《學生-實驗基礎》PPT課件.ppt

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第二十六章毒理學實驗基礎,第一節(jié)毒理學實驗設計要求第二節(jié)實驗動物的染毒和處置第三節(jié)優(yōu)良實驗室規(guī)范,2,第一節(jié)毒理學實驗設計要求,目的和意義毒理學實驗設計內(nèi)容確定實驗動物及數(shù)量確定劑量或濃度重復原則隨機分組原則對照原則倫理原則,3,一、確定實驗動物（一）實驗動物物種的選擇,對實驗動物物種選擇的基本原則是：選擇對受試物在代謝、生物化學和毒理學特征與人最接近的物種；自然壽命不太長的物種；易于飼養(yǎng)和實驗操作的物種；經(jīng)濟并易于獲得的物種。,4,（二）實驗動物品系的選擇,品系(strain)是指用計劃交配的方法，獲得起源于共同祖先的一群動物。即具有相似外貌特征，獨特的生物學特性以及穩(wěn)定的遺傳性能，共同遺傳來源和一定遺傳結(jié)構(gòu)的動物群體。例如，C57BL/6是近交系動物中的一個品系，屬低癌組、高補體活性的動物。,5,作為一個品系應具備以下條件：,相似的外貌特征獨特的生物學特性穩(wěn)定的遺傳性能具有共同遺傳來源和一定的遺傳結(jié)構(gòu),6,1、實驗動物按遺傳學控制分類,近交系動物遠交系動物實驗動物突變系動物雜交群動物,,7,（1）近交系動物(inbredstrain),近交系(inbredstrain)：指至少經(jīng)連續(xù)20代以上全同胞交配或親子交配培育而成，品系內(nèi)所有個體都可追溯到起源于20代或以后代數(shù)的一對共同祖先，近交個體的基因純合程度可達98.6％以上的遺傳群體。,8,近交系的特征,基因純合性(homozygosity)遺傳穩(wěn)定性(stability)遺傳同源性(isogenicity)表型一致性(uniformity)個體性(individuality)可分辨性(identification)分布的廣泛性,9,近交系動物的應用實驗組和對照組都只需少量的動物。在某些涉及組織、細胞或腫瘤移植的實驗中，近交系動物成為必不可少的實驗材料。,10,可能成為生理、胎胚發(fā)育和醫(yī)學研究的模型。多個近交系同時使用，可使不同研究者分析不同遺傳組成對某項實驗的影響，或者觀察實驗結(jié)果是否具有普遍意義。,11,（2）突變系動物(mutantstrain),突變系動物是具有特殊突變基因、并伴有各種遺傳缺陷的品系動物。,12,特點,突變系動物可以作為人類疾病的動物模型而在生物醫(yī)學的研究中應用。眾多的突變系動物的出現(xiàn)給生物醫(yī)學研究提供了重要的工具-疾病模型，有不少突變品系動物的疾病與人類疾病極為相似。多為病態(tài)，生活能力較差，對飼養(yǎng)管理要求更為嚴格，繁殖保種較為困難。,13,（3）封閉群動物（closedcolony）,封閉群動物又稱遠交系，是指一個動物種群，在5年以上未從外部引進其他任何新血緣品系，是由同一血緣品系進行隨機交配，并在固定場所保存繁殖的動物群。常見者如：NIH小鼠、Wistar大鼠、KM小鼠、青紫藍兔、新西蘭兔和豚鼠等，均屬這類動物。,14,特點：,一定的雜合性：不引入新的基因，又不使群體內(nèi)基因丟失。相對的穩(wěn)定性：群體在一定范圍內(nèi)保持相對穩(wěn)定的遺傳特征。個體差異取決于祖代動物。較強的繁殖力、抗病力。群體易保存有模型價值的突變基因。,15,（4）雜交群動物(hybridstock),雜交群動物又稱異系雜交或系統(tǒng)雜交動物，是兩個近交品系動物間有計劃進行交配獲得的第一代動物，亦稱雜交一代，簡稱F1代動物。,16,特點：,雜交優(yōu)勢，克服了近交引起的近交衰退遺傳與表型上的均質(zhì)性分布廣泛。不具有育種功能,17,,1、無菌動物（germfreeanimal，GF）：指用現(xiàn)有檢測技術(shù)在動物體內(nèi)外的任何部位均檢不出任何活的微生物和寄生蟲的動物。來源于剖腹產(chǎn)或無菌卵孵化，飼養(yǎng)于隔離系統(tǒng)中。,（三）實驗動物等級的選擇等級是指實驗動物的微生物標準化程度。,18,無菌動物的特點,形態(tài)學改變：消化系統(tǒng):盲腸膨大，腸壁菲薄，易發(fā)生盲腸扭轉(zhuǎn)，導致破裂。循環(huán)系統(tǒng)：心臟變小。免疫系統(tǒng)：胸腺上皮細胞變大，胞漿泡狀結(jié)構(gòu)和溶酶體變小。,19,生理學改變,免疫功能：免疫應答慢，過敏反應、對異體移植物的排斥反應以及自身免疫現(xiàn)象消失或減弱。生長率：豚鼠、兔生長率降低，大、小鼠改變不大。代謝：水分代謝周期延長，腸管對水的吸收率低。營養(yǎng)：體內(nèi)不能合成VitB、VitK。抗輻射能力：增強。壽命：長于普通動物。,20,2、悉生動物(gnotobioticanimalGN),悉生動物：或稱已知菌動物，廣義上把無菌動物、已知菌動物、無特定病原體動物統(tǒng)稱悉生動物；狹義上指已知菌動物。,21,悉生動物的特點,GN動物是動物與微生物的共生復合體。腸道存在能合成維生素和氨基酸的細菌，不會出現(xiàn)維生素缺乏癥。生活力、抵抗力明顯增強，易于飼養(yǎng)。,22,3、無特定病原體動物(SPF):,指動物體內(nèi)無特定的微生物、寄生蟲存在，但帶有非特定的微生物、寄生蟲的動物。主要指不攜帶潛在感染、條件致病和對實驗干擾大的病原。來源于剖腹產(chǎn)動物。小鼠病原菌應排除16種，病毒11種；大鼠病原菌應排除16種，病毒7種。,23,4、清潔動物(Cleananimal),除普通動物應排除的病原外，不攜帶對動物危害大和對科學研究干擾大的病原。來源于SPF動物或剖腹產(chǎn)動物。血清病毒抗體檢測可檢測出一定滴度的抗體，病理切片應無病變。小鼠病原菌應排除10種，病毒5種；大鼠病原菌應排除10種，病毒2種。,24,5、普通動物(conventionalanimalCV),定義：不攜帶人獸共患病病原和動物烈性傳染病病原的實驗動物。特點：微生物控制要求最低。生理學特性：健康的外貌，正常的飲食，眼角、鼻腔無分泌物附著，尸檢無眼觀病灶。,25,,（四）個體的選擇年齡和體重性別生理狀態(tài)和健康狀況,26,（五）確定實驗動物的數(shù)量,實驗動物還需要有一定的數(shù)量，例數(shù)不能太少，也不宜過多。大樣本的代表性優(yōu)于小樣本，但樣本過大會加大工作量，而且成本也相應提高。長期實驗還應考慮實驗動物因疾病或操作不當?shù)仍蛞鸬膭游飻?shù)量減少，應適當增加每組的動物數(shù)。一般來講，每組小鼠和大鼠數(shù)一般不少于10只，犬一般不少于6只。,27,二、確定劑量或濃度,不同實驗方法、不同實驗模型、不同動物實驗所需化學物劑量不同。毒理學研究所應用的劑量應產(chǎn)生下列作用：至少有一個劑量產(chǎn)生明顯的毒作用甚至可能發(fā)生死亡；至少有另一劑量產(chǎn)生輕度的毒性而不發(fā)生死亡；至少還有一個劑量不產(chǎn)生可觀察到的毒作用。對照組的動物可做相同的處理，但不給受試物。應盡量確定不良反應的量效關系和時效關系（如不良反應的發(fā)生和持續(xù)時間）.至少應設三個劑量組。低劑量應相當于主要毒效學的有效劑量，高劑量以不產(chǎn)生嚴重毒性反應為限。,28,三、重復（replication）原則任何毒理學實驗必須用多于一個以上的實驗單位，如實驗單位可為一個動物、一窩子代等。由于實驗單位存在一定變異，可引起實驗效應的誤差，因此只有達到或滿足一定數(shù)量的實驗單位才可提供更準確的實驗效應。,29,四、隨機化（randomization）原則分組隨機化是指用隨機數(shù)字或其他隨機化的電腦程序?qū)⑦x定的實驗單位進行隨機分組或隨機抽樣。實驗設計中的隨機化就是將實驗單位進行隨機分組。例如，將一批受試者按等概率分為A和B兩組，可以用隨機數(shù)字的奇偶決定每個受試者的組別。,30,,隨機化的目的是：使各處理組的實驗單位具有相同的特征，避免實驗者因主觀和客觀因素產(chǎn)生的偏移對分組結(jié)果的影響，減少系統(tǒng)誤差。隨機化是保證組間實驗對象具有可比性，避免數(shù)據(jù)結(jié)果的偏性的有效手段。,31,五、對照（control）原則有比較才有鑒別，設置對照的目的就是在同樣的實驗條件下，驗證新的處理效應與已知或公認的結(jié)果有無差異。或者說設立對照可以使處理因素和非處理因素的差別有一個科學的對比，從而消除非處理因素對實驗結(jié)果的影響，把處理因素的效應充分顯示出來。設立對照是抵消各種非處理因素造成誤差的基本措施。,32,毒理學中常用的對照形式1.空白對照指不給予任何干預因素的對照組，即對照組的處理因素為“空白”。2.陽性對照采用已知陽性物質(zhì)做對照。作為陽性對照的物質(zhì)的效應必須是肯定或?qū)W術(shù)界公認的。受試化合物與陽性對照比較應在相同條件下進行，如溶劑劑量、給藥方法和采樣時間等。設置陽性對照組的主要目的是檢測實驗體系的有效性。,33,3.陰性對照不給要研究的處理因素,但給以其他的實驗因素,以排除這些實驗因素的影響。常用的陰性對照是溶劑/賦形劑對照,以此作為與染毒組比較的基礎。陰性對照除了要研究的因素外,其他處理應和實驗組完全相同。,34,4.自身對照同一研究對象自身處理前后互為對照。采用這種對照時,要求研究因素處理前后的實驗條件必須一致,觀察指標應是穩(wěn)定的。5.歷史對照同一實驗室過去多次實驗的對照組數(shù)據(jù)組成的歷史對照可用于實驗室質(zhì)量的控制和保證。過去的研究資料可用于研究結(jié)果的比較,但需注意資料的可比性。,35,（一）動物福利法的起源1822年，人道的迪克馬丁提出的禁止虐待動物的議案——“馬丁法令”獲得了通過。這是首次以法律條文的形式規(guī)定了動物的利益，保護動物免受虐待，是動物保護史上的一座里程碑。人們對待動物的態(tài)度從此開始了微妙的變化。,六、動物實驗設計的倫理原則,36,現(xiàn)在，動物福利制度已在世界范圍內(nèi)迅速發(fā)展起來。英國現(xiàn)行的動物保護法是1911年通過的，目前英國正在修改這部法律。除了1911年通過的動物保護法之外，英國還陸續(xù)出臺了很多專項法律，比如野生動物保護法、動物園動物保護法、實驗動物保護法、狗的繁殖法案、家畜運輸法案等。自1980年以來，歐盟及美國、加拿大、澳大利亞等國先后都進行了動物福利方面的立法。動物福利組織也在世界范圍內(nèi)蓬勃發(fā)展起來，WTO的規(guī)則中也寫入了動物福利條款。,37,根據(jù)各國現(xiàn)有的動物福利法的歷史及淵源的考察，滿足動物的需求是動物福利法的首要原則。動物的需求主要表現(xiàn)在以下三個方面：維持生命需要，維持健康需要及維持舒適需要。,（二）動物福利的立法宗旨和福利標準,38,解除動物痛苦，讓動物在任何條件下享有如下五大自由是動物福利法的基本原則：1.享有不受饑渴的自由；2.享有生活舒適的自由；3.享有不受痛苦傷害和疾病的自由；4.享有生活無恐懼和悲傷感的自由；5.享有表達天性的自由。這也是目前國際動物福利一致認同的五大標準。只有當上述動物需求得到滿足時，動物才能身心愉悅，享受大自然賦予的生命的樂趣。,39,（三）我國實驗動物福利立法的有關問題,我國現(xiàn)行的有關動物保護的法律為數(shù)不多，動物保護的范圍也過于狹隘，欠缺了哪一方面都不算完整的動物保護。除《野生動物保護法》、《動物檢疫法》等幾部單行法外，余者只散見于《森林法》、《漁業(yè)法》、《海洋環(huán)境保護法》等若干零散條文中，沒有一部專門的、完整的動物保護的總括性法律。因而，人們對于如何保護動物，以及保護動物的意義都缺乏整體的清晰印象。對實驗動物來說，明確其法律地位是解決福利問題先決條件。,40,關于發(fā)布《關于善待實驗動物的指導性意見》的通知國科發(fā)財字〔2006〕398號為了適應科技發(fā)展的需要，貫徹落實《實驗動物管理條例》（中華人民共和國國家科學技術(shù)委員會令第2號，1988），進一步加強實驗動物管理工作，我們在深入研究和廣泛征求意見的基礎上，制定了《關于善待實驗動物的指導性意見》，現(xiàn)予印發(fā)，請認真貫徹落實?？茖W技術(shù)部二ＯＯ六年九月三十日,41,（四）動物實驗的“3R”原則動物實驗替代方法的研究是在科學研究領域，采用科學的方法研究動物福利，在符合科學目的前提下通過采用更為合理的手段，充分體現(xiàn)動物福利的科學實踐活動。而3R研究的最終目的則是為生命科學及相關領域的研究提供有效的研究手段，使科學研究方法更加科學化，試驗結(jié)果更加準確、可靠。,42,3R的概念及內(nèi)涵,3R是Reduction、Replacement和Refinement的簡稱。（1）Reduction（減少）是指在科學研究中，使用較少量的動物獲取同樣多的試驗數(shù)據(jù)或使用一定數(shù)量的動物能獲得更多實驗數(shù)據(jù)的科學方法。對一個實驗來講，用動物越多，則成本就會隨之提高。因此，動物的使用量應是能達到實驗目的的最小用量。絕不能以節(jié)省時間或為了人員的方便以及其他不科學的原因為理由，使用超過能獲取有意義的實驗結(jié)果所需要的最少動物數(shù)量。,43,(2)Replacement（替代）是指使用其它方法而不用動物所進行的試驗或其他研究課題，達到某一試驗目的?；蛘哒f是使用沒有知覺的試驗材料代替以往使用神志清醒的活的脊椎動物進行試驗的一種科學方法。,44,替代有不同的分類方法：,①根據(jù)是否使用動物或動物組織，替代方法可分為相對性替代和絕對性替代兩個方面，前者是指采用人道的方法處死動物或使用細胞、組織及器官進行體外試驗研究，或利用低等動物替代高等動物的實驗方法；后者則是在實驗中完全不用動物；②按照替代物的不同，可分為直接替代（如志愿者或人類的組織等）和間接替代；③根據(jù)替代的程度，又可分為部分替代（利用其他替代實驗手段來代替動物實驗中的一部分或某一步驟）和全部替代（用新的替代方法取代原有的動物實驗方法）。,45,指在符合科學原則的基礎上，通過改進條件，善待動物，提高動物福利；或完善實驗程序和改進實驗技術(shù)，避免或減輕給動物造成的與實驗目的無關的疼痛和緊張不安的科學方法。優(yōu)化包括諸多內(nèi)容，總體說來是一個科學化、規(guī)范化、標準化的過程，包括實驗動物和動物實驗兩個方面。研究內(nèi)容涉及到試驗設計、實驗技術(shù)、仁慈終點、人員的培訓、飼養(yǎng)環(huán)境及設施、動物運輸、動物自然習性等方面，其中動物實驗程序的優(yōu)化是一項主要內(nèi)容。,(3)Refinement（優(yōu)化）,46,3R研究的意義（1）作為提升突破技術(shù)壁壘能力的載體和具體體現(xiàn)“標尺”，在經(jīng)濟發(fā)展和國際貿(mào)易中發(fā)揮不可替代的重要作用。,47,（2）為科學發(fā)展提供了新思路和新方法縱觀3R概念的提出和發(fā)展，可以說它一方面是為了適應動物保護主義運動、緩和動物保護與動物試驗之間日益尖銳的矛盾沖突的一種需要。另一方面，從3R研究成果的應用來看，確實對科學的發(fā)展起到了很大的推動作用。因此說，3R研究也是科學發(fā)展的需要。,48,（3）開展“3R”研究，從保護動物，或是關注動物福利，這也是時代發(fā)展、社會進步在科學技術(shù)上的一種體現(xiàn)。,