細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)-細(xì)胞融合.ppt
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細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn),liuzhe5@,概念促融合劑與融合技術(shù)應(yīng)用與意義,重點(diǎn),一定義:Cellfusion,細(xì)胞融合:(Cellfusion)又稱(chēng)體細(xì)胞雜交(somatichybridization)是指將不同來(lái)源的原生質(zhì)體(除去細(xì)胞壁的細(xì)胞)相融合,將兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞合并成一個(gè)細(xì)胞的技術(shù)。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,人心肌細(xì)胞,人肝臟細(xì)胞,,,,,,,,,,種內(nèi)雜交細(xì)胞,,,,,,人細(xì)胞,鼠細(xì)胞,,,,,,,,,,種間雜交細(xì)胞,在適當(dāng)?shù)臈l件下,細(xì)胞融合在一起,產(chǎn)生具有原來(lái)兩個(gè)細(xì)胞基因信息的單個(gè)核細(xì)胞,稱(chēng)為雜交細(xì)胞(hybridcell)。種內(nèi)雜交細(xì)胞(intraspecifichybridcell):同種細(xì)胞融合而成的細(xì)胞種間雜交細(xì)胞(interspecifichybridcell):不同種的細(xì)胞融合而成的細(xì)胞,非對(duì)稱(chēng)細(xì)胞融合(asymmetricfusion):利用物理或化學(xué)方法使某親本細(xì)胞的核或細(xì)胞質(zhì)失活后再進(jìn)行融合。,細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)失活的有物理和化學(xué)方法:1.物理方法,如X射線(xiàn)、r射線(xiàn)等,它們能使細(xì)胞核失活;2.化學(xué)方法,核失活-碘乙酰胺(IOA)、碘乙酸(Iodoacetate);質(zhì)失活-羅丹明(R-6-G,它是一種親脂染料,能夠抑制線(xiàn)粒體的氧化磷酸化過(guò)程而達(dá)到失活作用。,動(dòng)物克隆,上海第二醫(yī)科大學(xué)陳瑩博士,2003年,她將一5歲男孩的包皮細(xì)胞與一只已去除細(xì)胞核的新西蘭兔卵母細(xì)胞融合,獲得了人類(lèi)早期胚胎。,二細(xì)胞融合的原理,,,熒光標(biāo)記的小鼠細(xì)胞和人細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn),將小鼠的抗體與發(fā)綠色熒光的熒光素(fluorescin)結(jié)合,人的抗體與發(fā)紅色熒光的羅丹明(rhodamine)結(jié)合;,顯微鏡下的細(xì)胞融合過(guò)程,細(xì)胞融合的過(guò)程,細(xì)胞互相靠近,細(xì)胞膜融合,細(xì)胞橋形成,細(xì)胞質(zhì)融合,細(xì)胞核融合,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,細(xì)胞融合主要經(jīng)過(guò)了兩原生質(zhì)體或細(xì)胞互相靠近、細(xì)胞橋形成、胞質(zhì)滲透、細(xì)胞核融合主要步驟。細(xì)胞橋的形成是細(xì)胞融合最關(guān)鍵的一步,融合過(guò)程中兩個(gè)細(xì)胞膜從彼此接觸到破裂形成細(xì)胞橋。,細(xì)胞融合過(guò)程中兩個(gè)細(xì)胞膜的變化,形成細(xì)胞橋的具體變化,細(xì)胞融合分為兩種:1.自發(fā)細(xì)胞融合2.人工誘導(dǎo)細(xì)胞融合,(1)自發(fā)細(xì)胞融合,自發(fā)細(xì)胞融合(spontaneouscellfusion)是在未施加任何誘導(dǎo)條件的情況下所發(fā)生的細(xì)胞融合現(xiàn)象。,自發(fā)細(xì)胞融合現(xiàn)象在自然界中并不多見(jiàn),常見(jiàn)的主要有以下幾種情況:1.精子和卵子受精2.肌管的形成3.胚胎著床4.巨細(xì)胞的形成5.破骨細(xì)胞的形成6.腫瘤細(xì)胞融合,,(2)誘導(dǎo)細(xì)胞融合,人工誘導(dǎo)細(xì)胞融合是在人為條件下發(fā)生的細(xì)胞融合現(xiàn)象,常用的誘導(dǎo)方法有三種:1.生物法(病毒誘導(dǎo)法等)2.化學(xué)法(PEG誘導(dǎo)法、Ca2+誘導(dǎo)法、溶血卵磷脂誘導(dǎo)法等)3.物理法(電誘導(dǎo)法等),1.病毒誘導(dǎo)法,常用的病毒:仙臺(tái)病毒(Sendalvirus),又稱(chēng)日本血凝病毒(HemagglutinatingvirusofJapan,HVJ)屬于副粘液病毒科,RNA病毒,圓球形1962年,日本仙臺(tái)東北大學(xué)學(xué)者岡田發(fā)現(xiàn)仙臺(tái)病毒可誘導(dǎo)細(xì)胞融合。,病毒促使細(xì)胞融合兩個(gè)原生質(zhì)體或細(xì)胞在病毒黏結(jié)作用下彼此靠近,使兩個(gè)細(xì)胞膜、胞質(zhì)間互相滲透--------細(xì)胞核互相融合,進(jìn)入正常的細(xì)胞分裂途徑,雜種子細(xì)胞。,,2化學(xué)法(聚乙二醇),PEG:聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)分子式:HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH性狀:白色蠟狀固體,具有強(qiáng)烈的凝集、沉淀蛋白質(zhì)的作用分子量〉1000-6000u,可作誘融劑。,20世紀(jì)70年代,華裔科學(xué)家高國(guó)南發(fā)現(xiàn)聚乙二醇能誘導(dǎo)細(xì)胞融合,,分子量小的PEG,融合效應(yīng)差,又有毒性,分子量過(guò)大,則粘性太大,不易操作。pH偏堿時(shí)融合效應(yīng)最高。用作細(xì)胞融合劑的聚乙二醇一般選用分子量為4000者,常用濃度為50%,pH8.0~pH8.2,聚乙二醇,普遍認(rèn)為聚乙二醇分子能改變各類(lèi)細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu),使兩細(xì)胞接觸點(diǎn)處質(zhì)膜的脂類(lèi)分子發(fā)生疏散和重組,由于兩細(xì)胞接口處雙分子層質(zhì)膜的相互親和以及彼此的表面張力作用,從而使細(xì)胞發(fā)生融合,基本原理,聚乙二醇(PEG)是一種多聚化合物,商品名卡波蠟(Carbowax)。,聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)的細(xì)胞融合,原理:PEG帶有大量的負(fù)電荷,和原生質(zhì)體表面的負(fù)電荷在鈣離子的連接下,形成靜電鍵,促使異源的原生質(zhì)體間的粘著和結(jié)合,在高pH,高鈣離子的溶液的作用下,將鈣離子和與質(zhì)膜結(jié)合的PEG分子洗脫,導(dǎo)致電荷平衡失調(diào)并重新分配,使兩種原生質(zhì)體上的正負(fù)電荷連接起來(lái),進(jìn)而形成具有共同質(zhì)膜的融合體。,,融合過(guò)程中應(yīng)注意①事先要做好兩種原生質(zhì)體的識(shí)別標(biāo)記,如色素、缺陷型、抗性標(biāo)記等。②原生質(zhì)體的密度應(yīng)在105個(gè)/mL左右,兩種原生質(zhì)體按1:1等量混合。③常用PEG的分子量通常為4000~6000,加熱熔化與Eagle溶液配成50%(W/V)濃度(小分子質(zhì)量的PEG配成55%濃度)。加入PEG后,24℃培育10~20min注意時(shí)間宜短不宜長(zhǎng),過(guò)長(zhǎng),使原生質(zhì)體周?chē)粚幽ば纬赡w,會(huì)降低融合率),緩緩加入高pH、高鈣離子溶液15min后用沖洗液清洗,離心收集原生質(zhì)體。,3.物理法一電融合誘導(dǎo)法,1981年,Scheurich和Zimmermann發(fā)明了電誘導(dǎo)細(xì)胞融合。,電融合槽,在直流電脈沖的誘導(dǎo)下,原生質(zhì)體質(zhì)膜表面的電荷和氧化還原電位發(fā)生改變,使異種原生質(zhì)體黏合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂,進(jìn)而質(zhì)膜開(kāi)始連接,直到閉和成完整的膜形成融合體。,細(xì)胞電融合,原理:懸于大小不同的兩平行電極間的低導(dǎo)電率溶液中的細(xì)胞,在1—100MHz和100—1000V/cm的交流電場(chǎng)中,會(huì)向小電極移動(dòng),并極化成偶極子,而沿電場(chǎng)方向發(fā)生雙向電泳,此時(shí)再加上適當(dāng)強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間的高壓電脈沖,即可使相鄰細(xì)胞膜的接觸區(qū)產(chǎn)生可逆電降解,從而觸發(fā)細(xì)胞融合。,,,+,--,,+,-,,+,-,,,,+,,,--,,,-,+,,偶極子,電誘導(dǎo)法原理,,,,+,--,,,-,+,,,,雙向電泳:在交流電場(chǎng)的作用下(1MHz,150V/cm)細(xì)胞膜上正負(fù)電荷分離,產(chǎn)生偶極,兩個(gè)極化的細(xì)胞會(huì)發(fā)生相互的緊密接觸。,,,,,,原生質(zhì)體電融合過(guò)程,1)在高頻電流電場(chǎng)下的相互接觸。2)脈沖刺激后30s3)50秒后4)1.5分鐘后5)6分鐘后6)15分鐘后,原生質(zhì)體融合完成。,注意事項(xiàng),1)對(duì)介質(zhì)要求高,一般用高純度的蒸餾水并選用適當(dāng)?shù)姆请娊橘|(zhì)溶液,如甘露醇等配制等滲性介質(zhì)。2)注意控制高頻交流電壓和直流脈沖電壓的強(qiáng)度和時(shí)間,以防止細(xì)胞連接成串或發(fā)生可逆性降解。,優(yōu)點(diǎn):,融合率高,達(dá)70%-80%,甚至100%可在顯微鏡下定向誘導(dǎo)細(xì)胞融合可直接挑選雜種細(xì)胞重復(fù)性強(qiáng)、對(duì)原生質(zhì)體傷害小;裝置精巧、方便簡(jiǎn)單;免去PEG誘導(dǎo)后的洗滌過(guò)程、誘導(dǎo)過(guò)程可控制性強(qiáng)等。,融合指數(shù)(fusionindex):反映細(xì)胞融合的效率有兩種計(jì)算方法:1.FI=(對(duì)照組細(xì)胞數(shù)-試驗(yàn)組細(xì)胞數(shù))/試驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)2.FI=多核細(xì)胞中的細(xì)胞核數(shù)/所有細(xì)胞中的細(xì)胞核數(shù),,不同細(xì)胞融合的條件及其主要應(yīng)用,來(lái)源前處理融合的方法主要應(yīng)用動(dòng)物細(xì)胞不需仙臺(tái)病毒,PEG,電融合生產(chǎn)單克隆抗體植物細(xì)胞脫壁PEG,電融合創(chuàng)造植物新品種微生物細(xì)胞脫壁PEG,高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)新菌種,,,,,,A,,,A,,,,,B,B,,,,A,,A,,,,,B,B,,,,,,,,B,A,,,,A,,,,B,同核體,同核體,異核體(雜交細(xì)胞),未融合,未融合,,,加入融合劑,融合細(xì)胞的類(lèi)型,,同核體:由同一親本細(xì)胞融合而來(lái)異核體:(heterokaryon)有不同親本細(xì)胞融合而來(lái)異核體其細(xì)胞膜融合在一起,而融合的細(xì)胞含有兩個(gè)不同的細(xì)胞核。,動(dòng)物細(xì)胞融合影響因素,動(dòng)物細(xì)胞融合中,除促融劑外,其他如細(xì)胞性質(zhì)、溫度、pH、離子強(qiáng)度及離子種類(lèi)等均全影響細(xì)胞融合效率。①親本細(xì)胞表面性質(zhì)影響較大②細(xì)胞種類(lèi)不同,融合效果也不同,如腹水癌及株化細(xì)胞較易融合,而淋巴細(xì)胞或血球細(xì)胞幾乎不融合。③細(xì)胞融合時(shí)需要適宜溫度和運(yùn)動(dòng)狀態(tài)。如仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)-腹水癌細(xì)胞融合時(shí),于37℃振搖時(shí)易于融合,且融合效率與病毒量呈正比。但在34℃振搖則融合率下降。在37℃時(shí)不振搖則-不融合。,,④細(xì)胞融合過(guò)程中,通常耗氧量較大,缺氧時(shí)經(jīng)常不融合??諝庵泻趿看笥?0%時(shí)有一定融合率,但有些細(xì)胞在無(wú)氧條件也可融合。⑤有些細(xì)胞融合時(shí)需要Ca2+,否則不融合,細(xì)胞蛋白質(zhì)亦發(fā)生變化。實(shí)驗(yàn)表明Sr2+、Ba2+、Mg2+、Mn2+等離子可代替Ca2+,但有效濃度較Ca2+大的多。融合時(shí)最適合的離子強(qiáng)度一般為0.1mol/L。⑥最適合的pH為7.4-7.8之間,在此范圍之外,融合率均較低。,比較常用的雜種細(xì)胞篩選方法,1遺傳互補(bǔ)篩選法:2營(yíng)養(yǎng)互補(bǔ)篩選:3溫度敏感篩選法,1)遺傳互補(bǔ)篩選法:利用每一親本貢獻(xiàn)一個(gè)功能正常等位基因,糾正另一親本的缺陷,令雜種細(xì)胞表現(xiàn)正常。親本A:HGPRT-/TK+親本B:HGPRT+/TK-雜交細(xì)胞:HGPRT+/TK+在HAT培養(yǎng)基中雜交細(xì)胞存活,A、B死亡,2)營(yíng)養(yǎng)互補(bǔ)篩選系統(tǒng):細(xì)胞在缺乏一種或幾種營(yíng)養(yǎng)成分時(shí),不能生長(zhǎng)繁殖即營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞。利用兩種親本細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)互補(bǔ)作用原理可以篩選雜種細(xì)胞。親本A:色氨酸缺陷型親本B:蘇氨酸缺陷型雜種細(xì)胞可以在不含色氨酸和蘇氨酸的培養(yǎng)基上培養(yǎng),而親本細(xì)胞均會(huì)死亡。,3)溫度敏感突變型雜種細(xì)胞的篩選:一般的培養(yǎng)細(xì)胞能在32度到40度的范圍內(nèi)生長(zhǎng),但溫度敏感突變型的細(xì)胞能在高溫或低溫下生長(zhǎng)。由此篩選雜種細(xì)胞。親本一:低溫敏感突變型,可在低溫下生長(zhǎng),在高溫下死亡。親本二:高溫敏感突變型,可在高溫下生長(zhǎng),在低溫下死亡。雜種細(xì)胞能在高溫和低溫下生長(zhǎng)。,細(xì)胞融合的應(yīng)用,1.用于基因定位2.用于生產(chǎn)樹(shù)突狀細(xì)胞抗腫瘤疫苗2.用于動(dòng)物育種3.用于細(xì)胞治療4.用于生產(chǎn)單克隆抗體5.用于研究核質(zhì)關(guān)系和腫瘤發(fā)生機(jī)制,細(xì)胞融合應(yīng)用,一.單克隆抗體1975年英國(guó)科學(xué)家Milstein和Kohler將產(chǎn)生抗體的淋巴細(xì)胞同腫瘤細(xì)胞融合,成功建立了單克隆抗體技術(shù),而獲得1984年諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎(jiǎng)。,TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1984"forthediscoveryoftheprincipleforproductionofmonoclonalantibodies",,GeorgesJ.F.KoehlerFederalRepublicofGermanyBaselInstituteforImmunologyBasel,Switzerlandb.1946d.1995,CarMilsteinArgentinaandUnitedKingdomMRCLaboratoryofMolecularBiologyCambridge,UnitedKingdomb.1927(inBahiaBlanca,Argentina)d.2002,科萊爾,米爾斯坦,,單克隆抗體的概念,單:單個(gè)細(xì)胞克隆:無(wú)性繁殖抗體:化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng),親本細(xì)胞的準(zhǔn)備,細(xì)胞融合,雜交瘤細(xì)胞的篩選,可分泌特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞的篩選,雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng),單克隆抗體的生產(chǎn)和純化,,,,,,,,,,,,生產(chǎn)過(guò)程,單克隆抗體的大量制備過(guò)程,一細(xì)胞融合前準(zhǔn)備(一)動(dòng)物免疫與免疫脾細(xì)胞懸液的制備在腹腔免疫1-2次后的2-4周,于融合前3—4天加強(qiáng)免疫一次,這樣可以使抗原最近激活的B淋巴細(xì)胞定位于脾臟,也使記憶細(xì)胞處在激活與分裂狀態(tài)。許多資料結(jié)果表明,脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合,形成雜交瘤的最佳時(shí)間,是在抗體形成高峰之前,而不是在抗體形成高峰期??扇苄钥乖拿庖吡砍?0-100ug,經(jīng)皮下或腹腔注射免疫1-2次(間隔2-3周),3周后50-500ug抗原加強(qiáng)免疫,加強(qiáng)免疫一定要靜脈注射或腹腔內(nèi)注射,確??乖竭_(dá)脾臟。細(xì)胞抗原常用2107用細(xì)胞腹腔注射,不需佐劑。一般取最后一次加強(qiáng)免疫3天以后的脾臟,制備成細(xì)胞懸液。,,淋巴細(xì)胞:經(jīng)過(guò)免疫處理的淋巴細(xì)胞,多用大鼠或小鼠。免疫方法:體內(nèi)法或體外法。體內(nèi)法:對(duì)細(xì)胞或微生物抗原可直接注射如小鼠體內(nèi),可溶性蛋白抗原可與等量的福氏完全佐劑混合乳化后,注入到動(dòng)物體內(nèi)。3-4天后,在無(wú)菌條件下可以取出脾或淋巴結(jié)制成懸液,存活率在95%以上的可以用于融合。體外法:直接提取大、小鼠淋巴細(xì)胞,調(diào)整為107個(gè)/ml,加適當(dāng)濃度抗原,3-4天后,收集被刺激的淋巴細(xì)胞。,,小牛血清的選擇①供血的新生小牛必須是健康牛的產(chǎn)仔,并在產(chǎn)后24小時(shí)內(nèi)抽血,此期間不得吸取母乳。②以無(wú)菌操作自頸動(dòng)脈放血,并在無(wú)菌條件下分離血清及濾菌,全過(guò)程在36小時(shí)內(nèi)完成。經(jīng)濾菌的血清置-20℃保存。③血清使用前需做細(xì)菌、支原體培養(yǎng)及內(nèi)毒素測(cè)定,在確實(shí)無(wú)污染的情況下方可使用。④每批小牛血清測(cè)定總蛋白含量并分別配成10%、20%、25%于基礎(chǔ)培養(yǎng)基和HAT培養(yǎng)基中,對(duì)骨髓瘤細(xì)胞和雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),觀(guān)察小牛血清對(duì)瘤細(xì)胞和融合細(xì)胞的細(xì)胞毒性。⑤輕微溶血的血清,而無(wú)細(xì)胞毒性者仍可應(yīng)用。⑥在用血清做細(xì)菌培養(yǎng)時(shí),應(yīng)置于細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)進(jìn)行,培養(yǎng)期間隨時(shí)可放于倒置顯微鏡下觀(guān)察,可避免由于肉眼觀(guān)察的疏忽。,,,B淋巴細(xì)胞的準(zhǔn)備,紅細(xì)胞,,將紅細(xì)胞注入小鼠皮下或腹腔,,取出脾臟,,B淋巴細(xì)胞,,親本細(xì)胞的準(zhǔn)備,(二)骨髓瘤細(xì)胞的獲得與培養(yǎng),骨髓瘤細(xì)胞系應(yīng)和免疫動(dòng)物屬于同一品系,這樣雜交融合率高,也便于接種雜交瘤細(xì)胞在同一晶系小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生大量McAB。骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)可利用一般的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液。小牛血清的濃度一般在10%—20%,細(xì)胞的最大密度不得超106個(gè)/ml,一般擴(kuò)大培養(yǎng)以1:10稀釋傳代,每3-5天傳代一次。細(xì)胞的倍增時(shí)間為16-20h。,親本細(xì)胞的準(zhǔn)備,骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備,骨髓瘤細(xì)胞:是癌變的漿細(xì)胞,可以分泌免疫球蛋白,所以必須選擇不分泌免疫球蛋白的缺陷型骨髓瘤細(xì)胞,多用BALB/C小鼠的骨髓瘤細(xì)胞。,,細(xì)胞融合,,,加入PEG作融合劑,B淋巴細(xì)胞,骨髓瘤細(xì)胞,雜交瘤細(xì)胞,,1,2,3,4,二細(xì)胞融合,融合條件除了融合劑以外,還包括溫度、培養(yǎng)基和培養(yǎng)板等。我們首先分析用PEG作融合劑時(shí)的條件選擇。由于作用時(shí)間不一樣對(duì)細(xì)胞的毒性也不一樣。用于融合的分子量一般在1000-4000,一般作用濃度在35%-50%之間,PEG作用1-2分鐘,以PH8.0-8.2時(shí)融合率最高。,小白鼠脾臟細(xì)胞B與癌細(xì)胞N以PEG進(jìn)行融合,操作在10min內(nèi)完成(如下圖),隨即把細(xì)胞平均分配在96槽細(xì)胞培養(yǎng)盤(pán)中,,,細(xì)胞融合:1.脾細(xì)胞的準(zhǔn)備;拉頸處死小鼠;無(wú)菌操作取出脾臟;清洗、研磨。2.制備脾細(xì)胞懸液:收集細(xì)胞;離心洗滌;細(xì)胞計(jì)數(shù)。3.準(zhǔn)備骨髓瘤細(xì)胞:收集細(xì)胞;離心洗滌;活細(xì)胞計(jì)數(shù);調(diào)整細(xì)胞濃度,骨髓瘤細(xì)胞與小鼠脾胞按一定比例混合。4.細(xì)胞融合劑的選擇:病毒,PEG。5.細(xì)胞融合:在聚乙二醇作用下各種淋巴細(xì)胞可與骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生融合,形成雜交瘤細(xì)胞。,,將免疫脾細(xì)胞和小鼠骨髓細(xì)胞以2:1或10:1的比例混勻于50ml錐形離心管內(nèi)。1200rpm離心7—10分鐘,盡量吸凈上清液,用手指輕擊管壁,使管底沉淀的細(xì)胞鋪展成薄層。在室溫條件下邊輕輕振搖離心管邊在60秒鐘內(nèi)逐滴加入50%的PEG0.5ml,隨后靜置90秒。再于5分鐘內(nèi)邊振搖邊逐滴加入5-10ml不含血清的培液或鹽水緩沖液,以終止PEG的作用,再靜置10分鐘。,,融合細(xì)胞的早期觀(guān)察及其異常結(jié)果分析:1.融合后的細(xì)胞早期觀(guān)察與管理;2.無(wú)分泌特異性抗體雜交瘤原因分析;3.轉(zhuǎn)種與擴(kuò)大培養(yǎng)過(guò)程中雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng);4.不出現(xiàn)雜交瘤的原因分折。,三雜交瘤細(xì)胞的篩選,,融合,,,將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng),,HAT,,,1,2,3,4,HAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞,細(xì)胞團(tuán)塊分散后,加HAT溶液,稀釋至骨髓瘤細(xì)胞不超過(guò)2105ml,即可加入有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔塑料培養(yǎng)板內(nèi)每孔0.1ml,如是24孔板,每孔0.5ml;總量分別為0.2ml和1ml。用HAT選擇性培養(yǎng)時(shí)每隔2-3天半量換液,7天后可以選擇出雜交瘤細(xì)胞。,HAT選擇系統(tǒng),HAT是含一定濃度次黃嘌呤(H)、氨基喋呤(A)及胸腺嘧啶核苷(T)的一種選擇性培養(yǎng)基,其中三種成分與細(xì)胞DNA合成有關(guān)。DNA合成途徑有兩種。,雜交瘤技術(shù)中,常選用次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺陷(HPRT-)骨髓瘤細(xì)胞或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型(TK-)骨髓瘤細(xì)胞為親本之一。HPRT-細(xì)胞的嘌呤只能由全合成途徑產(chǎn)生;TK-細(xì)胞的嘧啶只能由全合成途徑合成。含氨基喋呤培養(yǎng)基抑制了細(xì)胞內(nèi)嘌呤和嘧啶的全合成途徑。,淋巴細(xì)胞具有合成DNA的兩條途徑。雜種細(xì)胞通過(guò)互補(bǔ)作用獲得HRPT或TK基因,可應(yīng)用培養(yǎng)基中次黃嘌呤及胸腺嘧啶核苷,通過(guò)補(bǔ)救合成途徑合成DNA。在HAT培養(yǎng)基中,HPRT-或TK-親本細(xì)胞死亡,淋巴細(xì)胞亦逐漸死亡,只有雜種細(xì)胞存活。,四可分泌特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞的篩選,,HAT,將培養(yǎng)皿孔內(nèi)的上清液取出,檢測(cè)抗體。常用的方法有:放射免疫測(cè)定、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和免疫熒光測(cè)定。,融合,,五雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng),,,,123456,融合,,HAT,,,雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng),利用單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)選育出遺傳穩(wěn)定的分泌特異抗體的細(xì)胞系。在培養(yǎng)過(guò)程中,一般要加能釋放某些生長(zhǎng)因子促進(jìn)雜交瘤生長(zhǎng)的飼養(yǎng)細(xì)胞,如小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞、脾細(xì)胞或胸腺細(xì)胞等。方法有有限稀釋法、軟瓊脂培養(yǎng)法、顯微操作法、應(yīng)用熒光激活分選儀等。,,克隆化的目的1)是細(xì)胞建株的必經(jīng)過(guò)程,以得到遺傳特征相同的細(xì)胞;2)就雜交瘤而言,可從中篩選出穩(wěn)定而同源的雜種細(xì)胞系,淘汰遺傳不穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)跑。3)減少非分泌型無(wú)關(guān)細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)快。注意事項(xiàng):①待克隆細(xì)胞生長(zhǎng)處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期;②小牛血清的質(zhì)量和濃度;③細(xì)胞計(jì)數(shù)要準(zhǔn)確;④及時(shí)觀(guān)察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。,,飼養(yǎng)細(xì)胞的種類(lèi)和作用對(duì)于培養(yǎng)小鼠細(xì)胞來(lái)說(shuō),主要有下列各種細(xì)胞可供作為其飼養(yǎng)細(xì)胞:①胸腺細(xì)胞,用量為106/0.2ml②正常的脾細(xì)胞;③傳代培養(yǎng)中的大鼠胚胎成纖維細(xì)胞;④腹腔細(xì)胞其用量為2104/0.2ml,腹腔細(xì)胞是使用得最普遍的飼養(yǎng)細(xì)胞。胚胎成纖維細(xì)胞因在細(xì)胞培養(yǎng)條件下有分裂增殖的能力,故只適應(yīng)于軟瓊脂平板法培養(yǎng)中,該細(xì)胞鋪于平板的底層。,,飼養(yǎng)細(xì)胞的作用①提高培養(yǎng)細(xì)胞的密度,使待克隆細(xì)胞容易生存與繁殖。②腹腔細(xì)胞能清除培養(yǎng)中的死亡細(xì)胞,從而促進(jìn)單個(gè)細(xì)胞克隆的生長(zhǎng)。③飼養(yǎng)細(xì)胞能釋放諸如細(xì)胞生長(zhǎng)因子類(lèi)物質(zhì),起到促進(jìn)細(xì)胞分裂、增殖的作用。,1.有限稀釋法,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,稀釋,,,,,1)有限稀釋法有限稀釋法原理是從理論上將細(xì)胞稀釋到10個(gè)/ml,然后裝成每小孔(96孔板)0.1ml,使每孔理論上含有單個(gè)細(xì)胞,經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后即可獲得單個(gè)細(xì)胞形成集落。有限稀釋法舉例:1.取1.0ml5104ml細(xì)胞+4ml培養(yǎng)基稀釋?zhuān)?104/ml.2.取0.5ml1104ml細(xì)胞液+4.5ml培養(yǎng)基稀釋?zhuān)?103/ml.3.取1.0ml1103ml細(xì)胞液+4.5ml培養(yǎng)基稀釋?zhuān)?102/ml.,2.軟瓊脂培養(yǎng)法,在加入飼養(yǎng)細(xì)胞的無(wú)菌平皿內(nèi)鋪上一層0.5%的瓊脂,待凝固后再鋪上一層混有雜交瘤細(xì)胞的0.25%的軟瓊脂。待細(xì)胞長(zhǎng)成集落后,用毛細(xì)管吸出移種于含飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板內(nèi)。,,,,,,,2)軟瓊脂培養(yǎng)法:本法對(duì)于某些抗原,可以把克隆化培養(yǎng)與特異性篩選測(cè)定結(jié)合起來(lái)進(jìn)行,所以它的特點(diǎn)是效率較高,速度較快。但缺點(diǎn)是克隆率不高?;驹硎抢脝蝹€(gè)細(xì)胞在軟瓊脂培養(yǎng)基上的局限化生長(zhǎng),待細(xì)胞集落長(zhǎng)到肉眼可見(jiàn)后,用巴氏吸管從瓊脂上挑出來(lái)(一般8—10天后),再移到液體培養(yǎng)基中,進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖,并檢測(cè)培養(yǎng)上清液的活性。也可以用溶血空斑技術(shù)或圍繞集落形成免疫沉淀的方法來(lái)直接測(cè)它的活性。,,3.顯微鏡操作法,,,,,,,,,,,,,,,,,,,3)顯微鏡操作法在倒置(或解剖)顯微鏡下,借助于毛細(xì)吸管將單個(gè)細(xì)胞個(gè)別吸出,分別放入已加飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)孔內(nèi),根據(jù)原理不同,又分為普通法和玫瑰花結(jié)兩種方法。普通顯微鏡操作法:于6cm平皿中,假如約103個(gè)細(xì)胞;CO2培養(yǎng)基箱中靜置1小時(shí)左右無(wú)菌條件;在倒置顯微鏡下去平皿蓋用直角轉(zhuǎn)頭滴管,吸出單個(gè)細(xì)胞移至預(yù)先加有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板內(nèi)直至96孔均分裝有細(xì)胞,加蓋;于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)觀(guān)察與更換培養(yǎng)方法同有限稀釋法。玫瑰花結(jié)原理:分泌抗體細(xì)胞在其表面含有抗原受體,在—定的條件下??膳c特異性抗原致敏的羊紅細(xì)胞形成玫瑰花結(jié)。如果從免疫動(dòng)物的脾細(xì)胞中除去能形成特異性玫瑰花結(jié)的細(xì)胞則失去對(duì)特異性抗原的反應(yīng)性。,4.熒光激活分離法,,熒光激活細(xì)胞分離器法(FluoresemuactivatedCellSortu,F(xiàn)ACS)用本儀器分離單細(xì)胞的原理是將懸液中的細(xì)胞引入一種液流的中央,使其一個(gè)接一個(gè)地通過(guò)聚焦的高能激光束,根據(jù)熒光和光放射的性質(zhì)快速分析和分離細(xì)胞。,,5)蓋片分離法1.用釘錘于潔凈的橡膠上砸干凈蓋片;2.選擇碎塊、大小形態(tài)適用的選出;3.加培養(yǎng)液及進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng);4.倒置鏡下選細(xì)胞,挑出單細(xì)胞玻片;5.進(jìn)行單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)。,,,,大量生產(chǎn)單克隆抗體:,(1)體外使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞,從上清中獲取單克隆抗體;(2)體nei雜交瘤細(xì)胞制備腹水或血清1)實(shí)體瘤法:對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞接種于小鼠背部皮下,每處注射0.2ml.腫瘤達(dá)到一定大小后則可采血,從血清獲得單克隆抗體。,2)腹水的制備:,腹腔注射1x106雜交瘤細(xì)胞,按種細(xì)胞7-10天后可產(chǎn)生腹水。也可用注射器抽取腹水,可反復(fù)收集數(shù)次。腹水中單克隆抗體含量可達(dá)5-20mg/ml,可以將腹水中細(xì)胞凍存起來(lái),復(fù)蘇后轉(zhuǎn)種小鼠腹腔則產(chǎn)生腹水快、量多。,,避免夭折的方法可采用:①換液動(dòng)作輕柔、換液量不超過(guò)1/2;②避免反復(fù)取出CO2培養(yǎng)箱,不宜經(jīng)常換液;③不輕易更換新批號(hào)小牛血清。及時(shí)判斷陽(yáng)性孔也是一項(xiàng)重要的工作,可起減少工作量和保證重點(diǎn)雜交細(xì)胞雙重作用,待集落生長(zhǎng)到96孔板孔1/3左右,24孔板1/5左右,就要及時(shí)測(cè)定各孔上清中是否會(huì)有特異性抗體,一旦發(fā)現(xiàn)抗體陽(yáng)性孔,就應(yīng)立即擴(kuò)大培養(yǎng),再凍存和克隆化,以免被其他細(xì)胞生長(zhǎng)所壓抑或意外丟失。無(wú)分泌特異性抗體雜交瘤原因分析:融合后經(jīng)HAT選擇有細(xì)胞克隆出現(xiàn),但不能篩選出產(chǎn)生特異抗體的雜交瘤,常見(jiàn)原因是:①抗體檢測(cè)法不夠敏感;②HAT選擇失??;③染色體丟失和克隆競(jìng)爭(zhēng);④動(dòng)物免疫不成功。,,,雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生單克隆抗體示意圖,單克隆抗體的應(yīng)用,主要用于疾病的診斷、治療和預(yù)防。與常規(guī)抗體相比,具有特異性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。如;各種癌癥、肝炎病毒、SARS病毒、細(xì)菌及血吸蟲(chóng)等數(shù)百種疾病的診斷;在疾病治療方面,單克隆抗體猶如人體衛(wèi)士,能識(shí)別“自己”與“異己”,一旦發(fā)現(xiàn)致病因素便與之結(jié)合將其殺死。若在單抗上帶上抗癌藥物制成“生物導(dǎo)彈”,將藥物定向帶到癌細(xì)胞所在部位,既消滅了癌細(xì)胞又不會(huì)傷害健康細(xì)胞,美國(guó)科學(xué)家采用細(xì)胞融合技術(shù)將番茄和馬鈴薯的細(xì)胞融合在一起,培育出稱(chēng)之為“番茄薯”或“薯番茄”的新型植物。植株地上部結(jié)番茄,地下部生長(zhǎng)根莖,產(chǎn)量高,品質(zhì)好。,,,動(dòng)物細(xì)胞融合與單克隆抗體思考與探究,1.植物體細(xì)胞雜交技術(shù)與動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)有什么不同?提示:植物體細(xì)胞雜交技術(shù)與動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)基本相同,不同的是植物體細(xì)胞融合前需去掉細(xì)胞壁,然后再融合;動(dòng)物細(xì)胞融合是兩個(gè)體細(xì)胞直接融合。,2.制備單克隆抗體時(shí),為什么要選用B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合形成雜交瘤細(xì)胞?,提示:哺乳動(dòng)物感染抗原后,其體內(nèi)會(huì)形成相應(yīng)的B淋巴細(xì)胞,B淋巴細(xì)胞能分泌相應(yīng)的抗體凝聚或殺死這些抗原。動(dòng)物在免疫反應(yīng)的過(guò)程中,每一種B淋巴細(xì)胞能分泌一種特異性抗體,要想獲得大量的特異性抗體,必須使能分泌該單一抗體的B淋巴細(xì)胞大量增殖。B淋巴細(xì)胞具有產(chǎn)生單一抗體的能力,但不能在體外增殖骨髓瘤細(xì)胞是一種癌細(xì)胞,它能在體外培養(yǎng)條件下無(wú)限增殖,但不能產(chǎn)生抗體。因此,把一種B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合,產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞,它會(huì)兼有兩個(gè)親本細(xì)胞的特性──在體外培養(yǎng)條件下能不斷增殖,同時(shí)能產(chǎn)生出某種特異性的抗體。,,3已成功的動(dòng)物細(xì)胞融合實(shí)例還有哪些?生物種類(lèi)細(xì)胞來(lái)源成功年代酵母菌—雞原生質(zhì)體—血紅細(xì)胞1975年人—胡蘿卜腹水癌細(xì)胞—原生質(zhì)體1976年人—小鼠纖維肉瘤細(xì)胞—畸胎瘤細(xì)胞1978年,,,,4.為什么不用兩個(gè)而用多個(gè)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合?,就目前常用的細(xì)胞融合方法來(lái)看,不管是用物理的、化學(xué)的方法,還是生物的方法,其融合率都不可能是100%。僅用兩個(gè)細(xì)胞融合,其效率太低,不一定能得到融合細(xì)胞。更重要的是,即使兩個(gè)細(xì)胞已發(fā)生融合,但并不一定是研究者期望得到的細(xì)胞類(lèi)型。目前動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)最有價(jià)值的應(yīng)用就是單克隆抗體的制備。我們以制備單克隆抗體為例來(lái)說(shuō)明這一問(wèn)題。我們知道,體內(nèi)產(chǎn)生的特異性抗體種類(lèi)可多達(dá)百萬(wàn)種以上,但是每一個(gè)B淋巴細(xì)胞只分泌一種特異性抗體,如果僅取一個(gè)脾細(xì)胞(含B淋巴細(xì)胞)和一個(gè)瘤細(xì)胞雜交,我們不能確定該脾細(xì)胞分泌的抗體是否正是我們所需要的;若用大量的脾細(xì)胞和瘤細(xì)胞進(jìn)行融合,就可以從融合細(xì)胞中篩選出能分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞。,5.雜交瘤細(xì)胞的抗體檢測(cè)及克隆化培養(yǎng)?,融合后的細(xì)胞經(jīng)選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)后,能存活的細(xì)胞就是雜交瘤細(xì)胞。但這些雜交瘤細(xì)胞并非都是能分泌所需抗體的細(xì)胞,通常用“有限稀釋法”來(lái)選擇。將雜交瘤細(xì)胞稀釋?zhuān)枚嗫准?xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng),使每孔細(xì)胞不超過(guò)一個(gè),通過(guò)培養(yǎng)讓其增殖。然后檢測(cè)各孔上清液中細(xì)胞分泌的抗體(常用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法),那些上清液可與特定抗原結(jié)合的培養(yǎng)孔為陽(yáng)性孔。陽(yáng)性孔中的細(xì)胞還不能保證是來(lái)自單個(gè)細(xì)胞,挑選陽(yáng)性孔的細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行有限稀釋?zhuān)话阈柽M(jìn)行3~4次,直至確信每個(gè)孔中增殖的細(xì)胞為單克隆細(xì)胞。該過(guò)程即為雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)。,,這樣的人畜細(xì)胞融合會(huì)造成什么后果?4位專(zhuān)家分析指出:首先,某些目前未知的兔子疾病將傳染給人類(lèi),就像艾滋病病毒可能是從非洲猩猩而來(lái)。盡管中山醫(yī)科大學(xué)把胚胎用于治療性克隆研究,但萬(wàn)一被居心叵測(cè)者植人人類(lèi)子宮,就可能產(chǎn)生一個(gè)人兔雜交種。“這完全是對(duì)人類(lèi)尊嚴(yán)的褻讀。”,精子和卵子受精,,肌管,,,破骨細(xì)胞是由好幾個(gè)細(xì)胞融合,,,巨細(xì)胞,,骨巨細(xì)胞瘤,骨巨細(xì)胞瘤綠色箭頭所指為正在融合的間質(zhì)細(xì)胞,,,附錄:蟾蜍血紅細(xì)胞\雞血紅細(xì)胞,[實(shí)驗(yàn)步驟]1.試劑:(1)Alsver液:葡萄糖2.05g,檸檬酸鈉0.8g,氯化鈉0.42g,加重蒸水至100mL即可。(2)GKN液:氯化鈉8g,氯化鉀0.4g,磷酸氫二鈉1.77g,磷酸二氫鈉0.69g,葡萄糖2g,酚紅0.01g,溶于1000mL重蒸水中。(3)Ringer溶液:二氯化鈉0.25g,氯化鉀0.42g,氯化鈉6.5g(恒溫動(dòng)物9g)溶于1000mL蒸餾水中。(4)50%PEG混合液:稱(chēng)取少許PEG(Mw4000)放人刻度離心管內(nèi),在沸水浴中加熱,的等體積的GKN液,混勻。,[實(shí)驗(yàn)步驟],1.細(xì)胞懸液的制備:(1)蟾蜍血紅細(xì)胞懸液制備:注射器吸1mLAlsver液后,從蟾蜍主動(dòng)脈弓取血1mL,再加入2mLAlsver液放入刻度離心管內(nèi),按照3:1(V/V)加入6mLAlsver液混勻,放入4℃冰箱內(nèi)可保存3--4天。(2)雞血紅細(xì)胞懸液的制備:用注射器吸入1mLAlsver液后從雞翼下靜脈取血2mL,注入刻度離心管內(nèi),按照3:1(V/V)加入6mLAlsver液混勻。2.取細(xì)胞懸液1mL,移入10mL離心管,加4mL0.85%生理鹽水。1500r/min離心5min。3.棄上清液,加0.85%生理鹽水至5mL,混勻后1500r/min離心5min。重復(fù)再離心洗滌1次。4.收集最后1次離心沉淀的血細(xì)胞,加適量的GKN液或Ringer溶液,按壓積紅細(xì)胞體積配成10%的紅細(xì)胞懸液。5.取懸液1mL到1個(gè)試管中,加入0.5~0.8mL預(yù)熱的50%PEG混勻,置于30℃水浴2min;再加入Ringer或Hanks液5ml以終止PEG的作用;取血細(xì)胞懸液1滴滴于載玻片上,再加入0.2%次甲基藍(lán)溶液1滴,蓋上蓋玻片。6.顯微鏡(高倍)觀(guān)察2個(gè)或3個(gè)靠近細(xì)胞融合過(guò)程。7.進(jìn)行多個(gè)視野的測(cè)定,統(tǒng)計(jì)平均融合,- 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- 細(xì)胞生物學(xué) 實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞融合
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