年《基因工程技術(shù)》課程復(fù)習(xí)題解答版

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1、2016年《基因工程技術(shù)》課程復(fù)習(xí)題 1. 名詞解釋（占25%， 10個名稱解釋，從12個名詞中選10個） 基因工程：按照人們的愿望，依據(jù)嚴密的設(shè)計，通過體外DNA重組、轉(zhuǎn)基因、基因編輯（CRISPR／Cas9）等技術(shù)，有目的地改造生物物種特性，創(chuàng)造出更符合人類需求的新的生物類型的研究領(lǐng)域。 DNA復(fù)性與變性：變性是指核酸雙螺旋堿基對的氫鍵斷裂，雙鏈變成單鏈，從而使核酸的天然構(gòu)象和性質(zhì)發(fā)生改變。變性時維持雙螺旋穩(wěn)定性的氫鍵斷裂，堿基間的堆積力遭到破壞，但不涉及到其一級結(jié)構(gòu)的改變。 復(fù)性指變性DNA 在適當條件下，二條互補鏈全部或部分恢復(fù)到天然雙螺旋結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象，它是變性的一種逆轉(zhuǎn)過程。

2、 PCR：在模板、引物、4種dNTP和耐熱DNA聚合酶存在的條件下，通過酶促合成反應(yīng)特異擴增位于兩端已知序列之間的DNA區(qū)段。 Tm值：DNA熔解溫度，指把DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)熱變性過程中紫外吸收值達到最大值的1/2時的溫度。不同序列的DNA，Tm值不同。DNA中G－C含量越高，Tm值越高，成正比關(guān)系。 限制性內(nèi)切核酸酶：指能夠識別雙鏈DNA分子中特定核苷酸序列，并在每條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵進行切割的一類酶，簡稱限制酶。 粘性末端：被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個伸出的核苷酸，它們之間正好互補配對，這樣的切口叫黏性末端。 同裂酶：指一些來源不同的能識別同樣

3、的核苷酸靶子序列的限制性內(nèi)切酶。同裂酶的切割位點可能不同，識別序列和切割位點都相同的叫同序同切酶，識別序列相同但切割位點不同的叫同序異切酶。 同尾酶：指來源不同且識別靶子序列也不同但能產(chǎn)生出相同的黏性末端的限制性內(nèi)切酶。 末端酶或Ter體系：在病毒DNA包裝過程中，催化特異性地切割病毒DNA連環(huán)體，產(chǎn)生單位長度的基因組，并參與基因組包裝的酶類。 DNA連接酶：也稱DNA黏合酶，催化相鄰核苷酸的游離5’-磷酸基團和3’-羥基之間形成磷酸二酯鍵的核酸酶。連接酶的催化作用需要消耗ATP。 DNA修飾酶：泛指能夠參與改變DNA組成和結(jié)構(gòu)的一類酶。 DNA聚合酶：是指催化以DNA單鏈為模板，

4、以4種脫氧核糖核苷酸為底物，合成一條與模板鏈序列互補的DNA新鏈的酶。以DNA為復(fù)制模板，從將DNA由5'端點開始復(fù)制到3'端的酶，是細胞復(fù)制DNA的重要作用酶。 載體：是一種具有特定功能能自我復(fù)制的DNA分子，能將外源DNA片段攜帶進入受體細胞，并在受體細胞中穩(wěn)定維持和表達。 質(zhì)粒載體：一種裸露的、比病毒更簡單的，有自主復(fù)制能力的雙鏈超螺旋共價閉環(huán)DNA分子（簡稱cccDNA）。 在由限制性核酸內(nèi)切酶修飾過的質(zhì)粒DNA序列中插入外源的目的基因，以質(zhì)粒為載體，將目的基因通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法導(dǎo)進宿主細胞，進行重組、篩選、擴增的過程。 柯斯質(zhì)粒載體：是一類人工構(gòu)建的含有λDNA的cos序列和

5、質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的質(zhì)粒載體。由三個部分組成：含有一個pBR322的完整復(fù)制子，兩個抗性基因AmpR和TetR及一個帶有λ噬菌體cos序列。 噬菌體載體：噬菌體是一類感染細菌病毒的總稱 ，在噬菌體DNA分子中，除具有復(fù)制起點外，還有編碼外殼蛋白質(zhì)的基因。噬菌體主主要有雙鏈噬菌體和單鏈絲狀噬菌體兩大類。雙鏈噬菌體為λ類噬菌體，單鏈絲狀噬菌體有M13、f1、fd噬菌體。 重組DNA技術(shù)中常用的噬菌體克隆載體主要有λ類噬菌體和M13噬菌體。 溫和噬菌體：具有溶原周期的噬菌體。在短時間內(nèi)不能連續(xù)完成吸附、侵入、增值、成熟和裂解這五個階段而實現(xiàn)繁殖的噬菌體為溫和噬菌體。 烈性噬菌體：只有溶菌周期

6、的噬菌體。烈性噬菌體也稱為毒性噬菌體，噬菌體的繁殖一般分為5個階段，即吸附、侵入、增殖、成和裂解。凡在短時間內(nèi)能連續(xù)完成以上5個階段而實現(xiàn)其增殖的噬菌體，稱為烈性噬菌體。 溶原周期：指在感染過程中沒有產(chǎn)生出子代噬菌體顆粒，但是噬菌體DNA整合到寄主細胞的染色體DNA上，成為染色體DNA的一個組成部分。 溶菌周期：噬菌體吸附到寄主細胞表面之后，注入DNA，噬菌體的DNA進行復(fù)制及蛋白質(zhì)的合成，并組裝成噬菌體顆粒，最后使寄主細胞裂解，釋放出子代噬菌體顆粒的過程。 體外包裝：在離體條件下，用噬菌體或病毒的蛋白質(zhì)包裹噬菌體或病毒的裸核酸，組裝成有感染性的噬菌體或病毒顆粒的過程。 Ti質(zhì)粒：在根

7、瘤土壤桿菌細胞中存在的一種染色體外自主復(fù)制的環(huán)形雙鏈DNA分子。它控制根瘤的形成，可作為基因工程的載體。是致癌農(nóng)桿菌的一種內(nèi)源質(zhì)粒，當農(nóng)桿菌接觸感染植物時，能引發(fā)植物產(chǎn)生腫瘤即冠癭瘤。根據(jù)合成不同的冠癭堿類型， Ti質(zhì)?？梢苑譃檎卖~堿型、胭脂堿型、農(nóng)桿堿型和琥珀堿型等。是一種雙鏈環(huán)狀DNA分子，200-250kb，可分為4個功能區(qū)：T-DNA區(qū)、Vir毒性區(qū)（調(diào)控T-DNA 轉(zhuǎn)移區(qū)）、Con區(qū)（接合轉(zhuǎn)移編碼區(qū)）和Ori區(qū)。 SV40：是猴空泡病毒40，猿猴病毒40或猴病毒40的縮寫，多瘤病毒科，這是在人類和猴子都發(fā)現(xiàn)的致瘤病毒。SV40的基因組是一種環(huán)形雙鏈的DNA，很適于基因操作。SV40

8、病毒有三種外殼蛋白質(zhì)VP1、VP2和VP3，包裝著一條5.2kb的環(huán)狀基因組DNA。根據(jù)其基因組的表達時間不同，把基因組分為早期表達區(qū)和晚期表達區(qū)。早期表達區(qū)編碼T-抗原和t-抗原，當T-抗原達到一定濃度時，開始啟動病毒DNA復(fù)制；晚期表達區(qū)編碼三種外殼蛋白質(zhì)，外殼蛋白質(zhì)在復(fù)制后一段時間內(nèi)表達。 穿梭載體：含有病毒完整早期區(qū)段和復(fù)制起點同大腸桿菌的質(zhì)粒分子重組而構(gòu)建的，既能在哺乳動物細胞復(fù)制增殖，也可以在大腸桿菌中復(fù)制增殖。指含有兩個親緣關(guān)系不同的復(fù)制子，能在兩種不同的生物中復(fù)制的。這類載體不僅具有細菌質(zhì)粒的復(fù)制原點及選擇標記基因，還有真核生物的自主復(fù)制序列以及選擇標記性狀，具有多克隆位點。

9、 cDNA文庫：以mRNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶催化，在體外反轉(zhuǎn)錄成cDNA，與適當?shù)妮d體連接后轉(zhuǎn)化受體菌，則每個細菌含有一段cDNA，并能繁殖擴增，這樣包含著細胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合稱為該組織細胞的cDNA文庫。 基因組文庫：把某種生物基因組的全部遺傳信息通過克隆載體貯存在一個受體菌克隆子群體中，這個群體即為這種生物的基因組文庫。 感受態(tài)細胞：理化方法誘導(dǎo)細胞，使其處于最適攝取和容納外來DNA的生理狀態(tài)。 Southern印跡雜交：利用瓊脂糖凝膠電泳分離經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化的DNA片段，將膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移至尼龍膜或其他固相支持物上，經(jīng)干烤或者紫外線

10、照射固定，再與相對應(yīng)結(jié)構(gòu)的標記探針進行雜交，用放射自顯影或酶反應(yīng)顯色，從而檢測特定DNA分子的含量的技術(shù)。 轉(zhuǎn)染作用：將純化的含有靶基因的質(zhì)粒DNA送入細胞內(nèi)，并在細胞內(nèi)表達。 轉(zhuǎn)化作用：將攜帶某種遺傳信息的DNA分子引入宿主細胞，通過DNA之間同源重組的作用，獲得具有新遺傳性狀生物細胞的過程謂之轉(zhuǎn)化作用。 轉(zhuǎn)導(dǎo)作用:當病毒從被感染的細胞釋放出來，再次感染另一細胞時，發(fā)生在供體細胞與受體細胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組即為轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。 操縱子：指包含結(jié)構(gòu)基因、操縱基因以及啟動基因的一些相鄰基因組成的DNA片段，其中結(jié)構(gòu)基因的表達受到操縱基因的調(diào)控。主要見于原核生物，但在真核生物中也存在。

11、 啟動子：位于結(jié)構(gòu)基因5'端上游的DNA序列※，是指位于轉(zhuǎn)錄起始點上游的特異序列（通常位于基因轉(zhuǎn)錄起點上游的100bp范圍內(nèi)，長約20-200bp），是轉(zhuǎn)錄起始時RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，與轉(zhuǎn)錄的啟動有關(guān)，但本身并不轉(zhuǎn)錄。啟動子的結(jié)構(gòu)可以影響它與聚合酶的親和力，從而影響表達水平。 多順反子：多順反子見于原核生物意指一個mRNA分子編碼多個多肽鏈。這些多肽鏈對應(yīng)的DNA片段則位于同一轉(zhuǎn)錄單位內(nèi)，享用同一對起點和終點。 增強子：是一段能增強啟動子轉(zhuǎn)錄效率的特定序列，從而明顯地提高基因轉(zhuǎn)錄的效率。特點：①遠距離調(diào)控②無方向性 信號肽：在起始密碼子后，有一段編碼疏水性氨基酸序列的RNA區(qū)域，

12、該氨基酸序列就被稱為信號肽序列，它負責把蛋白質(zhì)引導(dǎo)到細胞含不同膜結(jié)構(gòu)的亞細胞器內(nèi)。 密碼子偏好：是指各種生物體偏愛使用三聯(lián)密碼子（即編碼相同氨基酸的密碼子）的現(xiàn)象。 基因表達：細胞在生命過程中，把儲存在DNA順序中遺傳信息經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和翻譯，轉(zhuǎn)變成具有生物活性的蛋白質(zhì)分子。此處指外源基因在受體細胞中從mRNA轉(zhuǎn)錄到功能蛋白質(zhì)翻譯的過程。 Pribnow框：原核生物中，在啟動子上游有一個由5-6個核苷酸組成的共有序列，以其發(fā)現(xiàn)者的名字命名為Pribnow框。 SD序列：原核生物mRNA起始密碼AUG（相應(yīng)DNA上的起始密碼ATG上游約-10處）的上游約4-7個核苷酸之前有一富含嘌呤的5 ′

13、 - AGGAGGU-3 ′的短小序列，稱為SD序列（Shine Dalgarno sequence），能與細菌16SrRNA3’端識別，幫助從起始AUG處開始翻譯。 2. 判斷題（占5%，5個判斷題） 3. 選擇題（占10%，5個選擇題） 4. 問答題（占60%，6個選擇，從8個選擇中選6個） 簡述基因工程的基本技術(shù)路線？ 分離目的基因：從生物有機體的基因組中分離出帶有目的基因的DNA片段； 體外目的基因和載體重組：在體外，將帶有目的基因的DNA片段連接到能自我復(fù)制并具有選擇標記的載體分子上，形成重組DNA分子； 轉(zhuǎn)化受體細胞：將重組DNA分子轉(zhuǎn)化到寄主細胞中； 擴大培養(yǎng)（按

14、需）：重組體在細胞中擴增繁殖，獲得大量的細胞繁殖菌落； 檢測篩選轉(zhuǎn)化細胞：從菌落中，篩選出重組DNA分子克隆菌落； 研究與鑒定：將選出的克隆菌落進一步研究分析，使目的基因的功能在細胞水平上表達。 生產(chǎn)應(yīng)用 簡述基因工程有哪些主要研究內(nèi)容與應(yīng)用領(lǐng)域? 研究內(nèi)容： 基礎(chǔ)研究：克隆載體系統(tǒng)研究 、工具酶系統(tǒng)研究 、受體系統(tǒng)（即表達系統(tǒng)）研究、目的基因功能及其調(diào)控機制研究、基因重組及修飾技術(shù)研究、基因組學(xué)研究等 應(yīng)用研究：基因工程藥物研究（醫(yī)學(xué)領(lǐng)域）、轉(zhuǎn)基因植物研究（種植業(yè)領(lǐng)域）、轉(zhuǎn)基因動物研究（畜牧業(yè)領(lǐng)域）、其他方面研究（食品、化工、能源、環(huán)境等） 應(yīng)用領(lǐng)域： 醫(yī)學(xué)領(lǐng)域：基因工程

15、藥物、基因治療、基因芯片 農(nóng)業(yè)領(lǐng)域：轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因動物 能源環(huán)境領(lǐng)域：轉(zhuǎn)基因能源植物（玉米、木薯、紅薯等）、轉(zhuǎn)基因超級細菌和制劑（糞便污染、油污、重金屬、塑料） 軍事領(lǐng)域：基因武器 簡述提取天然DNA的基本步驟及其主要方法？ 生物材料的準備： 動物和人DNA樣品的采集與保存：主要是血樣和組織樣，冷凍保存、甲醛乙醇等防腐保存； 植物DNA樣品的采集與保存：主要有根、莖、葉、花果等組織器官，采集時避免有病蟲害、損傷的組織器官，將材料清洗用無菌吸水紙吸干保存或冷凍保存； 細菌DNA樣品的制備：通過合適的培養(yǎng)基進行細菌增殖，獲得菌液或菌落，離心收集菌體，冷凍保存； 病毒或噬菌體D

16、NA樣品的制備：由于病毒或噬菌體寄生于細胞內(nèi)，必須從宿主細胞中分離，過程相當復(fù)雜。 細胞裂解： CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）裂解法、SDS裂解法（十二烷基磺酸鈉）、蛋白酶K裂解法、液氮凍融 DNA的分離和抽提： 酚-氯仿抽提法、鹽析法、氯化銫密度梯度離心法、固相萃取法 純化和濃縮： 在抽提DNA溶液中往往含有少量的RNA、蛋白質(zhì)及實驗試劑殘留物，必須去除進一步純化DNA： RNase處理：加入適量的RNase在常溫條件下放置幾分鐘就可以降解DNA溶液中的RNA。 瓊脂糖凝膠電泳洗脫法：用于少量的DNA純化。 氯化銫-溴化乙錠連續(xù)梯度離心法：大量的DNA純化。 離子交換層

17、析法：由于DNA磷酸基團與固相陰性交換離子相互作用，DNA能結(jié)合在層析柱固體介質(zhì)（羥基磷灰石、層析樹脂）上，然后再用一定濃度梯度鹽溶液洗脫。 基因組 DNA 的沉淀：用 0.1 倍體積的 3 M NaAc（乙酸鈉） 或 2.5 倍體積的 100% 乙醇沉淀 DNA, 用 70% 乙醇除去 DNA 沉淀中的鹽離子。 基因組 DNA 的溶解與保存：將基因組 DNA 溶解在 TE 緩沖液中，置 4°C 保存。 制備基因組 DNA 時應(yīng)注意： 防止內(nèi)源性 DNase 保證得到高分子量的基因組 DNA 保證基因組 DNA 不被蛋白質(zhì)和實驗殘留物所污染 闡述PCR引物設(shè)計原則有哪些？

18、 引物長度適中，一般為18~30個核苷酸：引物過短會使PCR的特異性降低，過長會提高相應(yīng)的退火溫度，并使延伸溫度超過TaqDNA聚合酶的最適溫度72℃，亦會影響產(chǎn)物的生成，且合成引物的成本增加。 引物中的堿基盡可能隨機分布：避免出現(xiàn)嘌呤，嘧啶的堆積現(xiàn)象。尤其是引物的3′端不應(yīng)有連續(xù)3個G和C。否則會使引物在模板的G+C富集序列區(qū)錯誤配對。 引物中G+C的含量在45~55%左右。設(shè)計引物時要考慮3′端和5′端引物具有相似的Tm值。Tm=4（G+C）+2（A+T）。引物長度要確保解鏈溫度不低于54℃。 引物自身內(nèi)部不應(yīng)存在互補序列以避免折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)：按經(jīng)驗，引物自身存在的連續(xù)互補序列，

19、一般不超過3bp。 兩個引物之間不應(yīng)存在互補序列，尤其應(yīng)避免3′端的互補形成二聚體。 引物的堿基序列不應(yīng)與非擴增區(qū)域有同源性，尤其是引物3′末端連續(xù)8個堿基在待擴增區(qū)以外不能有完全互補序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴增。 引物3′端堿基是引發(fā)延伸的起點，因此一定要與模板DNA配對。引物3′端的最佳堿基選擇是G和C。因為它們形成的堿基配對比較穩(wěn)定。 引物的5′端可以修飾，如附加限制酶位點，引入突變位點，用生物素，熒光物質(zhì)，地高辛標記，加入其它短序列包括起始密碼子，終止密碼子等。 簡述熒光定量PCR化學(xué)原理 ？※ 實時熒光定量PCR是一種在DNA擴增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測每次聚合酶鏈式反應(yīng)

20、（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。 檢測方法： SYBRGreenⅠ法： 在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。SYBR僅與雙鏈DNA進行結(jié)合，因此可以通過溶解曲線，確定PCR反應(yīng)是否特異。 TaqMan探針法： PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一

21、個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP）。 簡述構(gòu)建質(zhì)粒克隆載體的基本策略？ 必須含有在受體細胞內(nèi)有效的復(fù)制起始位點Ori，最好是松弛型質(zhì)粒復(fù)制起始位點； 必須含有允許外源DNA片段克隆的位點，這樣的位點（限制性內(nèi)切酶識別位點）盡可能多，但是最好

22、一種限制性內(nèi)切酶只有唯一的識別位點； 必須含有供選擇克隆子的標記基因，如抗藥性標記Tetr、Ampr等，最好有兩種選擇標記基因，并且在選擇標記基因內(nèi)含有合適的克隆位點，以便外源DNA片段插入克隆位點后，標記基因失活，成為選擇克隆子的依據(jù)。 構(gòu)建的質(zhì)?？寺≥d體DNA分子應(yīng)盡可能小； 由于特殊需要，在構(gòu)建的質(zhì)?？寺≥d體時需要組裝各種“元件”。 例如在克隆位點的上游組裝強啟動子，下游組裝相應(yīng)的終止子，成為強表達質(zhì)?？寺≥d體。 在克隆載體的合適位置組入受體細胞染色體DNA的同源序列，成為基因整合平臺系統(tǒng)的供體質(zhì)粒克隆載體。 如何利用農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒構(gòu)建植物克隆載體？ 刪除T-DNA上的

23、tms和tmr的基因（卸甲載體或Onc-Ti載體），恢復(fù)植物細胞再生能力； 刪除與T-DNA轉(zhuǎn)化無關(guān)的冠癭堿合成酶基因，進一步減少重復(fù)的酶切位點； 引入大腸桿菌復(fù)制子和選擇標記，構(gòu)建成穿梭載體便于重組子在大腸桿菌中的克隆與擴增； 引入植物啟動子和Poly（A）信號序列，便于外源基因在植物細胞中高效表達； 加入多克隆位點連桿（MCS）。 簡述構(gòu)建基因組文庫的基本步驟和流程？ 載體的選擇和制備； 高純度、大分子量基因組 DNA 的提?。? 基因組 DNA 的部分酶切與分級分離； 載體與DNA片段的連接； 轉(zhuǎn)化或侵染宿主細胞； 篩選與保存。 簡單歸納從基因文庫中克隆目的基因有哪

24、些方法？※ 通過對基因文庫的篩選將目的基因分離出來，一般有兩種方法： 核酸雜交法，原理是分子雜交：首先把屬于一個文庫的細菌或噬菌體以較低密度接種在培養(yǎng)皿上以取得相當分散的菌落或噬菌斑，然后用硝酸纖維濾膜吸印，使培養(yǎng)皿和濾膜的相對應(yīng)的位置上具有相同的克隆。同時另行制備供分子雜交用的探針。為了篩選真核生物的某種基因，常從它的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA經(jīng)反向轉(zhuǎn)錄（見中心法則）合成相應(yīng)的互補DNA(cDNA)，再加入用32P標記的核苷三磷酸，用DNA多聚酶切口移位方法制成有同位素標記的探針。把探針DNA和硝酸纖維濾膜上的菌落或噬菌體分別進行變性處理，然后進行分子雜交。再將X光底片覆蓋在經(jīng)過處理的濾膜上以進行

25、放射自顯影。在培養(yǎng)皿上找出和X光底片上的黑點相對應(yīng)的菌落或噬菌斑。這些菌落或噬菌體中便包含著所需要的基因，經(jīng)過擴增便能得到大量的細菌或噬菌體，從中可以分離出所需基因的DNA片段。 PCR篩選法，通過ＰＣＲ方法將目的基因分離出來（使用的引物是目的基因特異引物）：對于以混合形式保存的文庫，先將文庫分成幾份，每份為一個“反應(yīng)池”進行PCR反應(yīng)，待選出陽性池后，將陽性池的混合克隆稀釋，然后等量分置?96孔板中，進行橫向池及縱向池的ＰＣＲ反應(yīng)，然后將陽性菌落群進行稀釋，重復(fù)上述工作，直到篩出陽性單克隆。 簡述（或圖解）抑制消減雜交（SHH）技術(shù)的基本原理？ 是以抑制性PCR反應(yīng)為基礎(chǔ)的cDNA 消

26、減雜交技術(shù)。 通過合成兩個不同的接頭，連接于測試cDNA 片段的5’末端，達到選擇性擴增差異性表達的cDNA 片段，抑制非目的cDNA的擴增。 利用抑制性PCR能選擇性擴增不同豐度差異基因和cDNA 消減雜交特點,運用雜交二級動力學(xué)原理（即高豐度序列退火時產(chǎn)生同源雜交的速度大于低豐度序列）,使原本不同豐度的DNA序列相對含量趨于一致。然后利用抑制性PCR特點,兩端接上同一接頭的非目的基因片段由于具有反向重復(fù)序列,在退火時容易形成發(fā)夾互補結(jié)構(gòu),在PCR中不能作為模板與引物配對擴增,從而選擇性擴增目的基因而抑制非目的基因片段擴增。消減雜交扣除了實驗組和對照組之間同源序列,再結(jié)合抑制性PCR的動力

27、學(xué)富集,實現(xiàn)高效分離低豐度特異性非同源片段。 簡述（或圖解）菌落（或噬菌體）原位雜交的基本步驟？ ※ 原位雜交就是將細菌菌落影印到濾膜上，或?qū)⒕N點種在濾膜上然后再生長出可見的菌落，對濾膜上的菌體進行原位裂解使 DNA 釋放出來，并使之固定在濾膜上。然后通過分子雜交，判斷哪個或哪些菌落含有與探針同源的DNA 。 簡述受體細胞的選擇應(yīng)符合哪些基本原則？ 便于重組DNA分子的導(dǎo)入，例如細菌，容易誘導(dǎo)形成感受態(tài)的細菌細胞。 能使重組DNA分子穩(wěn)定存在于細胞中，通常的做法通過修飾改造，選擇某些限制性核酸內(nèi)切酶缺陷型細胞，即限制與修飾體系缺陷型細胞。 便于重組體的篩選，選擇與載體所含的選擇標

28、記互補匹配的受體細胞，例如重組子含有TetR基因，而受體細胞沒有TetR基因。 遺傳穩(wěn)定性高，容易擴大培養(yǎng)或發(fā)酵生長。 安全性高，無致病性，不會對外界環(huán)境造成污染。 選用內(nèi)源蛋白水解酶基因缺失的或含量低的細胞，利于外源基因表達產(chǎn)物在細胞內(nèi)的積累。 受體細胞不能干擾重組子遺傳密碼的正確閱讀與翻譯。 具有較好的轉(zhuǎn)譯后的加工機制，便于真核目的基因的高效表達。 在理論研究和生產(chǎn)實踐上有較高的應(yīng)用價值。 簡述真核生物前體mRNA轉(zhuǎn)錄加工過程的4種方式？ 5‘末端“戴帽”： 轉(zhuǎn)錄開始后，在先導(dǎo)片段的5‘末端加上7-甲基鳥苷酸，這個“戴帽”可以保護5‘末端不受堿性磷酸酶和核酸酶的消化，使mR

29、NA保持穩(wěn)定作用，此外，它還有利于mRNA與rRNA的結(jié)合。如果阻礙了mRNA戴帽，則mRNA的翻譯能力大大降低。線粒體和葉綠體中的mRNA轉(zhuǎn)錄物不發(fā)生戴帽。 3‘末端加尾：通過多聚腺苷合成酶（末端轉(zhuǎn)移酶）的催化作用，在mRNA 3‘末端加接上一串腺苷酸（100-200個）尾巴即Poly（A）。Poly（A）是mRNA由細胞核進入細胞質(zhì)所必須的，同時，大大提高了mRNA在細胞質(zhì)中的穩(wěn)定性。 切除內(nèi)含子：真核生物前體mRNA的內(nèi)含子5‘端和3‘端的剪接點各有一個共有序列，是剪接的識別位點（5′GT、3′AG）。只有剪接后的mRNA才能從細胞核進入細胞質(zhì)，否則不能穿過核孔。 甲基化：前體mR

30、NA上有的核苷酸出現(xiàn)甲基化修飾。這也是保持mRNA分子穩(wěn)定所需要的。 簡述在大腸桿菌中高效表達目的基因的策略？ 優(yōu)化表達載體的設(shè)計：組合強啟動子和強終止子，增加SD序列中與核糖體16SrRNA互補配對的堿基序列，調(diào)整SD序列與起始密碼ATG之間的距離及堿基種類。 提高稀有密碼子tRNA的表達作用：采用點突變等方法將外源基因中的稀有密碼子轉(zhuǎn)換成受體細胞高頻出現(xiàn)的同義密碼子。 提高外源基因mRNA的穩(wěn)定性：對于原核細胞，最好選擇一個RNase缺失的突變受體細胞或受體菌。對于真核細胞，要考慮增加mRNA的正確加工。此外，還可以通過改變mRNA的結(jié)構(gòu)，使其不容易被核酸酶識別，從而達到不被降解的目的。 提高表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性 優(yōu)化發(fā)酵過程：由于大腸桿菌在實驗室發(fā)酵罐的新陳代謝過程與大規(guī)模工業(yè)化發(fā)酵罐的新陳代謝是有差別的，在進行工業(yè)化生產(chǎn)時，工程菌株大規(guī)模培養(yǎng)的優(yōu)化設(shè)計和控制對外源基因的高效表達至關(guān)重要。