收光譜法 高幾個(gè) 數(shù)量級(jí)。 1 熒光和磷光的基本機(jī)理 分子熒光與磷光的產(chǎn)生： 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 S1 0 1 2 4 0 1 2 3 S0 S2 T1 T2 內(nèi)轉(zhuǎn)換 外轉(zhuǎn)換 振動(dòng)馳豫

2、 系 間 跨 越 1 2 3 4 吸收 吸收 熒光 磷光 對(duì)于大多數(shù)有機(jī)物分子 ， 其電子數(shù)為偶數(shù) ， 凈自 旋之和為 S 0， 即基態(tài)分子為單重態(tài) （ M 2S+1=1） 。 分子處于激發(fā)態(tài)時(shí) ， 某個(gè)電子可能會(huì)改變自旋方 向 ， 即自旋平行 ， 此時(shí) S 1/2+1/2=1， 分子處于這樣 的激發(fā)態(tài)為三重態(tài) ， 以 T表示 。 由于自旋平行比自旋 配對(duì)的狀態(tài)更穩(wěn)定 ， 因此三重態(tài)能級(jí)比單重態(tài)略低 。 根據(jù)光譜選律 ， 分子直接被激發(fā)到三重態(tài) T1的概 率比較小 ， 因?yàn)槭?S0 T1禁阻躍遷 。 分子的去激發(fā)過程 速率最快 ， 激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢(shì) 。 振動(dòng)馳豫 受激溶質(zhì)分子向溶劑分

3、子轉(zhuǎn)移過剩 的能量 ， 以 10-13s10-11s的極快速度 熒光發(fā)射 以 10-9s10-7s左右的短時(shí)間內(nèi)發(fā)射光 量子回到基態(tài)的各振動(dòng)能級(jí) 內(nèi)部轉(zhuǎn)換 激發(fā)能轉(zhuǎn)化為熱能 。 其速度取決于 此過程所包含的兩個(gè)能態(tài)之間的相對(duì)能量差 。 當(dāng)兩個(gè)電子能級(jí)非常靠近 ， 以至其振動(dòng)能級(jí)有 重疊時(shí) ， 內(nèi)部轉(zhuǎn)換十分容易發(fā)生 。 如兩個(gè)單重 激發(fā)態(tài)或兩個(gè)三重激發(fā)態(tài)的較低激發(fā)態(tài)的高振 動(dòng)能級(jí)常常與較高激發(fā)態(tài)的低振動(dòng)能級(jí)重疊 ， 重疊的地方兩激發(fā)態(tài)能量一致 ， 內(nèi)部轉(zhuǎn)換效率 很高 ， 速率很快 ， 一般只需要 10-13s10-11s的時(shí) 間 。 外轉(zhuǎn)換 激發(fā)態(tài)分子與溶劑和其它溶質(zhì)分子之 間的相互作用即能量轉(zhuǎn)

4、換過程 。 它是熒光和磷 光的競(jìng)爭(zhēng)過程 ， 因此該過程使發(fā)光強(qiáng)度減弱甚 至消失 ， 這種現(xiàn)象稱為 “ 淬滅 ” 或 “ 熄滅 ” 。 體系間跨越躍遷 受激分子從激發(fā)單重態(tài)轉(zhuǎn)至 能量較低的激發(fā)三重態(tài) 。 這一過程中分子的電 子自旋倒轉(zhuǎn) ， 多重性發(fā)生變化 。 與內(nèi)部轉(zhuǎn)換一 樣 ， 如果兩能態(tài)的振動(dòng)能級(jí)重疊 ， 這種躍遷的 概率增大 。 磷光發(fā)射 經(jīng)過系間跨越后到達(dá)激發(fā)三重態(tài) ， 并經(jīng)過迅速的振動(dòng)馳豫到達(dá)第一激發(fā)三重態(tài) （ T1） 的最低振動(dòng)能級(jí)上 ， 從 T1態(tài)分子經(jīng)發(fā)射光返回基 態(tài)稱為磷光發(fā)射 。 磷光發(fā)射屬于不同多重態(tài)之 間的躍遷 （ T1 S0 ） ， 是 “ 禁阻 ” 躍遷 ， 因此 磷

5、光的壽命比熒光長(zhǎng)得多 ， 約為 10-3s10s。 由于分子結(jié)構(gòu)和所處環(huán)境不同 ， 各去激發(fā)過 程的速率不同 。 如熒光發(fā)射過程較其它過程快 ， 則可觀察到熒光現(xiàn)象 。 熒光的量子效率 發(fā)熒光的分子數(shù)與總的激發(fā)態(tài)分子數(shù)之比 吸收的光子數(shù) 發(fā)射的光子數(shù) if f KK K Kf熒光發(fā)射過程速率常數(shù) ， 主要取決于 分子結(jié)構(gòu) ； Ki系間跨越 、 外轉(zhuǎn)換等其他無(wú)輻射躍遷的速率常 數(shù)的總和 ， 主要取決于 環(huán)境 。 熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜 熒光激發(fā)光譜 固定發(fā)射波長(zhǎng) ， 掃描激發(fā)波長(zhǎng)得到 的熒光強(qiáng)度激發(fā)波長(zhǎng)的關(guān)系曲線 ， 反映了在某一 固定發(fā)射波長(zhǎng)下 ， 不同激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)的熒光的相對(duì) 效率 。 激發(fā)

6、光譜用于進(jìn)行熒光測(cè)定時(shí)選擇恰當(dāng)?shù)募?發(fā)波長(zhǎng) 。 熒光發(fā)射光譜 固定激發(fā)波長(zhǎng) ， 掃描發(fā)射波長(zhǎng)得到 的熒光強(qiáng)度發(fā)射波長(zhǎng)的關(guān)系曲線 ， 反映了在某一 固定激發(fā)波長(zhǎng)下 ， 不同波長(zhǎng)處分子的相對(duì)發(fā)射強(qiáng)度 。 熒光光譜用于進(jìn)行熒光測(cè)定時(shí)選擇恰當(dāng)?shù)臏y(cè)定波長(zhǎng) 或?yàn)V光片 。 同步熒光光譜 同時(shí)掃描激發(fā)和發(fā)射單色器波長(zhǎng)的 條件下 ， 測(cè)繪光譜圖 ， 所得熒光強(qiáng)度 -激發(fā)波長(zhǎng) （ 或 發(fā)射波長(zhǎng) ） 曲線為同步熒光光譜 。 固定波長(zhǎng)同步掃描熒光法： = em -ex不變 固定能量同步掃描熒光法： = (1/ex -1/em)不變 可變波長(zhǎng)同步掃描熒光法：兩個(gè)單色器以不同的速率掃描 特點(diǎn)： 光譜簡(jiǎn)化 ， 譜帶窄化 ，

7、 減小光譜重疊 ， 減小 散射光的影響 ， 選擇性提高 ， 但損失其他光譜帶含 有的信息 并四苯的激 發(fā)光譜和發(fā) 射光譜 （ a） 同步熒光光 譜 =3nm （ b） 三維熒光光譜 20世紀(jì) 80年代發(fā)展起來 ， 以熒光強(qiáng) 度為激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)的函數(shù)得到的光譜圖 ， 也 稱為總發(fā)光光譜 ， 等高線光譜等 。 三維曲線光譜圖 平面顯示的等強(qiáng)度線光譜圖 特點(diǎn)： 提高完整的光譜信息 ， 可作為光譜指紋技術(shù) 用于環(huán)境檢測(cè)和法庭試樣的判證 。 （ a）蒽和萘的三維熒光光譜圖 （ b） 8-羥基苯芘的等強(qiáng)度光譜圖 熒光光譜的特征 斯托克斯 （ Stokes） 位移： 在溶液中 ， 熒光發(fā)射波長(zhǎng)總 是比其

8、相應(yīng)的吸收 （ 激發(fā) ） 光譜的波長(zhǎng)長(zhǎng) ， 該現(xiàn)象是 1852年 由 Stokes發(fā)現(xiàn) ， 因此稱為 Stokes位移 。 這種位移反映了熒光 激發(fā)與發(fā)射間產(chǎn)生的能量損失 （ 來源于振動(dòng)馳豫和溶劑的分 子的馳豫作用 ） 。 鏡像對(duì)稱規(guī)則： 吸收光譜形狀表明了第一激發(fā)態(tài)的振動(dòng)能 級(jí)結(jié)構(gòu) ， 熒光光譜形狀取決于基態(tài)中各振動(dòng)能級(jí)的分布情況 。 一般基態(tài)中振動(dòng)能級(jí)與第一激發(fā)態(tài)振動(dòng)能級(jí)分布是類似的 ， 因此熒光光譜的形狀和吸收光譜極為相似 。 苝 的苯溶液的熒光光譜和吸收光譜 熒光光譜的特征 熒光發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)的選擇無(wú)關(guān)： 熒光物質(zhì)發(fā)射熒光的特性之一是不管引起物質(zhì)分子激發(fā) 的波長(zhǎng)是 1還是 2

9、， 熒光的波長(zhǎng)都是 3。 這是由于熒光分子無(wú)論被激發(fā)到哪一個(gè)激發(fā)態(tài) ， 處于激 發(fā)態(tài)的分子經(jīng)振動(dòng)馳豫即內(nèi)轉(zhuǎn)換等過程最終回到第一激發(fā)態(tài) 的最低振動(dòng)能級(jí)上 ， 而分子熒光的發(fā)射總是從該能級(jí)躍遷到 基態(tài)的各振動(dòng)能級(jí)上 ， 因此其形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān) 。 反映在光譜圖上就是具有一個(gè)吸收帶和兩個(gè)吸收帶的不 同物質(zhì) ， 一般都發(fā)射一個(gè)熒光譜帶 （ 個(gè)別例外 ） 。 分子結(jié)構(gòu) 躍遷類型 ： * 量子效率高 ， 因?yàn)檐S遷摩爾吸光系數(shù) 大 100-1000倍 ， 躍遷壽命短 （ 10-710-9s） ， n *（ 10- 710-9s） ， 其次 ， 系間跨越速率常數(shù)小 共軛效應(yīng) ：稠環(huán)化合物一般發(fā)強(qiáng)熒光 取代基

10、效應(yīng) ：給電子基團(tuán) （ -NH2, -OH, -OCH3, - NHCH3, -N(CH3)2等 ） 熒光增強(qiáng) ， 吸電子基團(tuán) （ -Cl, -Br, - I, -NHCOCH3, -NO2, -COOH等 ） 熒光減弱 結(jié)構(gòu)剛性效應(yīng) ：平面剛性結(jié)構(gòu)有利于熒光發(fā)射 , 熒光物 質(zhì)吸附于固體表面可熒光增強(qiáng) 影響熒光強(qiáng)度的因素 C OH HO O C O C OH HO O C O O 酚酞，無(wú)熒光 熒光素，強(qiáng)熒光 氧橋鍵具有剛性平面結(jié)構(gòu) 單鍵易旋 轉(zhuǎn) ， 非剛 性平面結(jié) 構(gòu) 環(huán)境因素 溶劑 ：介電常數(shù) 、 折射率 、 氫鍵 ， 極性增加 ， * 躍遷能量減小 ， 熒光紅移 溫度 ：溫度高 ， 碰

11、撞頻率增加 ， 熒光效率下降 pH：酸性或堿性熒光物質(zhì)影響大 熒光猝滅 ：與溶劑或其他分子作用 ， 熒光減弱稱為猝 滅；引起熒光強(qiáng)度減弱的試劑稱為猝滅劑 。 動(dòng)態(tài)猝滅 （ 碰撞 ） 靜態(tài)猝滅 （ 形成不發(fā)熒光化合物 ） 內(nèi)濾作用 ：溶液中存在吸收激發(fā)光或發(fā)射光的物質(zhì) ， 導(dǎo)致熒光減弱 ， 稱為內(nèi)濾 （ 自吸是一種內(nèi)濾 ） 影響熒光強(qiáng)度的因素 2-苯胺 -6-萘磺酸的熒光發(fā)射光譜 A 乙腈 B 乙二醇 C 30%乙醇 -水 D 水 8羥基喹啉在不同溶劑中的熒光表現(xiàn) 溶劑 介電常數(shù) 熒光峰 /nm 熒光效率 四氯化碳 2.24 390 0.002 氯仿 5.2 398 0.041 丙酮 21.5

12、405 0.055 乙腈 38.8 410 0.064 但是也有相反的情況 ， 例如 苯胺萘磺酸 一類的化合物在 戊醇 、 丁醇 、 丙醇 、 乙醇和甲醇五種不同的醇溶液中 ， 隨著溶劑極性增大 ， 熒光效率減小 。 由此可見 ， 熒光峰的位臵和強(qiáng)度與溶劑的關(guān)系 ， 規(guī) 律性不強(qiáng) ， 必須具體分子具體分析 。 熒 光 強(qiáng) 度 -168C -150C -78C 24C 菲繞啉在聯(lián)二苯中不同溫度時(shí)的熒光光譜 較高的溫度 下 ， 熱運(yùn)動(dòng) 加快 ， 溶質(zhì) 分子與溶劑 分子之間的 碰撞機(jī)會(huì)增 大 ， 熒光效 率下降 。 NH3+ NH2 NH- pH 13 無(wú)熒光 藍(lán)色熒光 無(wú)熒光 金屬離子與有機(jī)試劑形

13、成的熒光配合物 ， 受 pH 的影響更大 。 一方面影響配合物的穩(wěn)定性 ， 一方面 影響配合物的組成 。 例如 ， 鎵離子與鄰二羥基偶氮苯在 pH3 4溶液中形成 1： 1配合物 ， 發(fā)熒光 。 在 pH6 7溶液中則形成 1： 2配合物 ， 不 發(fā)熒光 （ 1： 2 型平面結(jié)構(gòu)不存在 ） 。 散射光和拉曼光對(duì)熒光分析的影響 a) 溶劑的瑞利散射光 b) 容器表面的散射光 c) 膠粒的散射光 d) 溶劑的拉曼光 瑞利散射光 溶劑分子吸收了頻率較低的光線后，不足以 使分子中的電子躍遷到激發(fā)態(tài)，而只是上升到基態(tài)中較高的 振動(dòng)能級(jí)，并在極短的時(shí)間內(nèi)返回原能級(jí)，釋放與原激發(fā)光 波長(zhǎng)相同的光線，稱為瑞利

14、散射光。 沒有能量損失，而且在 所有波長(zhǎng)發(fā)生，波長(zhǎng)越短，瑞利散射光強(qiáng)度越大。 拉曼散射光 和瑞利散射有關(guān)的另一種形式的散射光。它 是由分子吸收了頻率較低的光上升到基態(tài)中較高的振動(dòng)能級(jí) 后，返回到稍高于或稍低于原來的能級(jí)時(shí)發(fā)射的光，其波長(zhǎng) 較激發(fā)光波長(zhǎng)稍長(zhǎng)或者稍短。一般說來，拉曼散射光比瑞利 散射光弱。 320 360 450 640 720 （ nm） 熒 光 強(qiáng) 度 硫酸奎寧水溶液 在 320nm光激發(fā) 下熒光光譜中的 各類型散射峰 除了熒光峰之外 ， 都會(huì)在空白試驗(yàn)中出現(xiàn) 。 因此 ， 當(dāng)熒光物 質(zhì)的熒光峰與激發(fā)光波長(zhǎng)靠近甚至重疊時(shí) ， 散射光會(huì)嚴(yán)重影 響方法的靈敏度 ， 應(yīng)設(shè)法減小或消除

15、此影響 。 在測(cè)定前 ， 先 測(cè)空白溶液的發(fā)射光譜 ， 然后選擇合適的激發(fā)波長(zhǎng) 。 溶劑的 散射光隨激發(fā)波長(zhǎng)變化而變化 ， 而熒光峰與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān) ， 這樣通過改變激發(fā)波長(zhǎng)即可消除散射的影響 。 320nm是一級(jí)瑞利散射光， 640nm是二級(jí)瑞利散射光， 450nm為熒光峰， 360nm 為水的一級(jí)拉曼光， 720nm 為水的二級(jí)拉曼光。 2 分子熒光光譜儀 光源 入射狹縫 激發(fā) 單色器 出射狹縫 樣品池 發(fā)射 單色器 入射狹縫 出射狹縫 信號(hào)輸 出裝置 檢測(cè)器 放大器 光源 氙燈和高壓汞燈、激光器 單色器 激發(fā)單色器和發(fā)射單色器 樣品池 四面透光的方形石英池 檢測(cè)器 光電倍增管、電荷偶合元件

16、檢測(cè)器可 一次獲得熒光二維光譜 3 分子熒光光譜的應(yīng)用 靈敏度高 ， 檢測(cè)下限低 0.10.001g/cm3， 熒光分 析法的應(yīng)用廣泛 ， 可測(cè)定 60余種元素 ， 尤其是生物 大分子的檢測(cè) ， 還可以作為高效液相色譜及毛細(xì)管 電泳的檢測(cè)器 。 定量分析： F Ia Ia I0 It I0（ 1 10-bc） I0 （ 1 e-2.303bc） !4 )2.303( !3 )2.303( !2 2.303 12.303 !4 )2.303( !3 )2.303( !2 )2.303( 2.3031 32 432 2 . 3 0 3- bcbcbc bc bcbcbc bce bc 對(duì)于很稀的溶

17、液 ， 即 bc 0.05， 此時(shí)上面的式 子中第二項(xiàng)以后的各項(xiàng)可以忽略不計(jì) ， 即 1 e-2.303bc 2.303bc If Ia I0 2.303bc 因此 ， 當(dāng)激發(fā)光強(qiáng)度一定 ， 并且溶液濃度較小時(shí) ， 熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)濃度之間成正比： If Kc 對(duì)于較濃的溶液 ， 其吸光度大于 0.05時(shí) ， 熒光強(qiáng)度 與濃度的線性關(guān)系將出現(xiàn)偏離 。 單組分直接測(cè)定 單組分間接測(cè)定 化學(xué)反應(yīng)轉(zhuǎn)化為熒光分子 熒光猝滅法 多組分的熒光測(cè)定 熒光峰不重疊 ， 選不同的發(fā)射波長(zhǎng)；激發(fā)光譜 明顯不同 ， 熒光峰重疊 ， 可選用不同的激發(fā)波長(zhǎng) 無(wú)機(jī)物分析 ： 無(wú)機(jī)陽(yáng)離子本身不發(fā)熒光 ， 可與一些有 機(jī)試

18、劑形成熒光配合物 ， 可以測(cè)定的元素已達(dá) 60多種 溶液?jiǎn)畏肿有袨檠芯?： 羅丹明 6G標(biāo)記 DNA 基因研究與檢測(cè) ： DNA與小分子的相互作用等 生物化學(xué)和生理醫(yī)學(xué) ： 能測(cè)定微量氨基酸和蛋白質(zhì) ， 還能研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu) ， 酶以及酶動(dòng)力學(xué)和機(jī)理 ， 細(xì)胞新 陳代謝等 藥物分析 ： 分析低濃度的藥物 ， 6巰基嘌呤是急性白 血病的重要藥劑 ， 相關(guān)分析方法還較少 。 用高錳酸鉀將 6 巰基嘌呤氧化形成嘌呤 6磺酸鹽 ， 即可用熒光法進(jìn)行測(cè) 定 4 磷光光譜法 激發(fā)單重態(tài)與激發(fā)三重態(tài)振動(dòng)能級(jí)重疊時(shí) ， 發(fā)生 系間跨越 ， 從激發(fā)單重態(tài)轉(zhuǎn)到能量較低的三重態(tài) ， 迅速振動(dòng)馳豫到三重態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)

19、 ， 在 10-4秒 至幾秒內(nèi)發(fā)射磷光回到基態(tài) 。 磷光和熒光都是光致發(fā)光 ， 同樣具有兩個(gè)特征光 譜 ， 即磷光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜 。 當(dāng)激發(fā)光強(qiáng)度一定和被測(cè)物質(zhì)濃度很低時(shí) ， 發(fā)射 的磷光強(qiáng)度與濃度成正比 。 三重態(tài)與基態(tài)間的能量差小 ， 振動(dòng)耦合強(qiáng) ， 增強(qiáng) 了內(nèi)部轉(zhuǎn)換 ， 非輻射躍遷的競(jìng)爭(zhēng)大 。 激發(fā)三重態(tài)的壽命長(zhǎng) ， 同溶劑分子或其它溶質(zhì)分 子碰撞概率大 ， 在室溫下很少觀察到磷光現(xiàn)象 。 將溫度降低至液氮溫度 （ 77K） ， 許多介質(zhì)均形 成剛性玻璃體 ， 碰撞和振動(dòng)耦合降至最低限度 ， 幾乎所有三重態(tài)得激發(fā)分子都會(huì)發(fā)出磷光 。 室溫磷光：試樣固定在固體基體上 、 溶解在膠束 溶

20、液或環(huán)糊精溶液中 ， 增強(qiáng)剛性 ， 減少碰撞猝滅 試樣管 盛液氮的杜瓦瓶 至發(fā)射單色器 來自激發(fā) 單色器 磷光分析儀 測(cè)定磷光的儀器與熒光儀器基本相同 。 但為了在低溫 下測(cè)定 ， 樣品試液的石英管必須放在盛液氮的杜瓦瓶中 。 因?yàn)榘l(fā)磷光的物 質(zhì)常常發(fā)熒光， 為了將二者分開， 需一個(gè)附加的機(jī) 械切光器，構(gòu)成 磷光計(jì)。 磷光分子常用溶劑為按 5： 5： 2比例混合的二乙 醚：異戊烷：乙醇的化合物 ， 稱為 EPA混合溶劑 ， 在液氮溫度時(shí) ， 成為透明的剛性玻璃體 。 主要用于環(huán)境分析 、 藥物研究等 。 例如血清或血漿 中乙酰水楊酸 （ 阿司匹林 ） 、 血清中普魯卡因 、 苯巴比 妥等的測(cè)定

21、 。 磷光分析對(duì)于室溫下不發(fā)熒光或者熒光很弱 ， 低 溫下發(fā)磷光的十分有效 。 熒光光譜重疊的兩組分 ， 采用磷光分析有可能取 得滿意的結(jié)果 。 例如吲哚和色氨酸的熒光光譜幾 乎相同 ， 但在低溫下磷光光譜易于區(qū)分 。 5 化學(xué)發(fā)光分析法 化學(xué)反應(yīng)釋放的能量激發(fā)了體系中某種化學(xué)物 質(zhì)分子 ， 躍遷回基態(tài)產(chǎn)生的光發(fā)射 。 當(dāng)化學(xué)發(fā)光發(fā) 生于生物體系時(shí) ， 稱為生物發(fā)光 。 1) 提供足夠的能量 。 通常是那些速度很快的放能 反應(yīng) ， 其焓變 H介于 150 400KJ/mol之間 ， 多 為氧化還原反應(yīng) 。 2)反應(yīng)歷程有利 ， 激發(fā)生成大量的激發(fā)態(tài)分子 。 3)發(fā)光效率高 。 化學(xué)激發(fā)效率 發(fā)

22、射效率 化學(xué)發(fā)光的效率 化學(xué)發(fā)光的發(fā)光效率 CL又稱為化學(xué)發(fā)光的總 量子產(chǎn)率： CL發(fā)光分子數(shù) /參加反應(yīng)的分子數(shù) CE EM CE為化學(xué)激發(fā)效率 ， EM為激發(fā)態(tài)分子的發(fā)光效 率 。 化學(xué)反應(yīng)的發(fā)光效率 、 光輻射的能量大小以及 光譜范圍 ， 完全由參加反應(yīng)的物質(zhì)的化學(xué)反應(yīng)決定 ， 每一個(gè)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)都有其特征的發(fā)光光譜和發(fā)光 效率 。 一般 CL都小于 0.01。 發(fā)光強(qiáng)度與反應(yīng)物濃度的關(guān)系 化學(xué)發(fā)光的發(fā)光強(qiáng)度 ICL與化學(xué)發(fā)光效率 CL和 反應(yīng)物濃度之間具有如下關(guān)系： 測(cè)量任一時(shí)間的發(fā)光強(qiáng)度就能確定此時(shí)反應(yīng)物的濃 度 。 將上式積分 ， 得 化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度積分與反應(yīng)物濃度成正比 ， 因此可

23、以根據(jù)已知時(shí)間內(nèi)發(fā) 光總量實(shí)現(xiàn)反應(yīng)物的定量 。 dt tdctI CLCL )()( c dt tdctI CLCLCL )()( 化學(xué)發(fā)光反應(yīng)類型 直接化學(xué)發(fā)光 被測(cè)物參加反應(yīng) ， 產(chǎn)物發(fā)光 A+B C*+D C* C+hv 間接化學(xué)發(fā)光 被測(cè)物參加反應(yīng) ， 產(chǎn)物能量 傳給其他分子 ， 其他分子發(fā)光 A+B C*+D C*+F C+F* F* F+hv 測(cè)空氣中臭氧 沒食子酸 +O3 A*+O2 A*+羅丹明 B 羅丹明 B*+A 羅丹明 B* 羅丹明 B +hv 氣相化學(xué)發(fā)光反應(yīng) 臭氧與乙烯反應(yīng)生成激發(fā)態(tài)的甲醛而發(fā)光： CH2 CH2 O3 HCHO* HCOOH 此反應(yīng)發(fā)射光譜在 300

24、 600nm， 最大發(fā)射波長(zhǎng) 435nm。 臭氧與一氧化氮反應(yīng)生成激發(fā)態(tài)的二氧化氮： NO O3 NO2* O2 此反應(yīng)發(fā)射光譜在 600 875nm。 同樣 SO2、 CO 等也與原子氧反應(yīng)發(fā)光 ， 主要用于大氣污染監(jiān)測(cè) 。 液相化學(xué)發(fā)光反應(yīng) 主要有魯米諾 （ 3-氨基苯二甲酰肼 ） 、 光澤精 （ N,N- 甲基二吖啶硝酸鹽 ） ， 洛粉堿 （ 2,4,5-三苯基咪唑 ） 等 。 NH NH O NH2 O O O O NH2 O * H2O2 OH- 魯米諾 ， 發(fā)光效率 0.01-0.05， 最低發(fā)射波長(zhǎng) 425nm。 N N O NH2 O H2O2 OH- N N O NH2 O

25、N2 + O O 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀器 化學(xué)發(fā)光分析的檢測(cè)儀器很簡(jiǎn)單 。 樣品池 光檢測(cè)器 放大器 信號(hào)輸出裝置 高壓穩(wěn) 壓電源 化學(xué)發(fā)光反應(yīng)速度很快 ， 因此樣品和反應(yīng)劑的混 合與測(cè)定均在光電倍增管的窗口前進(jìn)行 。 利用注射器等將反應(yīng)劑和樣品以相同的方式加入 樣品池 ， 靠攪動(dòng)或注射時(shí)的沖力混合 ， 靜態(tài)下測(cè) 定化學(xué)發(fā)光信號(hào) ， 根據(jù)峰面積或峰高進(jìn)行定量分 析 。 樣品與反應(yīng)劑的混合 、 反應(yīng)以及檢測(cè)過程都在流 動(dòng)下進(jìn)行 ， 其發(fā)光強(qiáng)度不能從頭到尾檢測(cè) ， 只能 獲得其動(dòng)力學(xué)曲線的一部分 ， 利用峰高來定量 ， 可進(jìn)行連續(xù)測(cè)定 。 化學(xué)發(fā)光分析的特點(diǎn) 靈敏度高 ， 特別是對(duì)于一些氣體及痕量金屬離

26、子 的測(cè)定 ， 檢出限可達(dá) 10-9級(jí) ， 個(gè)別達(dá) 10-12級(jí) 。 設(shè)備簡(jiǎn)單 ， 操作方便 ， 迅速 ， 能進(jìn)行連續(xù)分析 。 化學(xué)發(fā)光分析的應(yīng)用： 環(huán)境監(jiān)測(cè)： 毒氣臭氧 、 氮氧化物 、 一氧化碳 、 二氧化硫 、 硫化氫的檢測(cè)可達(dá) 10-9， 利用金屬離子催化魯米諾等體系 的化學(xué)發(fā)光可檢測(cè)天然水和廢水中的金屬離子 指示容量滴定的終點(diǎn)： 魯米諾在過氧化氫和催化劑如 Cu2+存在下 ， 在 pH8.0-8.5溶液中發(fā)光 ， 可用作酸堿滴定 的發(fā)光指示劑 ， 特別適合于混濁液和深色溶液中進(jìn)行的酸 堿滴定 。 化學(xué)發(fā)光分析的應(yīng)用： 醫(yī)學(xué) 、 生物學(xué)和生物化學(xué)領(lǐng)域： 白細(xì)胞受外來刺激 ， 新陳代謝加

27、速 ， 產(chǎn)生代謝中間產(chǎn)物而發(fā)光 ， 可測(cè)知血清的 調(diào)理功能和白細(xì)胞的氧化代謝功能 ， 臨床上用于某些免疫 缺陷疾病的診斷 。 發(fā)光免疫分析 ： 在一定 pH， 發(fā)光物質(zhì) 、 催化劑 、 氧化 劑三者的濃度處在最佳比例時(shí) ， 發(fā)光強(qiáng)度最大 。 利用三種 組分之一標(biāo)記抗原或抗體 ， 免疫復(fù)合物中即含有此種潛在 發(fā)光成分 。 當(dāng)加入另兩種成分后 ， 立即發(fā)光 ， 既具有化學(xué) 發(fā)光的快速 、 靈敏的特點(diǎn) ， 又有免疫反應(yīng)高選擇性的特點(diǎn) 。 例題解答： 1g谷物 ， 酸處理分離出維生素 B2及少量無(wú)關(guān)雜質(zhì) 。 加入少量 高錳酸鉀氧化維生素 B2， 過量高錳酸鉀用過氧化氫除去 ， 轉(zhuǎn) 移溶液至 50mL容

28、量瓶 ， 稀釋至刻度 。 取 25mL放入樣品池測(cè) 定熒光強(qiáng)度 。 熒光計(jì)先用硫酸奎寧將讀數(shù)調(diào)節(jié)為 100。 測(cè)定 試樣讀數(shù) 6格 。 用少量固體亞硫酸鈉加入樣品池將氧化的維 生素 B2還原 ， 熒光計(jì)讀數(shù) 55。 倒掉溶液 ， 在同一樣品池重新 注入 24mL被氧化的維生素 B2溶液 ， 以及 1mL維生素 B2標(biāo)準(zhǔn)溶 液 （ 0.500g/mL） ， 再加入少量亞硫酸鈉 ， 讀數(shù) 92， 計(jì)算 每克谷物中含有維生素 B2多少微克 。 解： 首先判斷是誰(shuí)發(fā)熒光 ？ 維生素 B2還是氧化后的維生素 B2。 從題目中可知 ， 還原后讀數(shù)變大 ， 顯然是維生素 B2本身發(fā)熒 光 。 其次 ， 為什

29、么要測(cè)定氧化后的維生素 B2試液的熒光值 ？ 因?yàn)楣任镏蟹蛛x出后 ， 還有其它雜質(zhì)一起分離出來了 。 這些 雜質(zhì)是否發(fā)熒光 ， 不得而知 ， 因此測(cè)一下 ， 消除基體空白的 影響 。 從題目中可知 ， 試液中含有能發(fā)熒光的雜質(zhì) ， 因此在 后面的計(jì)算中必須扣除 。 綜上所述 ， 可計(jì)算如下： 設(shè)谷物 1g中含有 yg維生素 B2， 根據(jù)熒光強(qiáng)度與濃度成正比 的關(guān)系有：假設(shè)比例系數(shù)為 K K y 25/50 55 6 49 K （ y 24/50 0.5） 92 6 24/25 86.24 第二式子比上第一式子后得到： 0.5/(y 24/50)（ 86.24-49） /49 = 37.24/49 y = 0.5 49 50/37.24/24 = 1.37 (g)