【基金標書】2010CB530400-基于“腎藏精”的臟象理論基礎(chǔ)研究

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1項目名稱： 基于“腎藏精”的臟象理論基礎(chǔ)研究首席科學(xué)家： 王擁軍 上海中醫(yī)藥大學(xué)起止年限： 2010 年 1 月-2014 年 8 月依托部門： 國家中醫(yī)藥管理局 上海市科委2一、研究內(nèi)容1.“腎藏精”理論溯源和知識管理平臺建立 對中醫(yī)“腎藏精”的古今文獻進行系統(tǒng)全面地梳理歸納，從生理、病理、診斷、治療等方面進行理論分析；利用知識工程與知識管理的理論和方法,建立“腎藏精”臟象理論知識管理平臺。 2.與腎相關(guān)疾病證候演變規(guī)律和機制研究 通過臨床流行病學(xué)研究與腎相關(guān)疾病中醫(yī)證型的分布特征，明確腎虛證在疾病中的分布規(guī)律；著重進行不孕不育（女子不孕癥和男子不育癥）、骨質(zhì)疏松癥、老年性癡呆和障礙性貧血（再生障礙性貧血、珠蛋白生成障礙性貧血）等疾病的療效機制和物質(zhì)基礎(chǔ)的研究。 3．“腎藏精”與干細胞和NEI網(wǎng)絡(luò)功能相關(guān)性現(xiàn)代生物學(xué)機制研究 在補腎填精法指導(dǎo)下，觀察相關(guān)方藥對“腎精虧虛”、“命門火衰”及“自然衰老”模型動物的作用機制以及對iPS誘導(dǎo)的四種成體干細胞（生殖干細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞、神經(jīng)干細胞、造血干細胞）增殖、分化功能的影響，探索腎精命火的生理狀態(tài)和病理轉(zhuǎn)化規(guī)律。4．從腎論治效應(yīng)驗證研究 通過補腎填精法治療，從?。ㄗC）探因，以效證因，觀察“腎精虧虛”型不孕不育、骨質(zhì)疏松癥、老年性癡呆和障礙性貧血患者相關(guān)干細胞和NEI網(wǎng)絡(luò)的變化，綜合研究“腎藏精”在“腎主生殖”、“腎主骨”、“腎生髓”、“腦為髓之?！崩碚撝械淖饔?。 5. “腎藏精”臟象理論創(chuàng)新研究 圍繞統(tǒng)一的目標和假說，對上述研究結(jié)果進行綜合分析，建立“腎藏精”臟象理論與干細胞和NEI網(wǎng)絡(luò)關(guān)系的新學(xué)說。3二、預(yù)期目標(一)總體目標 1．闡明“腎藏精”的現(xiàn)代生物學(xué)基礎(chǔ)，創(chuàng)新和發(fā)展中醫(yī)臟象理論。 2. 揭示相關(guān)疾病從腎論治臨床療效產(chǎn)生的內(nèi)在規(guī)律和物質(zhì)基礎(chǔ)。 3．揭示“腎藏精”的科學(xué)實質(zhì)，創(chuàng)新和發(fā)展中醫(yī)臟象理論。 4．以“腎藏精”理論研究為示范，建立中醫(yī)臟象理論研究的創(chuàng)新方法學(xué)體系。 5．形成一支多學(xué)科交叉合作的具有較強國際競爭力的現(xiàn)代中醫(yī)科研隊伍。 （二）五年預(yù)期目標 1．在中醫(yī)臟象理論創(chuàng)新和中醫(yī)基本理論研究的方法學(xué)方面取得突破。（1）完成“腎藏精”臟象理論文獻和臨床流行病學(xué)研究，建立數(shù)據(jù)信息庫，構(gòu)建知識管理平臺。 （2）基本闡明“腎精”與干細胞、“命火”與NEI網(wǎng)絡(luò)以及“腎藏精”與干細胞和NEI網(wǎng)絡(luò)之間的關(guān)系,實現(xiàn)“腎藏精”理論的現(xiàn)代科學(xué)知識創(chuàng)新。 （3）基本闡明“腎精虧虛”、“命門火衰”相關(guān)疾病與干細胞和NEI網(wǎng)絡(luò)功能失調(diào)的相關(guān)性以及“從腎論治”的規(guī)律性。 （4）在中醫(yī)臟象理論研究方法學(xué)方面取得突破，實現(xiàn)中醫(yī)臟象理論的現(xiàn)代創(chuàng)新。2．在國際有較大影響力的學(xué)術(shù)期刊上發(fā)表中醫(yī)“腎藏精”相關(guān)的研究論文。發(fā)表5～6篇研究水平高、影響力大的中醫(yī)理論研究論文。在國內(nèi)核心期刊發(fā)表論文130～160篇，發(fā)表SCI收錄論文30～50篇。出版專著4～5部，申報國家發(fā)明專利6～8項。 3．形成多學(xué)科構(gòu)成的中醫(yī)藥基礎(chǔ)理論研究隊伍，推動中醫(yī)相關(guān)學(xué)科的整體發(fā)展。預(yù)期培養(yǎng)博士后15名，博士研究生60名，碩士研究生70名；培養(yǎng)高水平領(lǐng)軍人才2～3名。 4三、研究方案（一） 總體思路 本項目擬采用現(xiàn)代生物學(xué)方法，結(jié)合臨床實踐，深入開展“腎藏精”臟象理論的基礎(chǔ)研究。研究的思路是，準確把握中醫(yī)臟象理論的實質(zhì)，在對中醫(yī)學(xué)和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)文獻理論、基礎(chǔ)實驗和臨床研究進行深入審視的基礎(chǔ)上，提出科學(xué)假說，圍繞假說開展深入的探索和驗證，從而得出科學(xué)的認識和結(jié)論。 腎藏先天之精，構(gòu)成胚胎的原始物質(zhì)（“兩神相搏，合而為形，常先身生，是謂精”）；腎也藏后天之精，維持生命活動（“腎者主水，受五臟六腑之精而藏之”）。胚胎干細胞是早期胚胎中具備發(fā)育為各種組織和器官能力的全能細胞。因此，腎所藏之“精”與胚胎干細胞以及成體干細胞恰相對應(yīng)。干細胞增殖與分化影響生命全過程，其平時處于沉默休眠狀態(tài)，在人體修復(fù)損傷時被喚醒與激活，發(fā)揮其功能，印證了“腎者，主蟄，封藏之本，精之處也”的論述。 命門之火集中體現(xiàn)為腎陽的功能。前期研究工作發(fā)現(xiàn)腎陽（命火）涵蓋了全身的神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫（NEI）網(wǎng)絡(luò)，體現(xiàn)為命門之火周游全身的溫煦與推動作用。NEI網(wǎng)絡(luò)確有參與促進干細胞的作用，溫腎藥可喚醒并激活干細胞以修復(fù)病損組織。 據(jù)此，本項目提出以下科學(xué)假說：腎精的物質(zhì)基礎(chǔ)，主要表現(xiàn)在干細胞；命火的功能基礎(chǔ)，主要體現(xiàn)在NEI網(wǎng)絡(luò)。腎藏精是干細胞與NEI網(wǎng)絡(luò)功能的綜合體現(xiàn)；補腎填精法治療腎精虧虛、命門火衰病證，主要是通過調(diào)控干細胞和NEI網(wǎng)絡(luò)功能而實現(xiàn)的。 （二） 技術(shù)途徑 第一階段：通過文獻檢索、數(shù)據(jù)挖掘，建立中醫(yī)“腎藏精”理論數(shù)據(jù)信息庫和知識管理平臺。 第二階段：通過臨床流行病學(xué)研究，設(shè)計統(tǒng)一調(diào)查問卷，研究不孕不育、骨質(zhì)疏松癥、老年性癡呆和障礙性貧血的中醫(yī)證型的頻率分布。數(shù)據(jù)資源統(tǒng)一納入數(shù)據(jù)信息庫，進行綜合統(tǒng)計分析，進一步支撐實驗基礎(chǔ)、臨床驗證和理論創(chuàng)新研究。 第三階段：“腎藏精”與干細胞和NEI網(wǎng)絡(luò)功能相關(guān)性研究。觀察補腎填精方藥對“腎精虧虛、命門火衰”及“自然衰老”模型動物的作用機制以及對iPS誘導(dǎo)的四種成體干細胞功能的影響，并為臨床驗證提供檢測指標依據(jù)。 第四階段：從腎論治效應(yīng)機制研究。采用從?。ㄗC）探因和以效證因的方法，驗證補腎填精法治療與腎相關(guān)疾病的療效機制，探索干細胞和NEI網(wǎng)絡(luò)在“從腎5論治”相關(guān)疾病中的作用規(guī)律。 第五階段：進行相關(guān)疾病從腎論治臨床療效的物質(zhì)基礎(chǔ)研究，揭示疾病的生理學(xué)、病理學(xué)和現(xiàn)代生物學(xué)機制。 第六階段：“腎藏精”臟象理論創(chuàng)新研究。圍繞本項目的總體目標和科學(xué)假說，解決所提出的關(guān)鍵科學(xué)問題，完善與創(chuàng)新“腎藏精”臟象理論。并總結(jié)本項目研究的思路，建立臟象理論研究的方法學(xué)體系。67（三）創(chuàng)新點與特色 1．理論創(chuàng)新 （1）提出腎精的物質(zhì)基礎(chǔ)主要表現(xiàn)在干細胞；命火的功能基礎(chǔ)主要體現(xiàn)在NEI網(wǎng)絡(luò)?！澳I藏精”是干細胞與NEI網(wǎng)絡(luò)功能的綜合體現(xiàn)；補腎填精法治療腎精虧虛、命門8火衰病證，主要是通過調(diào)控干細胞和NEI網(wǎng)絡(luò)功能而實現(xiàn)的。 （2）從“腎主生殖”、“腎主骨”、“腎生髓”、“腦為髓之?！钡确矫孢M一步證明“腎藏精”理論的實質(zhì)，發(fā)展中醫(yī)臟象理論。 2．應(yīng)用創(chuàng)新 （1）建立了“腎藏精“數(shù)據(jù)信息庫，構(gòu)建知識管理平臺，形成面向基礎(chǔ)和臨床科研工作的軟件系統(tǒng)。 （2）突出基礎(chǔ)理論研究與臨床實踐的緊密結(jié)合的中醫(yī)學(xué)特征，將“腎藏精”理論與臨床的不孕不育、骨質(zhì)疏松癥、老年性癡呆和障礙性貧血的辨證、診斷、治療緊密相連并發(fā)揮指導(dǎo)作用。 3．方法創(chuàng)新 （1）應(yīng)用語言工具、抽象模型工具和數(shù)學(xué)工具研究“腎藏精”理論的科學(xué)內(nèi)涵；全面構(gòu)建“腎藏精”臟象理論數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)平臺。 （2）多學(xué)科交叉與融合，系統(tǒng)研究“腎藏精”理論及其與不孕不育、骨質(zhì)疏松癥、老年性癡呆和障礙性貧血的內(nèi)在關(guān)系，為中醫(yī)臟象理論研究提供新思路，創(chuàng)立中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究的新模式。 （四）可行性分析 1．有中醫(yī)經(jīng)典理論支持與長期臨床實踐經(jīng)驗基礎(chǔ) 中醫(yī)“腎藏精”理論在《內(nèi)經(jīng)》中已有記載，是中醫(yī)學(xué)的原創(chuàng)性理論，在長期的臨床實踐中得到廣泛證實，并不斷發(fā)展。各家學(xué)說都肯定“腎藏精”理論，并且在醫(yī)書中也有大量從腎論治“不孕”“精?！保ú辉胁挥?、“骨痹”“骨痿”（骨質(zhì)疏松癥） 、“呆病”“癲癥”“善忘”（老年性癡呆）、“虛勞”“血虧”（珠蛋白生成障礙性貧血、再生障礙性貧血）等醫(yī)案記載。 “腎藏精”理論在難治性、復(fù)雜性疾病的治療中發(fā)揮了十分重要的作用，這為本項目研究取得重大突破提供了雄厚的理論和實踐基礎(chǔ)。從難治性、復(fù)雜性疾病入手，在揭示“腎藏精”內(nèi)在調(diào)控機制的基礎(chǔ)上，提出解決多環(huán)節(jié)復(fù)雜病理過程的治療理論，將會實現(xiàn)中醫(yī)臟象理論方法學(xué)研究的突破。 2．現(xiàn)代生物學(xué)研究方法可行 對中醫(yī)“腎藏精”理論的總結(jié)、闡釋與再挖掘離不開現(xiàn)代科技手段，隨著現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)突飛猛進的發(fā)展以及觀念的更新，多學(xué)科交叉、融合的實踐，越來越多的現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)在“腎藏精”等中醫(yī)理論研究中得到應(yīng)用。 國際對干細胞研究的關(guān)注也為本項目帶來很大機遇，國內(nèi)外研究也認識到“腎藏精”的部分生物學(xué)基礎(chǔ)。本項目中沈自尹院士領(lǐng)導(dǎo)的課題組以“NEI網(wǎng)絡(luò)”學(xué)說為切入點，幾十年的工9作基礎(chǔ)揭示了中醫(yī)“腎”臟象理論的現(xiàn)代科學(xué)內(nèi)涵，近年又證實補腎藥（淫羊藿總黃酮）能夠促進腎上腺皮質(zhì)外側(cè)區(qū)域干細胞的增殖，并能使皮質(zhì)干細胞向腎上腺皮質(zhì)功能成熟層遷移。這些研究有力地支持了本項目提出的科學(xué)假說，有力地推動了中醫(yī)“腎藏精”理論科學(xué)實質(zhì)的研究。3．研究隊伍多學(xué)科交叉，科研力量雄厚 有多個全國中醫(yī)臨床研究研究基地、國家重點學(xué)科、國家重點實驗室、國家工程技術(shù)中心、國家中醫(yī)藥管理局重點研究室、國家中醫(yī)藥管理局重點專病?？?、國家中醫(yī)藥管理局三級實驗室等支撐。前期研究基礎(chǔ)扎實，團隊主要成員是本領(lǐng)域國內(nèi)外著名學(xué)者，為本項目的研究奠定了良好的前期工作基礎(chǔ)。 項目的承擔(dān)單位均在中醫(yī)臟象相關(guān)理論領(lǐng)域和難治性、復(fù)雜性疾病的中醫(yī)藥防治領(lǐng)域進行過深入的研究，具有深厚的前期工作基礎(chǔ)和完善的儀器設(shè)備及技術(shù)條件。 項目研究隊伍由老中青三代優(yōu)秀科學(xué)家組成，是一支多學(xué)科交叉、結(jié)構(gòu)合理、具有國際競爭力的創(chuàng)新團隊。各課題負責(zé)人及學(xué)術(shù)骨干是包括中國科學(xué)院院士在內(nèi)的相關(guān)領(lǐng)域資深專家，具有豐富的科研經(jīng)驗和理論與臨床實踐，有承擔(dān)國家重點、重大項目的實踐經(jīng)驗，這為本項目研究取得重大突破提供了深厚的研究基礎(chǔ)及堅實的保障。 王擁軍教授作為擬申請項目的首席科學(xué)家，是國家杰出青年科學(xué)基金獲得者，國家衛(wèi)生部有突出貢獻中青年專家，國家教育部新世紀優(yōu)秀人才，國家人事部新世紀百千萬人才工程國家級人選，全國第二屆百名杰出青年中醫(yī)。擔(dān)任國家科技部科技成果、國家自然科學(xué)基金委員會（通訊和會議評審）、國家教育部、國家科技部、國家衛(wèi)生部評審專家以及國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科技咨詢與評審專家。具有較好的總體組織和協(xié)調(diào)能力，具有宏觀的科學(xué)研究視野。 （五）課題設(shè)置課題1 ： “腎藏精”理論文獻與臨床信息綜合分析研究研究內(nèi)容1.“腎藏精”理論相關(guān)文獻的研究（1）以中醫(yī)藥古籍文獻和當代國內(nèi)外文獻為研究對象，全面收集，采用文獻整理和數(shù)字化分析研究相結(jié)合的方法，規(guī)范中醫(yī)名詞術(shù)語，確立符合“腎藏精”理論辨證論治和現(xiàn)代科學(xué)認知規(guī)律的構(gòu)成要素（包括疾病、證候、治法、方劑、中藥等）及表征要素，明確各要素的屬性。（2）“腎藏精”臟象理論溯源研究：包括陰陽學(xué)說、五行學(xué)說、天人相應(yīng)學(xué)說對中醫(yī)腎精命火臟象理論的影響。（3）“腎藏精”臟象理論基本概念、原理和演變規(guī)律研究：包括相關(guān)基本概念內(nèi)10涵與外延、解剖形態(tài)、生理功能與病理狀態(tài)、臟象內(nèi)在系統(tǒng)聯(lián)系、體質(zhì)類型以及相關(guān)現(xiàn)代生物學(xué)參數(shù)研究。（4）“腎藏精”臟象理論相關(guān)疾病與證候的基本原理與規(guī)律研究：包括中醫(yī)腎精命火臟象理論相關(guān)疾病與證候的病因病機、臨床表征信息、辨證論治依據(jù)、古代病案分析、現(xiàn)代文獻計量學(xué)研究。（5）“腎藏精”臟象理論相關(guān)疾病的治則治法研究；相關(guān)的方劑、中藥研究；“治未病”原則和方法學(xué)研究。2.“與腎相關(guān)”疾病臨床流行病學(xué)調(diào)查研究以不孕不育、骨質(zhì)疏松癥、老年性癡呆和珠蛋白生成障礙性貧血等“與腎相關(guān)”疾病為研究對象，全面收集中西醫(yī)相關(guān)文獻，從病因病機、證候特征、治則治法、療效機理等方面進行全面系統(tǒng)整理和挖掘，建立證候?qū)W分析技術(shù)路線，開展基于臨床流行病學(xué)方法的“與腎相關(guān)”疾病的特征分析，研究其基本規(guī)律。3. 本項目系列課題研究結(jié)果的綜合數(shù)據(jù)信息庫建立（1）“腎藏精”臟象理論相關(guān)病證臨床療效內(nèi)在規(guī)律研究的綜合信息數(shù)據(jù)庫。包括從腎論治不孕不育、骨質(zhì)疏松癥、老年性癡呆、珠蛋白生成障礙性貧血的研究成果，目前相關(guān)的臨床研究方案及其評價，至今為止相關(guān)的方法學(xué)研究及其評價，結(jié)合本項目臨床研究及實驗研究數(shù)據(jù)進行總結(jié)。（2）“腎藏精”臟象理論相關(guān)病證基礎(chǔ)實驗研究綜合信息數(shù)據(jù)庫。包括各疾病實驗動物模型與 NEI 網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)和干細胞的研究。4. 中醫(yī)“腎藏精”理論知識管理平臺“腎藏精”臟象理論的知識管理平臺處理的數(shù)據(jù)、知識庫的建立與完善、知識管理平臺的建立。預(yù)期目標1．應(yīng)用文獻計量學(xué)、理論分析方法，全面、系統(tǒng)獲取“腎藏精”文獻資料進行理論分析，詮釋中醫(yī)腎精命火臟象理論，闡明其理論的基本科學(xué)內(nèi)涵；2．應(yīng)用調(diào)查研究和臨床流行病學(xué)調(diào)查等方法，揭示相關(guān)疾病、證候從腎論治臨床療效產(chǎn)生的內(nèi)在規(guī)律；3．將獲取的“腎藏精”研究的數(shù)據(jù)和信息，分析、歸納、集成為結(jié)構(gòu)性知識，通過數(shù)據(jù)挖掘，構(gòu)建“腎藏精”理論的數(shù)據(jù)信息庫和知識管理平臺，4．建立以國家重點學(xué)科為基礎(chǔ)的創(chuàng)新人才團隊，培養(yǎng)國家高層次理論研究學(xué)術(shù)帶頭人 1-2 名、學(xué)術(shù)骨干 8-10 名、博士研究生 6-8 名、碩士研究生 8-10 名；5. 出版學(xué)術(shù)專著 3 部：《中醫(yī)“腎藏精”臟象理論》、《從腎論治的治則治11法和方劑中藥》、《 基于“腎藏精”的養(yǎng)生康復(fù)理論》；6）發(fā)表高水平理論及其方法學(xué)研究論文 18-20 篇。經(jīng)費比例： 14.29% 承擔(dān)單位： 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)、天津中醫(yī)藥大學(xué) 課題負責(zé)人： 呂愛平 參加人員：鄭洪新、孟靜巖、才麗平、李敬林、于春泉、王惠君、尚德陽課題2 ： “腎藏精”理論與干細胞和NEI網(wǎng)絡(luò)相關(guān)性的研究研究內(nèi)容根據(jù)中醫(yī)經(jīng)典理論，腎精盛衰主宰了人體生、長、壯、老的全過程，隨著年齡增長，腎精出現(xiàn)虧損；以藥測證是研究中醫(yī)臟象理論的重要方法，通過藥物的作用機制可探索證的特殊內(nèi)涵。本課題即在上述兩種基本策略的基礎(chǔ)上，采用不同月齡段大鼠及腎陽虛大鼠模型，并用補腎藥物干預(yù)，觀察補腎改善腎精虧虛以及激活內(nèi)源性干細胞（包括神經(jīng)干細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞等）的效果及機制，從而部分揭示腎藏精的臟象理論內(nèi)涵研究。進而，在體外模型，研究補腎藥物對神經(jīng)干細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞、胚胎干細胞及誘導(dǎo)多能干細胞自我更新、多系分化的影響以及機制。綜合體內(nèi)外研究，為補腎藥物激活內(nèi)源性干細胞，為腎精的現(xiàn)代科學(xué)內(nèi)涵提供依據(jù)。1. 補腎填精法改善自然衰老大鼠腎精虧虛與激活內(nèi)源性干細胞的研究采用不同月齡段SD大鼠（4、8、18、24月），對24月齡大鼠采用淫羊藿苷、淫羊藿總黃酮進行干預(yù)3個月，每組15只。（1） 觀察補腎藥物改善腎虛的效果：檢測補腎干預(yù)的老年大鼠認知功能、骨密度等的影響。（2） 觀察補腎藥物激活內(nèi)源性干細胞的效果及機制：① 提取骨髓間充質(zhì)干細胞（MSCs）細胞，研究MSCs自我更新、定向分化的增齡性改變及補腎藥物的干預(yù)作用；采用大鼠Affymetrix全基因組基因芯片，比較不同年齡段及補腎藥物干預(yù)后MSCs mRNA表達的差異，明確MSCs自我更新、分化譜、增殖/分化平衡增齡改變的分子機制，并深入鑒定。對文獻報道的影響骨髓間充質(zhì)干細胞分化的重要通路逐一進行研究。② 觀察神經(jīng)干細胞（NSCs）自我更新、定向分化的增齡性改變及補腎藥物的干預(yù)作用；采用大鼠Affymetrix全基因組基因芯片，比較不同年齡段及補腎藥物干預(yù)后12NSCs mRNA表達的差異，明確NSCs自我更新、分化譜、增殖/分化平衡增齡改變的分子機制，并深入鑒定。對文獻報道的影響神經(jīng)干細胞分化的重要通路逐一進行研究。（3） 檢測神經(jīng)內(nèi)分泌免疫相關(guān)指標，明確補腎藥物激活內(nèi)源性干細胞的神經(jīng)內(nèi)分泌免疫途徑：取血，檢測神經(jīng)內(nèi)分泌免疫相關(guān)指標。（4） 總結(jié)補腎藥物改善腎虛和激活內(nèi)源性干細胞的關(guān)系，并明確發(fā)揮作用的主要神經(jīng)內(nèi)分泌機制。2. 補腎填精法改善腎陽虛大鼠腎精虧虛與激活內(nèi)源性干細胞的研究采用皮質(zhì)酮腎陽虛大鼠模型，并用補腎藥物淫羊藿苷、淫羊藿總黃酮進行干預(yù)，每組15只。（1） 觀察補腎藥物激活內(nèi)源性干細胞的效果及機制：① 提取骨髓間充質(zhì)干細胞（MSCs）細胞，研究MSCs自我更新、定向分化的改變及補腎藥物的干預(yù)作用；采用大鼠Affymetrix全基因組基因芯片，比較各組MSCs mRNA表達的差異，明確MSCs自我更新、分化譜、增殖/分化平衡增齡改變的分子機制，并深入鑒定。對文獻報道的影響骨髓間充質(zhì)干細胞分化的重要通路逐一進行研究。② 觀察神經(jīng)干細胞（NSCs）自我更新、定向分化的改變及補腎藥物的干預(yù)作用；采用大鼠Affymetrix全基因組基因芯片，比較各組NSCs mRNA表達的差異，明確NSCs自我更新、分化譜、增殖/分化平衡改變的分子機制，并深入鑒定。對文獻報道的影響神經(jīng)干細胞分化的重要通路逐一進行研究。（2） 檢測神經(jīng)內(nèi)分泌免疫相關(guān)指標，明確補腎藥物激活內(nèi)源性干細胞的神經(jīng)內(nèi)分泌免疫途徑：取血，檢測神經(jīng)內(nèi)分泌免疫相關(guān)指標。（3） 總結(jié)補腎藥物改善腎虛和激活內(nèi)源性干細胞的關(guān)系，并明確發(fā)揮作用的主要神經(jīng)內(nèi)分泌機制。3．體外研究補腎藥物激活神經(jīng)干細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞、胚胎及誘導(dǎo)多能干細胞的效果及機制。（1） 神經(jīng)干細胞通過自我更新擴增干細胞池，并能分化為神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞。在充分鑒定神經(jīng)干細胞的基礎(chǔ)上，研究補腎藥物對神經(jīng)干細胞自我更新的影響；分別利用上述三種終末細胞的標志物，觀察淫羊藿苷、淫羊藿總黃酮對神經(jīng)干細胞分化的作用。采用大鼠Affymetrix全基因組基因芯片，研究藥物干預(yù)前后相關(guān)基因表達的變化，篩選補腎藥干預(yù)神經(jīng)干細胞自我更新、分化譜、增殖/分化平衡改變的分子機制和通路，并深入鑒定。對文獻報道的影響神經(jīng)干細胞分化的重要通路逐一進行研究。13（2） 骨髓間充質(zhì)干細胞通過自我更新補充數(shù)量，并能向成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞分化，也有報道能向神經(jīng)細胞、呼吸道上皮細胞跨胚層分化。本項目擬觀察上述藥物對骨髓間充質(zhì)干細胞自我更新、分化的影響。采用大鼠Affymetrix全基因組基因芯片，研究藥物干預(yù)前后相關(guān)基因表達的變化，篩選補腎藥干預(yù)骨髓間充質(zhì)干細胞自我更新、分化譜、增殖/分化平衡改變的分子機制和通路，并深入鑒定。對文獻報道的影響骨髓間充質(zhì)干細胞分化的重要通路逐一進行研究。（3） 胚胎干細胞及誘導(dǎo)多能干細胞具有分化的全能特性，是研究干細胞分化的較好模型。國外已報道胚胎干細胞向神經(jīng)干細胞、成骨細胞、造血干細胞、胰島β細胞的定向分化。本項目擬觀察上述藥物對胚胎干細胞及誘導(dǎo)多能干細胞定向分化的影響。采用大鼠Affymetrix全基因組基因芯片，研究藥物干預(yù)前后相關(guān)基因表達的變化，篩選補腎藥干預(yù)胚胎干細胞及誘導(dǎo)多能干細胞定向分化的分子機制和通路，并深入鑒定。（4（ 綜合體內(nèi)外研究結(jié)果，總結(jié)補腎藥物激活內(nèi)源性干細胞的主要神經(jīng)內(nèi)分泌免疫途徑，細胞內(nèi)主要信號通路，從而揭示腎精命火的現(xiàn)代科學(xué)內(nèi)涵。預(yù)期目標1. 明確補腎藥物改善自然衰老大鼠的效果和激活內(nèi)源性干細胞的關(guān)系；明確補腎藥物發(fā)揮作用的主要神經(jīng)內(nèi)分泌免疫途徑和細胞內(nèi)分子機制。2. 明確補腎藥物激活腎陽虛大鼠內(nèi)源性干細胞的效果；明確補腎藥物發(fā)揮作用的主要神經(jīng)內(nèi)分泌免疫途徑和細胞內(nèi)分子機制。3. 通過上述的以藥測證以及機制的深入研究，為腎精命火的中醫(yī)理論提供現(xiàn)代生物學(xué)意義上的解釋，升華中醫(yī)“腎藏精”理論。4. 培養(yǎng)一批高層次的中醫(yī)和中西醫(yī)結(jié)合研究型人才，培養(yǎng)研究生10-20名，增強各科研單位的協(xié)作能力，提高承擔(dān)中醫(yī)重大科研課題的能力。5. 發(fā)表論文20-30篇。其中被SCI收錄5篇以上，申請專利1項。經(jīng)費比例： 19.05% 承擔(dān)單位： 復(fù)旦大學(xué)、湖南中醫(yī)藥大學(xué) 課題負責(zé)人： 沈自尹 參加人員： 劉柏炎、卞琴、張新民、黃建華、丁道芳、譚琥、屈波課題3 ： 從不孕不育探討“腎主生殖”理論的研究研究內(nèi)容141.基于腎藏精的溫腎填精方藥治療不孕不育的數(shù)據(jù)管理平臺研究（1）配合課題一的流行病調(diào)查研究（不孕不育與腎精不足、命門火衰證候體質(zhì)相關(guān)的流行病學(xué)調(diào)查）及本課題實驗及臨床研究數(shù)據(jù)處理的需要研制結(jié)構(gòu)化數(shù)據(jù)采集軟件。（2）通過本課題相關(guān)古籍文獻梳理及現(xiàn)代研究數(shù)據(jù)挖掘，在本課題實驗數(shù)據(jù)管理基礎(chǔ)上，建立溫腎填精方藥干預(yù)生殖的實驗研究數(shù)據(jù)庫。（3）通過“腎精虧虛、命門火衰”型不孕不育患者臨床四診信息采集、精子質(zhì)量及活性、卵泡成熟及排出、子宮卵巢血供指數(shù)、盆腔熱代謝值動態(tài)評價、細胞體液免疫、免疫因子等多源數(shù)據(jù)采集及臨床研究數(shù)據(jù)，建立溫腎填精方藥治療不孕不育的臨床數(shù)據(jù)研究數(shù)據(jù)庫。2. 基于腎藏精的溫腎填精方藥促進生殖的實驗研究（1）基于 HPLC 的溫腎填精復(fù)方、單味藥及單體含藥血清制備研究。應(yīng)用 HPLC 技術(shù)制備溫腎填精復(fù)方（右歸丸、五子衍宗丸等） 、單味藥及單體（淫羊藿、補骨脂、淫羊藿苷、淫羊藿總黃酮、補骨脂素、異補骨脂素等）含藥血清以應(yīng)用于體外篩選研究及體外藥效機制研究。（2）溫腎填精方藥及單體成分干預(yù)生殖的 3T3-L1、黃體顆粒細胞體外藥效評價篩選研究。選擇 3T3-L1 前脂肪細胞株、超排卵所得的原代培養(yǎng)鼠顆粒細胞，應(yīng)用HPLC 技術(shù)制備的含藥血清對 3T3-L1 前脂肪細胞、鼠顆粒細胞進行培養(yǎng)，通過觀察各藥物含藥血清對 3T3-L1 前脂肪細胞、鼠顆粒細胞生長發(fā)育、激素分泌、芳香化酶表達等情況，在篩選有效的溫腎填精方藥、單味藥及單體成分基礎(chǔ)上進行本課題實驗及臨床研究。（3）溫腎填精方藥促胚胎干細胞定向分化為卵母細胞及精原細胞研究。首先收集似干細胞的克隆、用免疫細胞學(xué)分析胚胎干細胞標志蛋白鑒定干細胞克隆，通過溫腎填精藥物干預(yù)，觀察對胚胎干細胞分化發(fā)育的影響。（4）溫腎填精方藥促進生殖細胞生長發(fā)育及其機制研究。選擇未成熟卵細胞、成熟卵細胞、受精的成熟卵細胞、受精卵，應(yīng)用免疫組化及激光共聚焦顯微技術(shù)觀察溫腎填精方藥含藥血清對未成熟卵細胞生長發(fā)育、體外受精和胚胎發(fā)育的影響。（5）溫腎填精方藥對胚胎著床微環(huán)境的影響研究。通過建立超促排卵周期和自然周期胚胎受體小鼠模型，通過比較妊娠率和胚胎著床率，盆腔熱代謝及子宮內(nèi)膜整合素 αvβ3 表達情況研究溫腎填精方藥對胚胎著床微環(huán)境的影響。（6）溫腎填精方藥對冷凍卵細胞、精子、受精卵解凍復(fù)蘇的干預(yù)研究。采用程序冷凍方法，用溫腎填精方藥含藥血清配制的冷凍保存液和解凍液，冷凍保存小鼠精子、卵細胞、胚胎和卵巢組織，通過透射電鏡、共聚焦顯微鏡、免疫組化等方法評15價溫腎填精方藥對冷凍精子、卵細胞、受精卵解凍復(fù)蘇的干預(yù)。3. 基于腎藏精的溫腎填精方藥促進生殖的臨床研究（1）基于熱成像技術(shù)的溫腎填精方藥調(diào)節(jié)腎精不足、命門火衰證的客觀化研究。采用單中心或多中心、隨機、平行對照的臨床實驗設(shè)計，分為正常女性組、正常男性組、女性腎精不足、命門火衰不孕組、男性女性腎精不足、命門火衰不育組，應(yīng)用熱成像技術(shù)評價右歸丸、五子衍宗丸對受試者全身及局部細胞代謝熱值的動態(tài)影響及規(guī)律。（2）溫腎填精方藥調(diào)節(jié) NEI 網(wǎng)絡(luò)治療不孕癥的臨床研究。采用單中心或多中心、隨機、平行對照的臨床實驗設(shè)計，分別對 NEI 功能失調(diào)不孕及 IVF 患者進行評價研究。NEI 功能失調(diào)不孕分為觀察及對照組，對照組為腹腔鏡分粘術(shù)后患者，觀察組在上述干預(yù)上加用溫腎填精中藥，觀察溫腎填精方藥對免疫功能失調(diào)性不孕干預(yù)作用。IVF 患者也分為對照組與觀察組，對照組給予西醫(yī)促排卵藥物，治療組在上述基礎(chǔ)上給予右歸丸和五子衍宗丸加減，觀察溫腎填精方藥對 IVF 妊娠結(jié)局的影響。（3）溫腎填精方藥調(diào)節(jié)少精弱精不育癥精子數(shù)量及活性的臨床研究。采用單中心或多中心、隨機、平行對照的臨床實驗設(shè)計，分為觀察及對照 2 組，對照組給予左卡尼汀，治療組給予右歸丸和五子衍宗丸加減，評價溫腎填精方藥對精子的數(shù)量及活性的影響。選取 30 份不同男性的精液標本洗滌優(yōu)選后，分為溫腎填精中藥干預(yù)組及對照組，分別與不同濃度的 PKA 于 37℃共同孵育，評價不同濃度蛋白激酶 A（Protein Kinase A，PKA）參與調(diào)節(jié)精子的活力的影響、篩選出 PKA 對體外精子活力影響的最佳時間和濃度、初步探討 PKA 影響精子活力的機制。預(yù)期目標1.建立不孕不育信息管理平臺，研制出結(jié)構(gòu)化數(shù)據(jù)采集軟件，建立不孕不育的實驗及臨床數(shù)據(jù)庫。2.明確溫腎填精法治療不孕不育的證治規(guī)律，揭示“腎主生殖”與不孕不育臨床療效的內(nèi)在聯(lián)系，深化從腎論治不孕不育的理論意義。3.明確溫腎填精藥產(chǎn)生療效與胚胎干細胞、生殖干細胞、干預(yù)胚胎著床及 NEI 網(wǎng)絡(luò)功能的相關(guān)性。4.通過上述的從病（證）探因、以效證因，以及機制的研究，為腎藏精、腎主生殖的中醫(yī)理論提供現(xiàn)代生物學(xué)意義上的解釋，升華中醫(yī)“腎藏精”理論。5.培養(yǎng)一批高層次的中醫(yī)和中西醫(yī)結(jié)合研究型人才，培養(yǎng)研究生 19-28 名，其中博16士研究生 3-6 名，增強各科研單位的協(xié)作能力，提高承擔(dān)中醫(yī)重大科研課題的能力。6.發(fā)表論文 20-34 篇，其中被 SCI 收錄 5 篇以上，撰寫專著 1 部。7.申請專利 2 項，獲專利授權(quán) 1 項。經(jīng)費比例： 14.29% 承擔(dān)單位： 成都中醫(yī)藥大學(xué)、北京中醫(yī)藥大學(xué) 課題負責(zé)人： 陸華 參加人員： 李曰慶、王米渠、王彬、劉偉信、楊丹、朱明輝、胡翔課題4 ： 從骨質(zhì)疏松癥探討“腎主骨”理論的研究研究內(nèi)容1. 補腎填精法治療骨質(zhì)疏松癥的證治規(guī)律研究 （1）多源信息采集平臺的建立?；诠琴|(zhì)疏松癥患者的臨床表現(xiàn)，建立中醫(yī)四診信息的臨床證候量表。研制結(jié)構(gòu)化數(shù)據(jù)采集軟件，在SOP指導(dǎo)下完成采集臨床病例資料，形成臨床數(shù)據(jù)信息庫，數(shù)據(jù)納入課題一統(tǒng)一分析。 （2）臨床療效評價研究。 選擇臨床65-75歲女性原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥患者，中醫(yī)辨證屬于腎精虧虛型。ANOVA方差分析和χ2檢驗各組患者在年齡、性別和體重上差異無顯著性。測定部位為L2-4前后位和Ward氏三角BMD，BMD經(jīng)年齡和體重指數(shù)（body mass index，BMI）校正后得到校正值BMDadj，BMD ≤-2.5SD為骨質(zhì)疏松癥。正常組L2-4 BMD>-2.5SD，對照組自愿接受福善美治療，治療組自愿接受青娥丸合二仙湯治療。每組均為60例，治療6個月。 通過中醫(yī)證候積分、骨質(zhì)疏松癥相關(guān)評價量表、骨密度（BMD）及影像學(xué)特異性表現(xiàn)等檢測手段，評價補腎填精法治療骨質(zhì)疏松癥的療效，揭示其產(chǎn)生療效的物質(zhì)基礎(chǔ)。通過長期隨訪量表評價及終點事件調(diào)查，評價該法治療骨質(zhì)疏松癥的遠期療效。闡述補腎填精法治療骨質(zhì)疏松癥的證治規(guī)律，揭示“腎主骨”與骨質(zhì)疏松癥臨床療效的內(nèi)在聯(lián)系，深化從腎論治骨質(zhì)疏松癥的理論意義。2．補腎填精法治療骨質(zhì)疏松癥的物質(zhì)基礎(chǔ)研究 （1）骨代謝指標檢測。包括骨合成代謝指標：OC、I型膠原前膠原氨基端前肽（N-terminal propeptide of type procollagen, PINP）、骨堿性磷酸酶（bone alkaline phosphatase，bALP）；骨分解代謝指標：CTX和NTX（I型膠原端肽交聯(lián)）。（2）骨質(zhì)疏松癥患者NEI網(wǎng)絡(luò)指標檢測。17健康志愿者為正常組，青娥丸合3二仙湯為治療組，福善美為對照組，每組的樣本量15例。抽取外周血，進行“NEI網(wǎng)絡(luò)”指標檢測。 （3）骨質(zhì)疏松癥患者骨髓間充質(zhì)干細胞功能研究。分組和治療同上。骨髓穿刺，分離純化，進行骨髓間充質(zhì)干細胞分子標志鑒定（Runx2，type I collagen，OP，osteonectin， OC，BSP，ALP等），揭示補腎填精法影響骨髓間充質(zhì)干細胞的環(huán)節(jié)及促成骨的作用。采用人Affymetrix全基因組基因芯片檢測mRNA表達，篩選并鑒定藥物干預(yù)骨髓間充質(zhì)干細胞的關(guān)鍵基因和分子通路。3. 補腎填精法治療骨質(zhì)疏松癥的療效機制研究 （1）動物模型建立。選擇去雙側(cè)卵巢大鼠骨質(zhì)疏松模型，在疾病模型建立的基礎(chǔ)上，再建立腎陽虛型大鼠骨質(zhì)疏松病證結(jié)合模型[鄺安堃，吳裕，丁霆，等．某些助陽藥對于大劑量皮質(zhì)激素所致耗竭現(xiàn)象的影響．中華內(nèi)科雜志，1963，2(2)：113]。隨機分為正常對照組、模型組、青娥丸合二仙湯治療組、福善美對照組，每組20只動物。 （2）相關(guān)指標檢測。①骨密度及生物力學(xué)指標檢測：取四肢骨、椎體、椎間盤等。雙能X線骨密度儀（DEXL）、Micro-CT進行椎體及全身BMD測定；萬能材料試驗機檢測股骨三點彎曲生物力學(xué)指標。②組織形態(tài)學(xué)觀察：取下丘腦、垂體、腎臟、腎上腺、胸腺、卵巢、子宮、睪丸、四肢骨、椎體、椎間盤、血細胞等組織器官，進行組織形態(tài)學(xué)觀察：③生化指標測試：ELISA檢測大鼠BUN、Scr、ALP、PTH、BGP、Dpd等腎功能相關(guān)指標的影響，并深入探討IL-6、TGF-β），揭示“腎藏精，主骨生髓”在原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥中的生物學(xué)機理。 （3）NEI相關(guān)指標檢測。每組10只動物，取材和檢測同課題二NEI部分，以明確補腎填精法干預(yù)NEI網(wǎng)絡(luò)治療骨質(zhì)疏松癥的環(huán)節(jié)。 （4）骨髓間充質(zhì)干細胞相關(guān)指標檢測。抽取骨髓，進行分子標志鑒定。檢測向成骨分化的標志物，包括：Runx2，type I collagen，OP，osteonectin， OC，BSP，ALP等，評價骨髓間充質(zhì)干細胞分化能力。采用大鼠Affymetrix全基因組基因芯片檢測mRNA表達，篩選并鑒定藥物干預(yù)骨髓間充質(zhì)干細胞的關(guān)鍵基因和分子通路。預(yù)期目標1. 建立骨質(zhì)疏松癥多源信息采集平臺，研制出結(jié)構(gòu)化數(shù)據(jù)采集軟件，形成關(guān)于骨質(zhì)疏松的臨床數(shù)據(jù)信息庫。2. 明確補腎治療骨質(zhì)疏松癥的近期及遠期療效，闡述補腎填精法治療骨質(zhì)疏松癥的證治規(guī)律，揭示“腎主骨”與骨質(zhì)疏松癥臨床療效的內(nèi)在聯(lián)系，深化從腎論治骨質(zhì)疏松癥的理論意義。183. 明確骨質(zhì)疏松癥與骨髓間充質(zhì)干細胞生物學(xué)行為的關(guān)系，在此基礎(chǔ)上，明確補腎藥產(chǎn)生療效與干預(yù)干細胞的生物學(xué)行為的相關(guān)性。4. 大量研究已經(jīng)表明NEI網(wǎng)絡(luò)是補腎藥物作用的重要途徑，研究也表明NEI網(wǎng)絡(luò)的物質(zhì)能調(diào)節(jié)干細胞的行為，因此通過本項目的研究擬明確補腎藥是否通過以及通過何種NEI網(wǎng)絡(luò)途徑調(diào)節(jié)干細胞行為，從而產(chǎn)生臨床療效。5. 通過上述的從病（證）探因、以效證因，以及機制的研究，為腎藏精、腎主骨的中醫(yī)理論提供現(xiàn)代生物學(xué)意義上的解釋，升華中醫(yī)“腎藏精”理論。6. 培養(yǎng)一批高層次的中醫(yī)和中西醫(yī)結(jié)合研究型人才，培養(yǎng)研究生10-20名，增強各科研單位的協(xié)作能力，提高承擔(dān)中醫(yī)重大科研課題的能力。7. 發(fā)表論文20-30篇。其中被SCI收錄5篇以上，申請專利1項。經(jīng)費比例： 23.80% 承擔(dān)單位： 上海中醫(yī)藥大學(xué)、遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 課題負責(zé)人： 王擁軍 參加人員： 施杞、任艷玲、周重建、莫文、周泉、唐得志、崔學(xué)軍、李佶課題5：從老年性癡呆探討“腎生髓，腦為髓之?！崩碚摰难芯垦芯績?nèi)容1．補腎填精法治療老年性癡呆臨床療效評價研究開展多中心、隨機、平行對照臨床試驗。通過中醫(yī)證候積分、老年性癡呆相關(guān)評價量表、影像學(xué)特異性表現(xiàn)等檢測手段，評價補腎填精法治療老年性癡呆的臨床療效；通過長期隨訪量表評價及終點事件調(diào)查，評價該法治療老年性癡呆的遠期療效，以闡釋補腎填精法治療老年性癡呆腎虛證的證治規(guī)律，揭示“腎生髓，腦為髓?！迸c老年性癡呆臨床療效的內(nèi)在聯(lián)系，深化從腎論治老年性癡呆的臨床指導(dǎo)意義。2．補腎填精法治療老年性癡呆的物質(zhì)基礎(chǔ)研究（1）血漿特異性蛋白表達等相關(guān)指標檢測。（2）老年性癡呆患者“NEI 網(wǎng)絡(luò)”相關(guān)指標檢測。3．補腎填精法治療老年性癡呆的療效機制研究（1）動物模型建立。選擇不同月齡快速老化鼠（SAM-P/8 鼠），在此基礎(chǔ)上，建立腎陽虛型大鼠老年性癡呆病證結(jié)合模型。（2）相關(guān)指標檢測。①動物行為學(xué)（認知功能及記憶能力）檢測；②不同部位腦19組織形態(tài)學(xué)觀察；③特異性基因與蛋白表達檢測，揭示“腎生髓，腦為髓?！?理論在老年性癡呆中的生物學(xué)機理。（3）“NEI網(wǎng)絡(luò)”相關(guān)指標檢測。選取與老年性癡呆密切相關(guān)的 NEI指標，利用基因芯片等技術(shù)方法，以明確補腎填精法干預(yù)NEI網(wǎng)絡(luò)治療老年性癡呆的環(huán)節(jié)。（4） 神經(jīng)干細胞相關(guān)指標檢測。通過神經(jīng)干細胞鑒定分子標志檢測神經(jīng)干細胞數(shù)量，并分離出神經(jīng)干細胞；通過向神經(jīng)相關(guān)細胞分化的標志物評價干細胞分化能力。預(yù)期目標1．明確補腎治療老年性癡呆的近期及遠期療效，闡述補腎填精法治療老年性癡呆的證治規(guī)律，揭示“ 腎生髓，腦為髓海 ”與老年性癡呆臨床療效的內(nèi)在聯(lián)系。2．明確補腎治療老年性癡呆的物質(zhì)基礎(chǔ)，闡述補腎填精法治療老年性癡呆腎虛證的臨床作用機理，深化從腎論治老年性癡呆的理論意義3．明確老年性癡呆與神經(jīng)干細胞生物學(xué)行為的關(guān)系，在此基礎(chǔ)上，明確補腎藥產(chǎn)生療效與干預(yù)干細胞的生物學(xué)行為的相關(guān)性。4．大量研究已經(jīng)表明NEI網(wǎng)絡(luò)是補腎藥物作用的重要途徑，研究也表明NEI網(wǎng)絡(luò)的物質(zhì)能調(diào)節(jié)干細胞的行為，因此通過本項目的研究擬明確補腎藥是否通過以及通過何種NEI 網(wǎng)絡(luò)途徑調(diào)節(jié)神經(jīng)干細胞行為，從而產(chǎn)生臨床療效。5．通過上述的從病（證）探因、以效證因，以及機制的研究，為腎藏精、腎生髓，腦為髓海的中醫(yī)理論提供現(xiàn)代生物學(xué)意義上的解釋，升華中醫(yī)“腎藏精” 理論。6．培養(yǎng)一批高層次的中醫(yī)和中西醫(yī)結(jié)合研究型人才，培養(yǎng)研究生10-15名，增強各科研單位的協(xié)作能力，提高承擔(dān)中醫(yī)重大科研課題的能力。7．發(fā)表論文 15-20 篇，其中被 SCI 收錄 2 篇以上。經(jīng)費比例： 14.29% 承擔(dān)單位： 天津中醫(yī)藥大學(xué)、上海中醫(yī)藥大學(xué) 課題負責(zé)人： 張玉蓮 參加人員： 林水淼、周震、安紅梅、鄭錦、周永明、顧耘、郭家奎課題6 ： 從障礙性貧血探討“腎生髓”理論的研究 研究內(nèi)容1．補腎益髓法治療珠蛋白生成障礙性貧血證治規(guī)律研究 （1）多源信息采集平臺的建立。基于珠蛋白生成障礙性貧血的臨床表現(xiàn)，建立中20醫(yī)四診信息的臨床證候量表；調(diào)查患者中醫(yī)癥候與基因突變型（遺傳背景與先天稟賦）關(guān)系，建立血液參數(shù)療效性指標（Hb、RBC、Ret、HbF）等信息采集系統(tǒng)。研制結(jié)構(gòu)化數(shù)據(jù)采集軟件，在SOP指導(dǎo)下完成采集臨床病例資料，形成臨床數(shù)據(jù)信息庫，數(shù)據(jù)納入課題總項目統(tǒng)一分析。 （2）中藥治療珠蛋白生成障礙性貧血臨床驗證。通過3位中醫(yī)師臨床辨證，選取符合納入標準的（腎精虧損型）中間型?-珠蛋白生成障礙性貧血患者為研究對象，在益髓生血顆粒前期療效基礎(chǔ)上，采用補腎益髓方（仙靈脾，補骨脂，山茱萸，熟地，阿膠，當歸） ，設(shè)置正常組，安慰劑對照，補腎益髓方治療組，和益髓生血顆粒對照組，每組各25例。開展隨機、平行對照臨床試驗，評價中藥治療?-珠蛋白生成障礙性貧血的臨床有效性，驗證從腎論治珠蛋白生成障礙性貧血的有效性。2．補腎益髓法治療?-珠蛋白生成障礙性貧血生物學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)研究 （1）補腎益髓法對?-珠蛋白生成障礙性貧血紅細胞形態(tài)與免疫功能影響：以?-珠蛋白生成障礙性貧血患者為研究對象，每組選取10例患者，采用透射電鏡、real-time PCR、ELISA、紅細胞CR1花環(huán)(RBC-CRIR)試驗等技術(shù)，從患者血液參數(shù)、紅細胞形態(tài)、紅細胞膜骨架蛋白、紅細胞包涵體、紅細胞氧化損傷、紅細胞分子免疫功能等不同層面，探討補腎益髓法治療障礙性貧血的物質(zhì)基礎(chǔ)。（2）補腎益髓法對?-珠蛋白生成障礙性貧血患者珠蛋白表達調(diào)控研究：以?-珠蛋白生成障礙性貧血患者為研究對象和樣品來源，每組選取8－10例患者，從AHSP mRNA表達、?-珠蛋白表達調(diào)控與甲基化修飾、差異基因表達、功能蛋白表達、血清多肽譜等方面，研究補腎益髓法治療珠蛋白生成障礙性貧血的分子機制。（3）補腎益髓法對珠蛋白生成障礙性貧血患者NEI網(wǎng)絡(luò)的影響：每組樣本量10例。進行神經(jīng)內(nèi)分泌免疫系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)（NEI網(wǎng)絡(luò)）相關(guān)指標的檢測：ACTH、血漿皮質(zhì)醇、?-內(nèi)啡肽、生長激素、雌二醇、睪酮、兒茶酚胺、乙酰膽堿、血管活性腸肽、促甲狀腺素 TSH；流式細胞儀檢測CD3+、CD4+、CD8+細胞比例，計算CD4+/CD8+之比；取血清，檢測IL-2、IFN-γ、TGF、IL-1濃度。（4）補腎益髓法對珠蛋白生成障礙性貧血患者干細胞增殖分化的影響：基于?-珠蛋白生成障礙性貧血患者在體干細胞培養(yǎng)，研究補腎益髓中藥對造血干細胞的影響。每組樣本量10例，探討治療前后部分患者骨髓造血干細胞增殖活性、分化趨勢及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子水平的改變，采用人Affymetrix全基因組基因芯片檢測mRNA表達，篩選并鑒定藥物干預(yù)骨髓間充質(zhì)干細胞的關(guān)鍵基因和分子通路。3．補腎益髓中藥有效組分對紅細胞分化和?-珠蛋白基因活化的作用及機制的研究：21利用轉(zhuǎn)人?-珠蛋白基因簇大鼠紅白血病穩(wěn)定細胞系，從轉(zhuǎn)錄因子表達、細胞內(nèi)信號通路、表觀遺傳修飾（重點分析DNA甲基化）三個不同層面上深入研究益髓生血顆粒活化?-影響?-類珠蛋白基因表達的機制。（1） 研究補腎益髓中藥有效組分對珠蛋白基因開關(guān)的影響和機制1）利用轉(zhuǎn)人?-珠蛋白基因簇大鼠紅白血病（MEL）穩(wěn)定細胞系研究中藥有效組分對于人?-和?-珠蛋白基因表達和開關(guān)的影響。2）利用大鼠MEL細胞系研究中藥有效組分對珠蛋白基因表達和開關(guān)（主要研究胚胎到成鼠珠蛋白表達開關(guān)）的影響。3）研究中藥有效組分對人CD34+造血干/祖細胞紅系誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中珠蛋白基因表達和開關(guān)的影響（主要研究胚胎?-到胎兒? -以及胎兒到成人?-珠蛋白基因表達的開關(guān)，重點實驗中藥有效組分是否具有對?-和? -基因的特異活化作用。4）在上述研究獲得正性結(jié)果的基礎(chǔ)上，研究中藥有效組分影響珠蛋白基因開關(guān)以及特異活化?-和? -珠蛋白基因的機制（重點實驗轉(zhuǎn)錄因子的表達變化以及表觀遺傳改變等） 。5）在獲得正性結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇性實驗用中藥有效組分治療?-地中海貧血患者前后相關(guān)基因表達的變化以及與治療效果的關(guān)系。（2）研究中藥有效組分對造血細胞分化（重點在紅系分化）的影響和機制1）利用半固體培養(yǎng)基研究中藥有效組分對造血干細胞（HSC）向紅系分化定向的影響2）利用 CD34+造血干/祖細胞紅系誘導(dǎo)液體培養(yǎng)研究中藥有效組分對紅系分化的影響。3）在上述研究獲得正性結(jié)果的基礎(chǔ)上，研究中藥有效組分影響 HSC 紅系定向和紅系祖細胞繼續(xù)分化成熟的作用機制（重點實驗可能影響紅系分化的蛋白質(zhì)基因以及miroRNAs 的表達變化，并進一步研究影響紅系分化的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。 ）4）在獲得正性結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇幾個病例，實驗中藥有效組分對?-地中海貧血患者紅系分化的影響以及相關(guān)基因表達的影響。4. 研究補腎益髓中藥及其有效組分對再生障礙性貧血大鼠動物模型的影響：建立再生障礙性貧血動物大鼠模型（模型一：60Co-?射線 3.0 Gy 照射后第 4d 開始給予環(huán)磷酰胺 50.0 mg·kg-1 及氯霉素 62.5 mg·kg-1，共 3d；模型二：馬利蘭0.05%混懸液按 4ml·kg-1·d，連續(xù)灌胃 45 天，造模誘導(dǎo)） ，給予補腎益髓中藥干預(yù)治療，觀察外周血象、骨髓有核細胞及免疫功能指標變化，同時觀察藥物對障礙性貧血模型大鼠 NEI 相關(guān)指標變化，并分離造血干細胞，觀察再障大鼠骨髓紅系干細胞增殖分化和相關(guān)生長因子的變化。22預(yù)期目標總體研究目標：以珠蛋白生成障礙性貧血為研究對象，從證探因，以法驗效，補腎益髓中藥治療珠蛋白生成障礙性貧血的臨床療效與調(diào)控造血干細胞和 NEI 網(wǎng)絡(luò)功能的相關(guān)性，進一步揭示“腎生髓”理論的科學(xué)內(nèi)涵。在以往基礎(chǔ)上，按照循證醫(yī)學(xué)原則，以珠蛋白生成障礙性貧血患者為主要研究對象，在廣西地中海貧血癥高發(fā)區(qū)應(yīng)用補腎益髓中藥治療地中海貧血癥，采用隨機、單盲、安慰劑對照臨床規(guī)范研究，結(jié)合轉(zhuǎn)人?-珠蛋白基因簇大鼠紅白血病體外細胞模型和再生障礙性貧血大鼠模型，通過臨床和實驗研究，從激活?-基因；影響基因開關(guān)；調(diào)控珠蛋白 mRNA 表達；調(diào)控骨髓干細胞誘導(dǎo)分化、促進有效紅細胞生成，對轉(zhuǎn)人 ?-珠蛋白基因簇大鼠紅白血病穩(wěn)定細胞系干細胞誘導(dǎo)等不同層面，探索補腎益髓法治療障礙性貧血的臨床療效與調(diào)控造血干細胞和 NEI 網(wǎng)絡(luò)功能的相關(guān)性。五年預(yù)期目標：（1） 建立 ?-珠蛋白生成障礙性貧血癥多元信息采集平臺：建立中醫(yī)四診信息臨床證候量表；中醫(yī)癥候與基因突變型關(guān)系量表及血液學(xué)參數(shù)療效性指標信息采集系統(tǒng)，研制出結(jié)構(gòu)化數(shù)據(jù)采集軟件，在 SOP 指導(dǎo)下形成關(guān)于珠蛋白生成障礙性貧血的臨床數(shù)據(jù)信息庫。（2） 完成 200 例珠蛋白生成障礙性貧血患者證候規(guī)律、遺傳背景關(guān)系調(diào)查，完成200 例臨床患者流行病學(xué)調(diào)查統(tǒng)計分析，篩選符合條件的研究病例；（3） 完成高發(fā)區(qū)符合納入條件的珠蛋白生成障礙性貧血癥患者采集，隨機分為正常組，安慰劑對照，補腎益髓方治療組，和益髓生血顆粒對照組，每組各 25 例，開展中藥治療對照臨床規(guī)范研究，完成 80 例（考慮到可能脫落病例，增加 5 例患者）珠蛋白生成障礙性貧血患者臨床有效性評價；（4） 初步揭示中藥治療珠蛋白生成障礙性貧血癥對患者?-珠蛋白基因活化與表達調(diào)控的分子機制；（5） 初步揭示中藥治療珠蛋白生成障礙性貧血癥對患者紅細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)與免疫功能影響的分子機制；（6） NEI 網(wǎng)絡(luò)是補腎藥物作用的重要途徑，研究表明 NEI 網(wǎng)絡(luò)的物質(zhì)能調(diào)節(jié)干細胞的行為。通過本課題研究，初步揭示中藥是否通過以及通過何種 NEI 網(wǎng)絡(luò)途徑調(diào)節(jié)珠蛋白生成障礙性貧血癥患者骨髓造血干細胞行為，從而產(chǎn)生臨床療效； （7） 初步揭示中藥及其有效組分對珠蛋白生成障礙性貧血癥患者治療前后，對骨23髓造血干細胞活性、增殖分化及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達水平的影響；（8） 利用轉(zhuǎn)人?-珠蛋白基因簇大鼠紅白血病穩(wěn)定細胞系的體外細胞學(xué)研究，從轉(zhuǎn)錄因子表達、細胞內(nèi)信號通路、表觀遺傳修飾（重點分析 DNA 甲基化）三個不同層面上深入研究益髓生血顆?；罨?-影響?-類珠蛋白基因表達的機制。（9） 利用再生障礙性貧血動物模型進行動物學(xué)實驗研究，初步揭示補腎益髓中藥干預(yù) NEI 網(wǎng)絡(luò)、調(diào)控干細胞誘導(dǎo)分化，治療再生障礙性貧血模型大鼠的療效作用機制；（10） 通過上述的從?。ㄗC）探因、以效證因，以及機制的研究，為腎藏精、腎生髓的中醫(yī)理論提供現(xiàn)代生物學(xué)意義上的解釋，升華中醫(yī)“腎藏精、腎生髓”理論深刻內(nèi)涵；（11） 培養(yǎng)一批高層次的中醫(yī)和中西醫(yī)結(jié)合研究型人才，培養(yǎng)研究生 8－10 名，增強各科研單位的協(xié)作能力，提高承擔(dān)中醫(yī)重大科研課題的能力；（12） 發(fā)表論文 25-30 篇，其中被 SCI 收錄 5－8 篇以上。申請專利 1 項；撰寫專著 1 部。經(jīng)費比例： 14.29% 承擔(dān)單位： 中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院、北京中醫(yī)藥大學(xué) 課題負責(zé)人： 吳志奎參加人員：方素萍、趙宗江、張新華、杜占文、劉詠梅、王文娟、李敏（六）課題間關(guān)系課題1是理論文獻和臨床流行病學(xué)研究，詮釋中醫(yī)腎精命火臟象理論，梳理其基本內(nèi)涵與發(fā)展脈絡(luò)，建立數(shù)據(jù)信息庫和知識管理平臺。 課題2是基礎(chǔ)實驗研究，從干細胞和NEI網(wǎng)絡(luò)功能的角度探索和深化對“腎藏精”臟象理論的認識。 課題3～6在“腎藏精”臟象理論指導(dǎo)下，以“腎主生殖”、“腎主骨”、“腎生髓”、“腦為髓之海”等理論為線索，選擇“腎精虧虛、命門火衰”型典型疾?。ú辉胁挥?、骨質(zhì)疏松癥、老年性癡呆、障礙性貧血），從?。ㄗC）探因，觀察“腎精虧虛、命門火衰”證候與干細胞和NEI網(wǎng)絡(luò)功能失調(diào)的相關(guān)性；以效證因，驗證中醫(yī)從腎論治與干細胞和NEI網(wǎng)絡(luò)功能調(diào)節(jié)的關(guān)系。 以上6個課題圍繞統(tǒng)一的目標和假說，從不同的角度開展研究。課題1統(tǒng)領(lǐng)和支撐各課題研究；課題2為課題1的理論創(chuàng)新和課題3～6的研24究提供實驗依據(jù)；課題3～6驗證科學(xué)假說，為理論創(chuàng)新提供臨床證據(jù)；課題2～6的研究結(jié)果回歸課題1。本項目的6個課題相互配合，形成一個有機的整體。 2526四、年度計劃年度研究內(nèi)容 預(yù)期目標第一年1．啟動“腎藏精”理論相關(guān)文獻的研究。2．啟動“與腎相關(guān)”疾病臨床流行病學(xué)調(diào)查研究，完善流行病學(xué)調(diào)研方案及信息采集培訓(xùn)；通過專家調(diào)研及預(yù)測試，進一步完善采集規(guī)范。3. 研制本項目系列課題研究結(jié)果的綜合數(shù)據(jù)信息庫。4. 臨床試驗啟動。5. 制備補腎中藥，中藥單體，完成單體初步篩選。6. 動物實驗開始購買飼養(yǎng)動物、購買試劑，進行預(yù)實驗。并開展部分正式實驗，完成年度工作量。7. 體外實驗開展溫腎填精方藥促胚胎干細胞定向分化為各種成體預(yù)實驗。1.完成漢以前相關(guān)中醫(yī)藥學(xué)文獻整理。2000-2009 年現(xiàn)代文獻整理；進行理論研究。2.完成制定中醫(yī)四診信息的臨床證候量表及專家問卷調(diào)查；臨床流調(diào)人員培訓(xùn)；完成臨床流行病學(xué)調(diào)查預(yù)調(diào)查。3.初步完成綜合數(shù)據(jù)信息庫的框架結(jié)構(gòu)。4.通過預(yù)實驗，確定正式實驗的研究方案和技術(shù)方法。5.擬發(fā)表論文 15-20 篇，其中 SCI 收錄5-8 篇。6.申報專利 1 項。第二年1．“腎藏精”理論相關(guān)文獻的研究。2．“與腎相關(guān)”疾病臨床流行病學(xué)調(diào)查研究。3. 研制本項目系列課題研究結(jié)果的綜合數(shù)據(jù)信息庫。4. 研制中醫(yī)“腎藏精”理論知識管理平臺。5. 臨床收集病例，并完成相應(yīng)生化以及神經(jīng)內(nèi)分泌指標的檢測；分離患者骨髓間充質(zhì)干細胞、造血干細胞、觀察補1.完成漢-唐時期相關(guān)中醫(yī)藥學(xué)文獻整理；1990-1999 年現(xiàn)代文獻整理；進行理論研究。2. 完成臨床流行病學(xué)調(diào)查 1/3 例數(shù)。3. 綜合數(shù)據(jù)信息庫平臺的試運行。4. 知識管理平臺的試運行。5. 提供相關(guān)臨床病例的數(shù)據(jù)資料。6. 提供動物實驗相關(guān)數(shù)據(jù)資料。7. 發(fā)表論文 30-35 篇。其中 SCI 收錄8-10 篇。申請專利 1-2 項。27年度研究內(nèi)容 預(yù)期目標腎方藥對它們的影響。6．動物實驗完成補腎干預(yù)模型大鼠的效果、激活內(nèi)源性干細胞效果的檢測和補腎干預(yù)神經(jīng)內(nèi)分泌免疫指標及對干細胞影響的檢測的年度工作量。7.體外實驗觀察補腎單體對成體干細胞行為的干預(yù)作用。第三年1．“腎藏精”理論相關(guān)文獻的研究。2．“與腎相關(guān)”疾病臨床流行病學(xué)調(diào)查研究。3. 調(diào)試本項目系列課題研究結(jié)果的綜合數(shù)據(jù)信息庫。4. 調(diào)試中醫(yī)“腎藏精”理論知識管理平臺。5. 臨床試驗繼續(xù)收集病例，并完成 NEI網(wǎng)絡(luò)指標和干細胞指標觀察。6. 動物實驗完成補腎干預(yù)模型大鼠的效果、激活內(nèi)源性干細胞效果的檢測和補腎干預(yù)神經(jīng)內(nèi)分泌免疫指標及對干細胞影響的檢測的年度工作量。7. 體外實驗檢測 2-3 個補腎單體干預(yù)神經(jīng)內(nèi)分泌免疫的主要途徑和細胞內(nèi)信號機制。1. 完成宋金元時期相關(guān)中醫(yī)藥學(xué)文獻整理；1980-1989 年現(xiàn)代文獻整理；進行理論研究。2. 完成臨床流行病學(xué)調(diào)查 1/3 例數(shù)。3. 運行綜合數(shù)據(jù)信息庫平臺，錄入數(shù)據(jù)。4. 運行知識管理平臺，錄入數(shù)據(jù)。5. 提供相關(guān)臨床病例的數(shù)據(jù)資料。6. 提供相關(guān)實驗數(shù)據(jù)資料。7. 發(fā)表論文 32-36 篇。其中 SCI 收錄8-10 篇。申請專利 1-2 項。28年度研究內(nèi)容 預(yù)期目標第四年1．“腎藏精”理論相關(guān)文獻的研究2．“與腎相關(guān)”疾病臨床流行病學(xué)調(diào)查研究3. 建立本項目系列課題研究結(jié)果的綜合數(shù)據(jù)信息庫；4. 建立中醫(yī)“腎藏精”理論知識管理平臺5. 臨床試驗完成所有病例收集，并完成 NEI 網(wǎng)絡(luò)指標和干細胞指標觀察。6. 動物實驗完成補腎干預(yù)模型大鼠的效果、激活內(nèi)源性干細胞效果的檢測和補腎干預(yù)神經(jīng)內(nèi)分泌免疫指標及對干細胞影響的檢測的年度工作量。7. 體外實驗檢測 2-3 個補腎單體干預(yù)神經(jīng)內(nèi)分泌免疫的主要途徑和細胞內(nèi)信號機制。1. 完成明清相關(guān)中醫(yī)藥學(xué)文獻整理；1970-1970 年現(xiàn)代文獻整理；進行理論研究。2. 完成臨床流行病學(xué)調(diào)查各疾病 1/3例數(shù)。3. 運行綜合數(shù)據(jù)信息庫平臺，錄入數(shù)據(jù)。4. 運行知識管理平臺，錄入數(shù)據(jù)。5. 提供相關(guān)臨床病例的數(shù)據(jù)資料。6. 提供相關(guān)實驗數(shù)據(jù)資料。7. 得到補腎中藥對 NEI 網(wǎng)絡(luò)和干細胞的作用結(jié)果。7. 發(fā)表論文 32-35 篇。其中 SCI 收錄8-10 篇。申請專利 1-2 項。第五年1． 完成文獻和流行病學(xué)調(diào)查的年度工作量。2． 各課題組完成課題任務(wù)書的所有研究內(nèi)容，資料匯總，總結(jié)和驗收3． 項目匯總所有課題資料，總結(jié)和驗收。1. 原始數(shù)據(jù)，實驗記錄本。2. 提交課題總結(jié)報告。3. 提交項目總結(jié)報告。4. 組織成果驗收與鑒定，爭取達到國際先進水平。項目通過驗收。 5. 擬發(fā)表論文 30-32 篇。其中 SCI 收錄 8-10 篇。出版專著 4-5 部。申請專利 1-2 項。29