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1、 DNA的連接與轉(zhuǎn)化的連接與轉(zhuǎn)化1.分子的體外連接 2的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的篩選的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的篩選一實驗?zāi)康募氨尘耙粚嶒災(zāi)康募氨尘?當(dāng)我們已經(jīng)獲得目的基因片段，選擇好適當(dāng)?shù)目寺。ɑ虮磉_(dá)，轉(zhuǎn)化）質(zhì)粒載體， 并確定重組方案后，下面要進行的就是片段之間的體外連接，從而獲得重組子。 此重組子可轉(zhuǎn)入相應(yīng)的宿主菌中用于對目的基因的擴增以及目的基因表達(dá)（如現(xiàn)代基因工程藥物的生產(chǎn)），還可用于序列分析和轉(zhuǎn)基因等重要生物技術(shù)的研究中。1、分子的體外連接 分子的體外連接就是在一定條件下， 由連接酶催化兩個雙鏈片段組鄰的端磷酸與端羥基之間形成磷酸酸脂鍵的生物化學(xué)過程， 分子的連接是在酶切反應(yīng)獲得同種酶互補序列基礎(chǔ)上進行的
2、。連接反應(yīng)中值得注意的幾個問題： 1.連接酶 常用的連接酶有兩種： (1)來自大腸桿菌的連接酶 (2)來自噬菌體的連接酶。 二者的作用機理類似。連接酶作用機制 連接酶作用分三步： 連接酶與輔助因子形成酶復(fù)合物。 酶復(fù)合物結(jié)合到具有磷酸基和羥基切口的上，使腺苷化。 產(chǎn)生一個新的磷酸二酯鍵，把缺口封起來.2.連接反應(yīng)的溫度 連接酶的最適反應(yīng)溫度為， 但在此溫度下， 粘性末端的氫鍵結(jié)合很不穩(wěn)定，折衷方法是過夜。3. DNA的平未端和粘性末端 由于內(nèi)切酶產(chǎn)生的DNA末端有平未端和粘性末端，因而連接反應(yīng)中就有平未端連接和粘性末端連接。 二者連接效率不同。 粘性末端效率高，因而在底物濃度，酶濃度選擇上是有
3、差異的，4.堿性磷酸酶處理質(zhì)粒載體 為了提高連接效率，一般采取提高的濃度，增加重組子比例。這樣就會出現(xiàn)自生連接問題， 為此通常選擇對質(zhì)粒載體用堿性磷酸酶處理，除去其末端的磷酸基，防止環(huán)化， 通過接反應(yīng)后形成的缺口可在轉(zhuǎn)化細(xì)胞后得以修復(fù)。見下圖。5.連接反應(yīng)的檢測 連接反應(yīng)成功與否，最后的檢測要通過下一步實驗，轉(zhuǎn)化宿主菌， 陽性克隆的篩選來確定。 我們下面的實驗從粘性末端為例操作。 二、實驗試劑二、實驗試劑 純化后的酶切質(zhì)粒載體和目的基因。 連接酶buffer 200mM Tris-HCl(pH7.6) 50mM MgCl2 50mM 二硫芐糖醇 500l/ml BSA 連接酶 5mM ATP三
4、實驗方法三實驗方法分子的體外連接在無菌Eppendorf管中加入以下溶液：a. 0.1g質(zhì)粒載體，倍分子的外源。b. 加無菌水至7.5l，于加溫分鐘使重新退火的粘端解鏈， 將混合物冷卻到。c. 加入：連接酶buffer 1l連接酶 0.1Weiss5mM ATP 1l蓋上管蓋，充分混勻，臺式離心扣上離心秒。下過夜連接反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后于保存。四結(jié)果與分析四結(jié)果與分析 電泳檢查連接結(jié)果 如何判斷連接效果的成功性？問題與討論： 簡述連接酶作用機理。 簡述一個完整外源的克隆過程。 連接反應(yīng)中應(yīng)注意些什么問題及如何提高連接效率。2的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的篩選的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的篩選 一實驗?zāi)康募氨尘耙粚嶒災(zāi)康募氨尘?/p>
5、 體外通過基因工程手段所構(gòu)建的含目的基因的重組質(zhì)粒，選用轉(zhuǎn)化和篩選技術(shù)， 可獲得含重組的陽性克隆。在此陽性克隆中，可在生物體系中大量擴增，繁殖， 保存以及表達(dá)目的基因的產(chǎn)物，這是體外擴增所不能替代的。配合重組技術(shù)，所獲得的，不同目的需要的陽性菌株已廣泛應(yīng)用于科研，醫(yī)藥生產(chǎn)和生物發(fā)酵等領(lǐng)域。本實驗由二個方面組成: 1. 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌。 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化不同細(xì)菌有不同的轉(zhuǎn)化效率，轉(zhuǎn)化效率的高低與實驗的成敗直接相關(guān)， 通常轉(zhuǎn)化效率可達(dá)轉(zhuǎn)化子/g DNA。 獲得高轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵是感受態(tài)體菌的制備。 所謂感受態(tài)， 就是細(xì)菌吸收轉(zhuǎn)化因子的生理狀態(tài)。 關(guān)于感受態(tài)的本質(zhì)與存在，說法很多， 目前主要有兩種假說： 局
6、部原生質(zhì)體化假說感受態(tài)細(xì)胞的表面形成一種能接受的酶位點， 使分子能進入細(xì)胞。制備感受態(tài)細(xì)胞 現(xiàn)在制備感受態(tài)細(xì)胞通常用CaCl2處理，在低溫中與外來分子相混合. 分子轉(zhuǎn)化分以下幾步: 吸附雙鏈分子吸附于受體菌表面； 轉(zhuǎn)入雙鏈分子解鏈。一條鏈進入受體菌，另一條降解； 自穩(wěn)外源質(zhì)粒分子在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制成雙鏈； 表達(dá)一供體基因隨同復(fù)制子同時復(fù)制，分裂， 轉(zhuǎn)錄翻譯。2.重組子的篩選 這和受體菌：質(zhì)粒的選擇相關(guān)， 原則上要注意： 受體菌必須是限制與修飾系統(tǒng)缺陷的菌株； 根據(jù)質(zhì)?；蛐秃褪荏w菌基因型互補原則而定。 重組子的篩選方法常用的有兩種方法：抗生素篩選法 菌株為某種抗生缺陷型， 而質(zhì)粒上帶有該抗性基因（如
7、氨芐青霉素， 卡拉霉素等）這樣只有轉(zhuǎn)化子才能在含該抗生素的培養(yǎng)基上長出。本實驗利用抗生篩選轉(zhuǎn)化子?；パa法 現(xiàn)在使用的許多載體（如系列）有含有一個大腸桿菌的短區(qū)段，其中含有半乳糖苷酸基因（lacZ）的調(diào)控序列和頭個氨基酸偏碼區(qū)。這個偏碼區(qū)中插入一個多克隆位點。 受體菌則含編碼半乳糖苷酶端的序列。當(dāng)外源基因插入時，二者溶為一體后，有半乳糖苷酶表達(dá)， 在生色底物溴氯吲哚半乳糖苷（x-gal）培養(yǎng)基中形成蘭色菌落。 而當(dāng)有外源基因插入到多克隆原點，從而造成插入失活，而使lacZ基因不表達(dá)而形成白色菌斑。 通過顏色不同而區(qū)分重組子和非重組子。二、實驗試劑二、實驗試劑 培養(yǎng)基 質(zhì)粒（含Amp抗生基因），受
8、體菌 CaCl2 0.1M Amp 三實驗方法三實驗方法一、感受態(tài)細(xì)胞制備將宿主菌在瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線，培養(yǎng)小時。挑取單菌落轉(zhuǎn)入 培養(yǎng)基錐瓶中，振蕩過夜。從中取菌液轉(zhuǎn)入 培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)小時， 測達(dá)。培養(yǎng)物于冰上分鐘。轉(zhuǎn)入離心管，于下離心分鐘。棄上清，倒置離心管分鐘，流盡剩余殘液然后加入10ml用冰預(yù)冷的 0. 1mol/L CaCl2，置冰上分鐘。4,000rpm 4離心分鐘，棄上清。加入2ml，0.1M CaCl2懸浮細(xì)胞，于過夜。二、轉(zhuǎn)化 在1.5ml Eppendorf管中加入l感受態(tài)細(xì)胞和l 40ng DNA溶液， 溫和混勻，于冰上分鐘。 于水浴秒。 冰浴分鐘。 加入l 液體培養(yǎng)基 分鐘。 取l涂布于含Amp(50g/ml)瓊脂糖平皿， 培養(yǎng)小時，觀察結(jié)果。四結(jié)果與分析討論四結(jié)果與分析討論 計算轉(zhuǎn)化率。 根據(jù)轉(zhuǎn)化率和陰性對照分析實驗結(jié)果。 問題與討論： 根據(jù)本實驗認(rèn)為影響轉(zhuǎn)化率的因素有哪些？ 抗性法篩選和互補篩選原理是什么？
生物實驗： dna連接與轉(zhuǎn)化
