高中生物 專題五 DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)課件 新人教版選修1

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1、專題專題5 DNA5 DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)和蛋白質(zhì)技術(shù)考綱要求：考綱要求：1 1、蛋白質(zhì)的提取和分離、蛋白質(zhì)的提取和分離2 2、PCRPCR技術(shù)的基本操作和應(yīng)用技術(shù)的基本操作和應(yīng)用課題課題1 DNA1 DNA的粗提取與鑒定的粗提取與鑒定（一）提?。ㄒ唬┨崛NADNA的方法的方法DNADNA提取的原理提取的原理一、基礎(chǔ)知識一、基礎(chǔ)知識DNADNA在在NaCLNaCL溶液中的溶解度曲線溶液中的溶解度曲線（1 1）DNADNA在不同濃度在不同濃度NaCLNaCL中的中的溶溶 解度解度不同，不同，0.140.14mol/Lmol/L最小，最小， 2 2mol/Lmol/L的的NaClNaCl溶解溶解D

2、NADNA。加水。加水 稀釋降至稀釋降至0.140.14molmolL L時析出。時析出。 DNA DNA對酶、高溫和洗滌劑的耐受性對酶、高溫和洗滌劑的耐受性某些某些蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)溶于酒精，溶于酒精，DNADNA析出析出蛋白酶：蛋白酶：高高 溫：溫：洗滌劑：洗滌劑： DNA DNA不溶于不溶于酒精酒精溶液溶液水解水解蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受60608080，DNADNA在在8080以上才會變性以上才會變性瓦解瓦解細(xì)胞膜細(xì)胞膜，對，對DNADNA無影響。無影響。（二）（二）DNADNA鑒定的原理鑒定的原理沸水浴沸水浴條件下，條件下，DNADNA遇遇二苯胺二苯胺被染成被染成藍(lán)

3、藍(lán)色色二、實驗設(shè)計二、實驗設(shè)計（一）實驗材料的選?。ㄒ唬嶒灢牧系倪x?。ǘ┢扑榧?xì)胞，獲取含（二）破碎細(xì)胞，獲取含DNADNA的濾液的濾液選取選取DNADNA含量較高含量較高的生物材料的生物材料注意安全，環(huán)境保護(hù)，不用珍稀瀕危生物注意安全，環(huán)境保護(hù)，不用珍稀瀕危生物動物細(xì)胞動物細(xì)胞蒸餾水蒸餾水植物細(xì)胞植物細(xì)胞洗滌劑洗滌劑食鹽食鹽所用溶液所用溶液目的目的細(xì)胞吸水脹破細(xì)胞吸水脹破溶解細(xì)胞膜溶解細(xì)胞膜溶解溶解DNADNA（都要攪拌）（都要攪拌）提取的提取的DNADNA少少，看不到，看不到絲狀物絲狀物，鑒定，鑒定無無藍(lán)色藍(lán)色植物材料研磨不充分，結(jié)果會怎樣？植物材料研磨不充分，結(jié)果會怎樣？濾液中可能含有

4、哪些成分？濾液中可能含有哪些成分？核蛋白、多糖核蛋白、多糖和和RNARNA等雜質(zhì)等雜質(zhì)（三）除去濾液中的雜質(zhì)（三）除去濾液中的雜質(zhì)、方案一為什么反復(fù)地溶解與析出、方案一為什么反復(fù)地溶解與析出DNADNA，能夠去除，能夠去除 雜質(zhì)？雜質(zhì)？高鹽溶液高鹽溶液溶解溶解DNADNA 除除高鹽不溶高鹽不溶的雜質(zhì)的雜質(zhì)除除溶于低鹽溶于低鹽的雜質(zhì)的雜質(zhì)低鹽溶液低鹽溶液析出析出DNADNA、方案二與方案三的原理有什么不同？、方案二與方案三的原理有什么不同？方案三：用方案三：用DNADNA和蛋白質(zhì)對和蛋白質(zhì)對高溫高溫耐受性不同，耐受性不同， 蛋白質(zhì)變性，與蛋白質(zhì)變性，與DNADNA分離。分離。（四）（四）DNAD

5、NA的析出與鑒定的析出與鑒定析出析出加與濾液加與濾液等體積的冷等體積的冷酒精酒精( (體積分?jǐn)?shù)體積分?jǐn)?shù)9595) )，靜置，靜置2 23min3min，出現(xiàn)，出現(xiàn)白色絲狀物白色絲狀物。用。用玻璃棒玻璃棒沿一個方向沿一個方向攪拌，卷攪拌，卷起絲狀物，用濾紙吸干水分。起絲狀物，用濾紙吸干水分。將處理后的溶液過濾將處理后的溶液過濾方案二：方案二：蛋白酶蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白分解雜質(zhì)蛋白鑒定鑒定二苯胺、沸水浴、設(shè)置對照二苯胺、沸水浴、設(shè)置對照2 2、加入洗滌劑后，動作、加入洗滌劑后，動作輕緩輕緩、 柔和柔和，否則產(chǎn)生大量的泡，否則產(chǎn)生大量的泡 沫。加入酒精和玻璃棒攪沫。加入酒精和玻璃棒攪 拌時，動作拌時，

6、動作輕緩輕緩，以免加，以免加 劇劇DNADNA分子的斷裂。分子的斷裂。三、操作提示三、操作提示1 1、以血液為實驗材料時，加、以血液為實驗材料時，加 檸檬酸鈉檸檬酸鈉，防止血液凝固。，防止血液凝固。3 3、二苯胺試劑要、二苯胺試劑要現(xiàn)配現(xiàn)用現(xiàn)配現(xiàn)用。四、結(jié)果分析與評價四、結(jié)果分析與評價2 2、如果不呈現(xiàn)藍(lán)色，或?qū)嶒灲Y(jié)果不明顯，可能的、如果不呈現(xiàn)藍(lán)色，或?qū)嶒灲Y(jié)果不明顯，可能的 原因有哪些？原因有哪些？1 1、觀察你提取的、觀察你提取的DNADNA顏色，如果不是白色絲狀物，顏色，如果不是白色絲狀物， 說明什么？說明什么？雜質(zhì)較多雜質(zhì)較多核物質(zhì)沒充分釋放，如核物質(zhì)沒充分釋放，如研磨研磨不充分或不充分

7、或蒸餾水蒸餾水少少多次攪拌，目的、操作方法不同，要注意區(qū)分多次攪拌，目的、操作方法不同，要注意區(qū)分二苯胺二苯胺現(xiàn)配現(xiàn)用現(xiàn)配現(xiàn)用加入酒精時搖動或攪拌時過猛，加入酒精時搖動或攪拌時過猛，DNADNA被破壞；被破壞；蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)難度大。因易失活；空間結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)難度大。因易失活；空間結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)不同，無統(tǒng)一方法。不同，無統(tǒng)一方法。3 3、你認(rèn)為從細(xì)胞中提取某種特定的蛋白質(zhì)與提取、你認(rèn)為從細(xì)胞中提取某種特定的蛋白質(zhì)與提取DNADNA一樣容易嗎？一樣容易嗎？課題課題2 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片斷片斷體外迅速擴(kuò)增體外迅速擴(kuò)增DNADNA片段的技術(shù)片段的技術(shù)1 1、什么是多聚酶鏈?zhǔn)椒?/p>

8、應(yīng)、什么是多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCRPCR）？2 2、PCRPCR技術(shù)有何意義？技術(shù)有何意義？3 3、PCRPCR技術(shù)有哪些應(yīng)用？技術(shù)有哪些應(yīng)用？解決樣品中解決樣品中DNADNA含量太低含量太低而難以分析研究的問題而難以分析研究的問題遺傳疾病的診斷、刑偵破案、古生物學(xué)、遺傳疾病的診斷、刑偵破案、古生物學(xué)、基因克隆、基因克隆、DNADNA序列測定等。序列測定等。課題背景課題背景一、基礎(chǔ)知識一、基礎(chǔ)知識（一）（一）PCRPCR原理原理條件條件 組分組分 作用作用模板模板原料原料酶酶能量能量DNADNA兩條單鏈兩條單鏈四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸 解旋酶解旋酶DNADNA聚合酶聚合酶ATPATP一小段一

9、小段DNADNA或或RNARNA提供復(fù)制模板提供復(fù)制模板合成子鏈的原料合成子鏈的原料打開打開DNADNA雙螺旋雙螺旋催化合成催化合成DNADNA子鏈子鏈為解旋和合成子鏈供能為解旋和合成子鏈供能使使DNADNA聚合酶能夠從引物的聚合酶能夠從引物的33端開始連接脫氧核苷酸端開始連接脫氧核苷酸1 1、DNADNA分子復(fù)制需要哪些基本條件？有何作用？分子復(fù)制需要哪些基本條件？有何作用？ 引物引物2 2、DNADNA復(fù)制為什么需要引物？復(fù)制為什么需要引物？DNADNA聚合酶不能夠從頭開始合成聚合酶不能夠從頭開始合成DNADNA，而只能從，而只能從33端延伸端延伸DNADNA鏈。鏈。A AA AA AT

10、TT TT TG GG GG GG GC CC CC CC C55端：端：33端：端：55端端33端端反向平行反向平行DNADNA的羥基（的羥基（OHOH）末端）末端磷酸基團(tuán)的末端磷酸基團(tuán)的末端當(dāng)引物與當(dāng)引物與DNADNA母鏈通過堿基互補(bǔ)配對結(jié)合后，母鏈通過堿基互補(bǔ)配對結(jié)合后， DNADNA聚合聚合酶就能從酶就能從 開始延伸開始延伸DNADNA鏈，鏈， DNADNA的合成的合成方向總是從方向總是從 向向 延伸。延伸。引物的引物的33端端子鏈的子鏈的55端端33端端引物引物母鏈的母鏈的33端端緩慢冷卻復(fù)性（緩慢冷卻復(fù)性（55 55 ） 加熱變性（加熱變性（8080100100）3 3、雙鏈的解開

11、是、雙鏈的解開是DNADNA復(fù)制的前提，在體外如何打開復(fù)制的前提，在體外如何打開DNADNA 的雙螺旋結(jié)構(gòu)的雙螺旋結(jié)構(gòu)? ?利用利用DNADNA的熱變性原理，通過控制溫度來實現(xiàn)。的熱變性原理，通過控制溫度來實現(xiàn)。PCRPCR儀儀4 4、PCRPCR技術(shù)中如何解決高溫使酶失活的問題？技術(shù)中如何解決高溫使酶失活的問題？用耐高溫的用耐高溫的TaqDNATaqDNA聚合酶。聚合酶。5 5、PCRPCR反應(yīng)需要哪些條件？反應(yīng)需要哪些條件？緩沖溶液、緩沖溶液、DNADNA模板、兩種引物、四種脫氧核苷酸、模板、兩種引物、四種脫氧核苷酸、耐熱的耐熱的TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶，通過控制，通過控制溫度

12、溫度使使DNADNA復(fù)制在復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)行。（體外反復(fù)進(jìn)行。（PCRPCR儀實質(zhì)上是一臺能夠自動調(diào)儀實質(zhì)上是一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器）控溫度的儀器）（二）（二）PCRPCR的反應(yīng)過程的反應(yīng)過程1 1、PCRPCR的每次循環(huán)可以分為哪幾步？的每次循環(huán)可以分為哪幾步？變性變性：9595DNADNA解旋解旋復(fù)性復(fù)性：溫度下降到：溫度下降到5555，引物與，引物與DNADNA單鏈結(jié)合單鏈結(jié)合延伸延伸：7272左右，合成左右，合成DNADNA子鏈子鏈5 53 3G GG GT TC C3 35 5A AG GC CC C5 53 3A AG G引物引物5 53 3G GG G引物引物變性變性9595

13、復(fù)性復(fù)性5555延伸延伸72722 2、預(yù)變性有什么作用？、預(yù)變性有什么作用？進(jìn)行一次預(yù)變性，以便增加大分子模板進(jìn)行一次預(yù)變性，以便增加大分子模板DNADNA徹底徹底變性的概率。變性的概率。一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，從第二輪循環(huán)開始，一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物作為模板參與反應(yīng)，且引物上一次循環(huán)的產(chǎn)物作為模板參與反應(yīng)，且引物延伸而成的延伸而成的DNADNA單鏈會與引物單鏈會與引物結(jié)合，進(jìn)行結(jié)合，進(jìn)行DNADNA的的延伸。這樣，延伸。這樣，DNADNA聚合酶只能特異地復(fù)制處于兩聚合酶只能特異地復(fù)制處于兩個引物之間的個引物之間的DNADNA序列，使這段固定長度的序列序列

14、，使這段固定長度的序列呈指數(shù)擴(kuò)增。呈指數(shù)擴(kuò)增。二、實驗操作：二、實驗操作：用用3 3個個恒溫水浴鍋恒溫水浴鍋，溫度分別為，溫度分別為9494、5555和和7272，按要求，在按要求，在3 3個水浴鍋中來回轉(zhuǎn)移個水浴鍋中來回轉(zhuǎn)移PCRPCR反應(yīng)的微量離反應(yīng)的微量離心管即可。心管即可。1 1、微量離心管、微量離心管薄壁塑料管薄壁塑料管2 2、微量移液器、微量移液器3 3、如果沒有、如果沒有PCRPCR儀，如何怎樣來控制溫度？儀，如何怎樣來控制溫度？（反應(yīng)場所）（反應(yīng)場所）添加藥品的工具添加藥品的工具三、操作提示：三、操作提示：1 1、避免、避免外源外源DNADNA污染污染：所用儀器、緩沖液、蒸餾水

15、等：所用儀器、緩沖液、蒸餾水等 高壓滅菌。高壓滅菌。2 2、緩沖液和酶分裝成小份，、緩沖液和酶分裝成小份，2020低溫低溫保存。使用保存。使用 前，取出放在冰塊上緩慢融化。前，取出放在冰塊上緩慢融化。3 3、每添加一種反應(yīng)成分，更換一個移液器的槍頭。、每添加一種反應(yīng)成分，更換一個移液器的槍頭。 所有的成分都加入后，蓋嚴(yán)離心管的蓋子，用手所有的成分都加入后，蓋嚴(yán)離心管的蓋子，用手 指輕輕彈擊管的側(cè)壁，使反應(yīng)液混合均勻。混勻指輕輕彈擊管的側(cè)壁，使反應(yīng)液混合均勻?；靹?后離心處理，使反應(yīng)液集中在離心管底部。后離心處理，使反應(yīng)液集中在離心管底部。（一）理論上（一）理論上DNADNA擴(kuò)增數(shù)目的計算擴(kuò)增數(shù)

16、目的計算四、結(jié)果分析與評價：四、結(jié)果分析與評價：2 2 n na x 2 a x 2 n n（二）實驗中（二）實驗中DNADNA含量的測定含量的測定1 1、原理：、原理：DNADNA在在260260nmnm的紫外線波段有一強(qiáng)烈的吸收峰，的紫外線波段有一強(qiáng)烈的吸收峰，峰值的大小與峰值的大小與DNADNA的含量的含量有關(guān)?？梢酝ㄟ^計算有關(guān)?？梢酝ㄟ^計算DNADNA含量來評價擴(kuò)增的效果。含量來評價擴(kuò)增的效果。1 1、一條、一條DNADNA，復(fù)制，復(fù)制n n次，次， DNADNA為：為：2 2、a a條條DNADNA，復(fù)制，復(fù)制n n次，次， DNADNA為：為：2 2、過程、過程稀釋稀釋： PCRP

17、CR反應(yīng)液稀釋反應(yīng)液稀釋5050倍倍對照調(diào)零對照調(diào)零： 蒸餾水作蒸餾水作空白對照空白對照，在波長，在波長260nm260nm處，將處，將紫外分光光度計紫外分光光度計的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零。的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零。取取DNADNA稀釋液稀釋液100uL100uL至比色杯中，測定至比色杯中，測定260nm260nm處處的光吸收值的光吸收值測定：測定：計算計算DNADNA含量（含量（gg /ml /ml ）50 x (260nm50 x (260nm的讀數(shù)）的讀數(shù)）x x 稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)5050：在標(biāo)準(zhǔn)厚度為：在標(biāo)準(zhǔn)厚度為1 1cmcm的比色的比色杯中，杯中，ODOD260260為為1 1相當(dāng)于相當(dāng)于5050gg

18、 /ml/ml的雙鏈的雙鏈DNA.DNA.多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNADNA片段片段PCRPCR原理原理DNADNA的復(fù)制需要酶、原料、引物、模板的復(fù)制需要酶、原料、引物、模板DNADNA的變性、復(fù)性和延伸受溫度影響的變性、復(fù)性和延伸受溫度影響PCRPCR過程過程變性變性復(fù)性復(fù)性延伸延伸操作步驟操作步驟配制配制PCRPCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系移入離心管移入離心管放入放入PCRPCR儀儀設(shè)置循環(huán)程序設(shè)置循環(huán)程序DNADNA擴(kuò)增擴(kuò)增測定含量測定含量稀釋稀釋調(diào)零調(diào)零測定并讀數(shù)測定并讀數(shù)計算計算根據(jù)需要擴(kuò)增的目標(biāo)根據(jù)需要擴(kuò)增的目標(biāo)DNADNA的堿基序列來設(shè)計的。的堿基序列來設(shè)計的。引物的設(shè)計

19、需要豐富的分子生物學(xué)實驗經(jīng)驗引物的設(shè)計需要豐富的分子生物學(xué)實驗經(jīng)驗練習(xí)：如果要使用練習(xí)：如果要使用PCRPCR擴(kuò)增一段已知擴(kuò)增一段已知DNADNA序列，你打算序列，你打算 如何設(shè)計引物？如何設(shè)計引物？課題課題3 3 血紅蛋白的提取和分離血紅蛋白的提取和分離根據(jù)根據(jù)分子形狀、大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、分子形狀、大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)和對其他分子的親和力溶解度、吸附性質(zhì)和對其他分子的親和力等等，等等，可以用來分離不同種類的蛋白質(zhì)?？梢杂脕矸蛛x不同種類的蛋白質(zhì)。 一、基礎(chǔ)知識一、基礎(chǔ)知識（一）凝膠色譜法（一）凝膠色譜法2 2、凝膠：、凝膠：大多數(shù)是由大多數(shù)是由多糖多糖（如（如

20、葡聚糖葡聚糖或或瓊脂糖瓊脂糖）構(gòu)）構(gòu)成的微小的成的微小的多孔球體多孔球體，內(nèi)部有許多，內(nèi)部有許多貫穿的貫穿的通道通道。也稱也稱分配色譜法分配色譜法，是，是根據(jù)根據(jù)相對分子質(zhì)量的相對分子質(zhì)量的大小大小分離蛋白質(zhì)。分離蛋白質(zhì)。1 1、概念：、概念：3 3、原理：、原理： 相對分子量較相對分子量較小小的蛋白質(zhì)易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的的蛋白質(zhì)易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程通道，路程長長，移動速度，移動速度慢慢；相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離。相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離。相對分子量較相對分子量較大大的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在外移動，路程的通道，只能在外移動

21、，路程短短，移動速度，移動速度快快。4 4、凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理、凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)過程的動畫演示凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)過程的動畫演示 1 1、概念：、概念： 一定范圍內(nèi)，能抵制外界一定范圍內(nèi)，能抵制外界酸酸或或堿堿對溶液對溶液PHPH的影響，維持的影響，維持PHPH值值基本不變基本不變的混合溶液。的混合溶液。2 2、緩沖溶液的配制：、緩沖溶液的配制：1 12 2 種緩沖劑種緩沖劑溶于水中配制溶于水中配制模擬生物體內(nèi)的過程，保持模擬生物體內(nèi)的過程，保持體外溶液的體外溶液的PHPH與體內(nèi)與體內(nèi)PHPH基本一致基本一致，防止蛋白質(zhì)，防止蛋白質(zhì)失去活性。失去活性。3

22、3、意義：、意義：1 1、概念：、概念： 帶電粒子帶電粒子在在電場電場作用下發(fā)生作用下發(fā)生遷移遷移的過程的過程（三）電泳（三）電泳（二）緩沖溶液（二）緩沖溶液2 2、原理、原理電泳利用待分離樣品中各種分子電泳利用待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異帶電性質(zhì)的差異以及以及 分子大小分子大小、形狀不同形狀不同，使帶電分子，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速產(chǎn)生不同的遷移速 度度，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離。，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離。3 3、常用方法：、常用方法：聚丙烯酰胺凝膠電泳；瓊脂糖凝膠電泳。聚丙烯酰胺凝膠電泳；瓊脂糖凝膠電泳。許多生物大分子，如許多生物大分子，如多肽、核酸多肽、核酸等有可解離的

23、基團(tuán)，等有可解離的基團(tuán)， 在在一定的一定的PHPH下，這些基團(tuán)會下，這些基團(tuán)會帶上正電或負(fù)電帶上正電或負(fù)電。在在電場電場的作用下，這些帶電分子會向著的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷與其所帶電荷 相反相反的電極移動。的電極移動。紅細(xì)胞：紅細(xì)胞：血小板血小板血漿：血漿： 水分、水分、血漿蛋白、無機(jī)鹽、磷脂、葡萄糖血漿蛋白、無機(jī)鹽、磷脂、葡萄糖白細(xì)胞白細(xì)胞血紅蛋白（血紅蛋白（9090）血細(xì)胞血細(xì)胞2 2、血液、血液1 1、用豬、牛、羊的紅細(xì)胞提取血紅蛋白的原因？、用豬、牛、羊的紅細(xì)胞提取血紅蛋白的原因？哺乳動物成熟紅細(xì)胞無核無器，血紅蛋白含量豐富哺乳動物成熟紅細(xì)胞無核無器，血紅蛋白含量豐富二

24、、實驗操作二、實驗操作四個亞鐵血紅素基團(tuán)四個亞鐵血紅素基團(tuán)特點：特點： 每個肽鏈環(huán)繞一個每個肽鏈環(huán)繞一個亞鐵血紅素基團(tuán)亞鐵血紅素基團(tuán)，此基團(tuán)可攜帶一分子氧或一分子二氧此基團(tuán)可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳，血紅蛋白有化碳，血紅蛋白有血紅素血紅素呈紅色。呈紅色。兩條兩條肽鏈、肽鏈、 兩條兩條一肽鏈一肽鏈組成：組成：3 3、血紅蛋白由哪些成分組成？有什么特點？、血紅蛋白由哪些成分組成？有什么特點？樣品處理樣品處理粗分離粗分離純化純化純度鑒定純度鑒定5 5、蛋白質(zhì)的提取和分離包括哪幾步？、蛋白質(zhì)的提取和分離包括哪幾步？4 4、與其他真核細(xì)胞相比，紅細(xì)胞有什么特點？、與其他真核細(xì)胞相比，紅細(xì)胞有什么特點

25、？ 這一特點對你進(jìn)行蛋白質(zhì)得分離有什么意義？這一特點對你進(jìn)行蛋白質(zhì)得分離有什么意義？紅細(xì)胞中的紅細(xì)胞中的血紅蛋白是血紅蛋白是有色蛋白有色蛋白，分離時可觀察，分離時可觀察顏色判斷什么時候收集洗脫液。使分離過程非常顏色判斷什么時候收集洗脫液。使分離過程非常直觀，簡化了實驗操作。直觀，簡化了實驗操作。 （一）樣品處理及粗分離（一）樣品處理及粗分離紅細(xì)胞紅細(xì)胞的洗滌的洗滌目的：目的：去除雜蛋白去除雜蛋白過程：過程：結(jié)果：結(jié)果：上清液中無黃色，表明洗滌干凈上清液中無黃色，表明洗滌干凈血紅蛋白的釋放：血紅蛋白的釋放： 加蒸餾水、甲苯加蒸餾水、甲苯 ，磁力攪拌器攪拌，磁力攪拌器攪拌血樣離心、血樣離心、生理鹽

26、水洗滌紅細(xì)胞、生理鹽水洗滌紅細(xì)胞、離心、離心、 重復(fù)洗滌三次重復(fù)洗滌三次思考思考分離血紅蛋白溶液：分離血紅蛋白溶液：離心管內(nèi)離心管內(nèi)離心離心透析透析過程：過程：原理：原理：血紅蛋白溶液裝入血紅蛋白溶液裝入透析袋透析袋，透析袋放入，透析袋放入磷酸緩沖液透析磷酸緩沖液透析目的：目的：除去樣品中分子小的雜質(zhì)除去樣品中分子小的雜質(zhì)透析袋能使小分子自由進(jìn)出，而大分子透析袋能使小分子自由進(jìn)出，而大分子保留在袋內(nèi)。保留在袋內(nèi)。（粗分離）（粗分離）吸出吸出血漿、血漿、思考思考（二）凝膠色譜操作（純化）：（二）凝膠色譜操作（純化）：2 2、凝膠色譜柱的裝填、凝膠色譜柱的裝填裝填完畢，立即裝填完畢，立即連接連接緩

27、沖液洗脫瓶緩沖液洗脫瓶，在，在50cm50cm高的高的操作壓操作壓下，用下，用磷酸緩沖液磷酸緩沖液充分充分洗滌平衡洗滌平衡1212小時。小時。使凝膠裝填使凝膠裝填緊密緊密。1 1、凝膠色譜柱的、凝膠色譜柱的制作制作：取凝膠浸泡于取凝膠浸泡于蒸餾水蒸餾水或或緩沖液緩沖液中充分中充分溶脹溶脹后，后，配成配成凝膠懸浮液凝膠懸浮液。填入色譜柱內(nèi)填入色譜柱內(nèi)3 3、樣品加入與洗脫、樣品加入與洗脫待待紅色的蛋白質(zhì)紅色的蛋白質(zhì)接近色譜接近色譜柱底端時，用試管收集流柱底端時，用試管收集流出液，每出液，每5ml5ml收集一試管，收集一試管，連續(xù)收集連續(xù)收集收集：收集：洗脫洗脫調(diào)節(jié)緩沖液面調(diào)節(jié)緩沖液面與凝膠面平齊

28、與凝膠面平齊滴加透析樣品滴加透析樣品樣品滲入凝膠床樣品滲入凝膠床加加磷酸緩沖液磷酸緩沖液到適當(dāng)高度，到適當(dāng)高度，連接連接緩沖液洗脫瓶緩沖液洗脫瓶，洗脫。，洗脫。2 2、如何檢測血紅蛋白的分離是否成功、如何檢測血紅蛋白的分離是否成功？紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨洗脫液緩慢流出紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨洗脫液緩慢流出血紅蛋白處在穩(wěn)定的血紅蛋白處在穩(wěn)定的pHpH內(nèi)，維持結(jié)構(gòu)和功能。內(nèi)，維持結(jié)構(gòu)和功能。1 1、在整個過程中不斷用磷酸緩沖液處理的目的是？、在整個過程中不斷用磷酸緩沖液處理的目的是？思考：思考：3 3、你能描繪血紅蛋白分離的完整過程嗎？、你能描繪血紅蛋白分離的完整過程嗎？（1 1）樣品處

29、理：）樣品處理：（4 4）純度鑒定：）純度鑒定：（3 3）純化：）純化：（2 2）粗分離：）粗分離：聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定。聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定。凝膠色譜法除去分子量較大的雜質(zhì)蛋白凝膠色譜法除去分子量較大的雜質(zhì)蛋白透析除去分子量較小的雜質(zhì)。透析除去分子量較小的雜質(zhì)。包括洗滌紅細(xì)胞；血紅蛋白的釋放；包括洗滌紅細(xì)胞；血紅蛋白的釋放；離心；透析離心；透析如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。蛋白的原因。3 3、血液樣品離心后如果分層不明顯，可能的原因是什么血液樣品離心后如果分層不明顯，可能的原因是什么？1 1、加入什么可以防止血液凝

30、固？、加入什么可以防止血液凝固？加入檸檬酸鈉加入檸檬酸鈉思考：思考：4 4、如果離心速度過高和時間過長，會有什么影響？、如果離心速度過高和時間過長，會有什么影響？如果離心速度過高和時間過長，會使白細(xì)胞和淋巴細(xì)如果離心速度過高和時間過長，會使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。蛋白的提取純度。2 2、可以用蒸餾水代替生理鹽水嗎？、可以用蒸餾水代替生理鹽水嗎？不可以。用蒸餾水使細(xì)胞提前吸水漲破，使血紅蛋不可以。用蒸餾水使細(xì)胞提前吸水漲破，使血紅蛋白和雜質(zhì)血漿蛋白混在一起，加大了分離的難度。白和雜質(zhì)血漿蛋白混在一起

31、，加大了分離的難度。1 1、加甲苯的目的是什么？、加甲苯的目的是什么？思考：思考：細(xì)胞膜的磷脂細(xì)胞膜的磷脂易溶于甲苯，甲苯能易溶于甲苯，甲苯能加速紅細(xì)胞加速紅細(xì)胞破裂并釋放出血紅蛋白破裂并釋放出血紅蛋白。無色透明無色透明有機(jī)溶劑（甲苯層）有機(jī)溶劑（甲苯層）暗紅色暗紅色紅細(xì)胞破碎物沉淀紅細(xì)胞破碎物沉淀紅色透明液體紅色透明液體血紅蛋白的水溶液層血紅蛋白的水溶液層白色薄層固體白色薄層固體脂溶性物質(zhì)的沉淀層脂溶性物質(zhì)的沉淀層用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。透析過程動畫演示透析過程動畫演示柱底部的制作：柱底部的制作：尼龍網(wǎng)尼龍網(wǎng)100100目尼龍紗目尼龍紗1 1、從凝膠色譜的分離原理分析為什么凝膠、從凝膠色譜的分離原理分析為什么凝膠 的裝填要緊密、均勻？的裝填要緊密、均勻？ 在色譜柱內(nèi)形成無效的空隙，使本該進(jìn)在色譜柱內(nèi)形成無效的空隙，使本該進(jìn)入凝膠內(nèi)部的樣品分子從這些空隙中通入凝膠內(nèi)部的樣品分子從這些空隙中通過，攪亂洗脫液的流動次序，影響分離過，攪亂洗脫液的流動次序，影響分離的效果。的效果。 2 2、裝填凝膠柱時為什么不得有氣泡存在？、裝填凝膠柱時為什么不得有氣泡存在？5 50 0c cm m攪亂洗脫次序，降低分離效果。攪亂洗脫次序，降低分離效果。