細(xì)胞工程的理論基礎(chǔ)與應(yīng)用PPT課件

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細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)的分類 培養(yǎng)細(xì)胞的主要形態(tài)類型 細(xì)胞在體外可以無限增殖培養(yǎng)嗎？,1,,組織培養(yǎng)的的實(shí)質(zhì)，就是模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，即無菌、適當(dāng)?shù)臏囟取穸群鸵欢ǖ呐囵B(yǎng)條件。概括地說，組織培養(yǎng)就是建立活體的結(jié)構(gòu)成分在體外生存生長的適宜環(huán)境。,2,3,培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)分類粘附型：附著在培養(yǎng)的固相支持物表面才能生長；絕大多數(shù)細(xì)胞屬于此類型，包括 上皮細(xì)胞、成纖維 細(xì)胞、多角形細(xì)胞等 懸浮型：不必附著于固相支持物表面，可在懸浮狀態(tài)下生長；如白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞,4,Lifespan of cultured human cells,Senescence (M1),Crisis (M2),5,細(xì)胞工程的理論基礎(chǔ)與應(yīng)用,,6,一、細(xì)胞工程的概念,細(xì)胞工程（Cell Engineering)指以細(xì)胞為對象，應(yīng)用生命科學(xué)理論，借助工程學(xué)原理與技術(shù)，有目的地利用或改造生物遺傳性狀，以獲得特定的細(xì)胞、組織產(chǎn)品或新型物種的一門綜合性科學(xué)技術(shù)。,7,細(xì)胞工程一般指以動(dòng)植物為研究對象，可以是完整的細(xì)胞、組織或器官、胚胎，也可以是原生質(zhì)體、細(xì)胞核、染色體、細(xì)胞器等。細(xì)胞工程與基因工程、酶工程、微生物工程、生物化學(xué)工程、蛋白質(zhì)工程、代謝工程一起構(gòu)成了現(xiàn)代生物工程技術(shù)體系。,8,生物工程技術(shù)體系及其發(fā)展關(guān)系,9,細(xì)胞生物學(xué)是細(xì)胞工程的重要理論基礎(chǔ)，此外，遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、生物化學(xué)等也是細(xì)胞工程的理論基礎(chǔ)。,10,細(xì)胞工程與其他學(xué)科、技術(shù)的關(guān)系,11,二、細(xì)胞工程的發(fā)展歷史,細(xì)胞工程的發(fā)展經(jīng)歷了 探索期、誕生期、快速發(fā)展期,12,1665年英國物理學(xué)家Robert Hooke（胡克、虎克）發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)植物細(xì)胞，稱之為“Cell”（小室）。,細(xì)胞的發(fā)現(xiàn),13,細(xì)胞是生命的基本單位；一切動(dòng)物和植物都由細(xì)胞組成；,德國植物學(xué)家 Schleiden (施萊登，1838年)《植物發(fā)生論》德國動(dòng)物學(xué)家 Schwann(施旺，1839年)： 《關(guān)于動(dòng)植物的結(jié)構(gòu)和生長一致性 的顯微研究》,,細(xì)胞學(xué)說的誕生,Matthias Jacob Schleiden,Theodar Schwann,14,Rudolf Virchow,1855 德國人R. Virchow 提出 “一切細(xì)胞來源于已有的細(xì)胞” 的著名論斷；進(jìn)一步完善了細(xì)胞學(xué)說。,Cell Theory是19世紀(jì)的重大發(fā)現(xiàn)之一，基本內(nèi)容三條： ①有機(jī)體是由細(xì)胞構(gòu)成的； ②細(xì)胞是構(gòu)成有機(jī)體的基本單位； ③新細(xì)胞來源于已存在細(xì)胞的分裂。,15,1885年，Roux發(fā)現(xiàn)雞的神經(jīng)元在生理鹽水中可以存活，并使用“組織培養(yǎng)”一詞。1892年，Driesch利用海膽細(xì)胞胚胎分離成單細(xì)胞，通過細(xì)胞培養(yǎng)獲得了完整幼蟲。1907年，美國學(xué)者Harrison使蝌蚪神經(jīng)組織離體培養(yǎng)存活了數(shù)周，且生長出神經(jīng)纖維，開創(chuàng)了動(dòng)物組織培養(yǎng)先河。,探索期,16,1902年，德國植物學(xué)家Haberlandt提出細(xì)胞全能性學(xué)說，并嘗試進(jìn)行植物單個(gè)細(xì)胞離體培養(yǎng)。1937-1938年，Went、Gautheret、Nobercourt幾乎同時(shí)成功離體培養(yǎng)胡蘿卜組織，成為植物組織培養(yǎng)的奠基人。1958年，Steward和Reinert發(fā)現(xiàn)胡蘿卜的體細(xì)胞可分化成體細(xì)胞胚，這成為植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域的一個(gè)重大突破，同時(shí)也驗(yàn)證了細(xì)胞全能性學(xué)說。,17,1959年，美籍華人科學(xué)家張明覺首次獲得第一個(gè)體外受精動(dòng)物----試管兔。1962年，Capstick成功進(jìn)行了倉鼠腎細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)，為動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)奠定基礎(chǔ)。1958年-1965年，初步建立病毒誘導(dǎo)下的動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)。1960年，蘭花無性繁殖成功。1960-1970年，建立聚乙二醇誘導(dǎo)植物原生質(zhì)體融合技術(shù)。,誕生期,18,1972年，Carlson通過誘導(dǎo)煙草原生質(zhì)體融合，獲得世界上第一個(gè)體細(xì)胞雜種植株。1973年，農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn)，極大促進(jìn)了植物轉(zhuǎn)基因的研究，并推動(dòng)了利用轉(zhuǎn)基因植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥物、色素、食品添加劑、酶、農(nóng)藥等。,快速發(fā)展期,19,1973年，童第周成功進(jìn)行核移植，獲得種間雜種魚。1975年，Kohler和Milstein建立小鼠淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)。1977年，利用胚胎工程技術(shù)成功培育出首例試管嬰兒。1984年，Villadsen利用胚胎細(xì)胞克隆出一只綿羊，這是首次通過核移植技術(shù)克隆的哺乳動(dòng)物。1987年，Gordon獲得分泌組織纖溶酶激活因子tPA的轉(zhuǎn)基因小鼠，隨后轉(zhuǎn)基因羊、牛、豬的乳腺生物反應(yīng)器相繼成功。,20,1996年7月5日，世界上第一只克隆羊“多利”在英國蘇格蘭盧斯林研究所的試驗(yàn)基地誕生。證實(shí)高等動(dòng)物體細(xì)胞核的全能性。細(xì)胞工程歷史上的一個(gè)里程碑。,21,Breast cell,22,,,23,John B. Gurdon discovered in 1962 that the specialisation of cells is reversible. In a classic experiment, he replaced the immature cell nucleus in an egg cell of a frog with the nucleus from a mature intestinal cell. This modified egg cell developed into a normal tadpole. The DNA of the mature cell still had all the information needed to develop all cells in the frog.,24,Shinya Yamanaka discovered more than 40 years later, in 2006, how intact mature cells in mice could be reprogrammed to become immature stem cells. Surprisingly, by introducing only a few genes, he could reprogram mature cells to become pluripotent stem cells, i.e. immature cells that are able to develop into all types of cells in the body. (induced pluripotent stem cells, iPS cells),25,三、細(xì)胞工程的應(yīng)用,動(dòng)植物快速繁殖包括試管植物、人工種子、試管動(dòng)物、克隆動(dòng)物 2. 新品種培育指在細(xì)胞、細(xì)胞器、細(xì)胞核、染色體或組織水平上進(jìn)行遺傳性狀改良。包括原生質(zhì)體誘變、細(xì)胞融合、單倍體/多倍體育種、雌雄核發(fā)育、胚胎嵌（融）合等技術(shù)。,26,3. 細(xì)胞工程生物制品利用動(dòng)植物細(xì)胞、組織培養(yǎng)或轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)生物制品。,27,動(dòng)物細(xì)胞生物制藥,哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的蛋白可以經(jīng)修飾成具有活性的蛋白產(chǎn)品，明顯優(yōu)于酵母、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。倉鼠腎細(xì)胞生產(chǎn)狂犬病毒疫苗、乙腦疫苗； 幼地鼠腎（BHK21）細(xì)胞生產(chǎn)口蹄疫疫苗； 中國倉鼠卵巢（CHO）細(xì)胞生產(chǎn)乙肝疫苗； 2BS細(xì)胞和KMB17細(xì)胞生產(chǎn)甲肝疫苗； 2BS細(xì)胞和MRC5細(xì)胞生產(chǎn)水痘疫苗。,28,FDA批準(zhǔn)的動(dòng)物細(xì)胞制備藥物： 胰島素、組織纖溶酶激活劑（治療心臟?。?； 促紅細(xì)胞生成素（治療貧血）； 白介素（治療腎癌）； 凝血因子III和IV（治療血友?。?腫瘤壞死因子受體（治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎）。,29,1975年，英國 科學(xué)家Kohler 和Milstein 建立 雜交瘤技術(shù) （hybridoma technique),骨髓瘤細(xì)胞 1.體外無限增殖； 2.HGPRT(次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶）或者TK(胸腺嘧啶核苷激酶）缺陷型,HAT選擇培養(yǎng)基含 次黃嘌呤H、 氨基蝶呤A、 胸腺嘧啶核苷T (阻斷DNA合成的正常途徑及補(bǔ)救途徑,30,基因工程單克隆抗體的制備,31,轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器,將外源基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞或動(dòng)植物，利用細(xì)胞增殖或動(dòng)植物代謝制備外源基因的表達(dá)產(chǎn)物的技術(shù)----轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器技術(shù)。 被轉(zhuǎn)入外源基因的細(xì)胞或動(dòng)植物----轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器。,32,轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器的特點(diǎn)比較,33,人重組tPA （組織纖維蛋白酶原激活劑） 生產(chǎn)流程,34,胚胎干細(xì)胞移植法及顯微注射獲得轉(zhuǎn)基因小鼠,轉(zhuǎn)染,35,細(xì)胞工程的應(yīng)用（續(xù)）,4. 細(xì)胞療法與組織修復(fù)指利用培養(yǎng)的細(xì)胞或離體再造的組織修復(fù)受損的細(xì)胞、組織或器官,36,干細(xì)胞（自我更新、分化潛能） 單能干細(xì)胞（只能分化為單一類型的干細(xì)胞） 多能干細(xì)胞 全能干細(xì)胞胚胎干細(xì)胞 成體干細(xì)胞 誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞Q: 干細(xì)胞應(yīng)用存在的問題？,37,組織工程（tissue engineering） 1987年提出，指利用細(xì)胞、生物材料、細(xì)胞因子實(shí)現(xiàn)組織修復(fù)或再生的技術(shù)?；疽兀悍N子細(xì)胞、支架材料、細(xì)胞因子,38,組織工程的三條技術(shù)路線,,39,