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1、第八章 發(fā)酵工程下游加工工程 (downstream processing) 第一節(jié) 概 述 一 . 重要性 1. 產品分離純化是最終獲得商業(yè)產品的環(huán)節(jié) 2. 發(fā)酵液是復雜的多相系統(tǒng) 2. 生物產物的特殊特點：濃度、穩(wěn)定性等 幾種產品在發(fā)酵液中的濃度 產品 典型濃度（ g/L） 抗生素 25 氨基酸 100 酒精 100 有機酸 100 酶 20 蛋白質 10 4. 投資費用高 抗生素、乙醇、檸檬酸占 60% 純化蛋白質 8090% 5. 分離純化技術落后會阻礙發(fā)酵工程技術的 發(fā)展 5. 上游要為下游創(chuàng)造條件 選育不產生雜質的菌種 胞內產物變?yōu)榘猱a物 在細胞內形成包含體 給目的產物接上特殊“
2、物質” 二 . 基本原理 根據混合物中不同組分分配率的差異將其 分配于幾個物相中，如溶劑提取、鹽析、 結晶等 或將混合物置于某一物相中（液相），使 各組分分配于不同區(qū)域，如電泳、超離心、 超濾等 三 . 一般程序 1. 預處理和固液分離：加速固液相分離 2. 細胞破碎分離胞內產物 3. 初步純化（提?。撼ヅc目的產物性 質差異很大的雜質 4. 高度純化（精致）：除去與產物性質相 似的雜質 5. 產品加工 第二節(jié) 發(fā)酵液的預處理和固液分離 一 . 預處理 分離菌體和其它懸浮顆粒 去除部分可溶性雜質 改變?yōu)V液的性質 （一）過濾特性的改變 產物濃度低 110% 懸浮顆粒小 液相粘度大 性質不穩(wěn)定
3、1. 降低液體粘度 稀釋 升高溫度 2. 調節(jié) pH 改變某些物質電荷特性 3. 凝聚與絮凝 改變細胞、細胞碎片及溶解大分子物質 的分散狀態(tài) 4. 加入助濾劑 不可壓縮的多孔顆粒 硅藻土、纖維素、石棉粉、珍珠粉、白土、 炭粒、淀粉等 5. 加入反應劑 消除雜質對過濾的影響 新霉素發(fā)酵液中加入氯化鈣和磷酸鈉 磷酸鈣：助濾劑，使某些蛋白質凝固 （二）去除高價無機離子 1. Ca2+、 Mg2+、 Fe2+等影響樹脂的交換容量 2. 用草酸去除鈣離子，草酸鈣還能促進蛋 白質凝固 3. 三聚磷酸鈉與鎂形成可溶性絡合物 Na5P3O10+Mg2+ =MgNa3P3O10+2Na+ 4. 黃血鹽與鐵離子形
4、成普魯土鹽沉淀 3K4Fe(CN)6+4Fe3+=Fe4Fe(CN)63+12K+ （三）去除可溶性雜蛋白 1. 蛋白質等電點沉淀 兩性物質，穩(wěn)定性與所帶電荷有關 酸性溶液中帶正電荷，堿性中帶負電荷 2. 酸性溶液中與陰離子物質結合形成沉淀 三氯醋酸鹽、水楊酸鹽、鎢酸鹽、苦味 酸鹽、鞣酸鹽、過氯酸鹽等 3. 堿性溶液中與陽離子形成沉淀 Ag+、 Cu2+、 Zn2+、 Fe3+、 Pb2+等 4. 鹽析 親水膠體，加入堿金屬中性鹽，脫水劑 5. 熱變性 一般蛋白質在 7080C發(fā)生不可逆變性 如鏈霉素發(fā)酵液在 pH3.0，加熱到 70 C保 持 0.5h后過濾 檸檬酸發(fā)酵液在 80 C處理 6
5、. 加入絮凝劑 7. 吸附作用 （三）去除色素及其它物質 1. 色素產生 微生物生長代謝產生，培養(yǎng)基帶來 2. 去除方法 離子交換劑、離子交換纖維、活性炭等吸附 如 DEAE-纖維素從含酶溶劑中吸附色素物質 時，可同時去除非活性蛋白質 二 . 發(fā)酵液固液分離 （一）離心 （二）過濾 菌種對過濾速度影響很大 真菌容易過濾，放線菌則難 培養(yǎng)基組成對過濾也有影響 第三節(jié) 微生物細胞破碎 一 . 微生物細胞壁的組成與結構 微生物種類，培養(yǎng)基組成影響細胞壁 二 . 常用細胞破碎方法 1. 珠磨法（ bead mill） 實驗室： Mickle搗碎機、勻漿器 Braun 中試：膠質膜處理 工業(yè)：高速珠磨機
6、（ High-speed bead mill） 2. 高壓勻漿法 （ High pressure homogenization） 大規(guī)模細胞破碎方法 高壓勻漿器 對于酵母等難破碎及高濃度細胞可采用多 次循環(huán)方法 絲狀真菌、較小的 G+菌，含有包含體 （ Inclusion body） 的基因工程菌不宜用此 法 3. 超聲波破碎（ Ultrasonication） 桿菌比球菌容易破碎 G-比 G+容易破碎 酵母菌不易破碎 實驗室較常用的方法，樣品溫度？ 4. 酶溶法（ Enzymatic lysis） lysozyme protease cellulase zymolyase 價格高，通用性差，產物抑制的存在 自溶法（ Autolysis） 5. 化學滲透法（ chemical permeation） 改變細胞壁或細胞膜的通透性 TritonX-100：結合、溶解磷脂，破壞膜脂 雙層 EDTA：對 G-菌外膜有破壞作用 有機溶劑：分解細胞壁中的脂類 變性劑：脲、鹽酸胍與水中氫鍵作用 優(yōu)點：選擇性，易于固液分離 缺點：通用性差，效率低，毒性 6. 其他方法 X-press法 滲透壓法（ osmotic pressure） 反復凍溶法 多種方法結合 與上游過程結合 與下游過程結合
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