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1、單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,,單擊此處編輯母版文本樣式,,第二級(jí),,第三級(jí),,第四級(jí),,第五級(jí),,,醫(yī)學(xué)PPT,*,第九章 核酸類藥物的分析,1,,醫(yī)學(xué)PPT,基本要求,掌握：,核酸的結(jié)構(gòu)和分類；嘌呤類藥物和嘧啶類藥物鑒別、檢查、含量測(cè)定的原理,,熟悉：,核酸的理化性質(zhì)；反義寡核苷酸藥物鑒別、檢查、含量測(cè)定的原理,2,,醫(yī)學(xué)PPT,第一節(jié) 概述,結(jié)構(gòu)和分類,,理化性質(zhì),3,,醫(yī)學(xué)PPT,什么是核酸？,1869,年核酸最早分離自外科繃帶膿細(xì)胞的,細(xì)胞核,，當(dāng)時(shí)發(fā)現(xiàn)這種物質(zhì)含磷量之高超過當(dāng)時(shí)發(fā)現(xiàn)的任何一種有機(jī)物，并且,含有很強(qiáng)的酸性,，故得名核酸。,,1909,年其組成被研究清楚，,1944,年
2、生物功能初步澄清，在,X,射線衍射技術(shù)支持下,1953,年結(jié)構(gòu)澄清。,,核酸是脫氧核糖核酸（,DNA,）與核糖核酸（,RNA,）的通稱,。,4,,醫(yī)學(xué)PPT,核酸,,,,,,核苷酸,磷酸,核苷,,,,,戊糖,堿基,,水,,,解,一、結(jié)構(gòu)和分類,5,,醫(yī)學(xué)PPT,,,,,,,,,,,,,,核 酸,代表,戊糖,，對(duì),DNA,而言為,脫氧核糖,，對(duì),RNA,而言為,核糖,；,,,,,代表,堿基,,,代表,磷酸基,,,核苷酸,6,,醫(yī)學(xué)PPT,核苷酸,磷酸,堿基,戊糖,7,,醫(yī)學(xué)PPT,,,H,2,O,,,H,2,O,堿基,磷酸,戊糖,糖苷鍵,酯鍵,,,8,,醫(yī)學(xué)PPT,核苷酸,,堿基連接（糖苷鍵
3、）,酯,鍵,,（對(duì),DNA,為,H,）,,1`,2`,3`,4`,5`,9,,醫(yī)學(xué)PPT,戊糖,,,核糖,,(in RNA),2,｀－脫氧核糖,,(in DNA),10,,醫(yī)學(xué)PPT,核苷,11,,醫(yī)學(xué)PPT,DNA & RNA,12,,醫(yī)學(xué)PPT,,堿基,,,,RNA,,DNA,,,嘧啶環(huán),,嘌呤環(huán),,尿嘧啶,U,,,胸腺嘧啶,T,胞嘧啶,C,鳥嘌呤,G,腺嘌呤,A,,13,,醫(yī)學(xué)PPT,類別,DNA,RNA,基本單位,脫氧核糖核苷酸,核糖核苷酸,核苷酸,腺嘌呤脫氧核苷酸 鳥嘌呤脫氧核苷酸 胞嘧啶脫氧核苷酸 胸腺嘧啶脫氧核苷酸,腺嘌呤核苷酸 鳥嘌呤核苷酸 胞嘧啶核苷酸 尿嘧啶核苷
4、酸,堿基,腺嘌呤（,A),鳥嘌呤（,G),胞嘧啶（,C),胸腺嘧啶（,T),腺嘌呤（,A),鳥嘌呤（,G),胞嘧啶（,C),尿嘧啶（,U,）,五碳糖,脫氧核糖,核糖,酸,磷酸,磷酸,14,,醫(yī)學(xué)PPT,稀有堿基,嘌呤,——,次黃嘌呤、,1-,甲基次黃嘌呤、,N,2,、,N,2,-,二甲基鳥嘌呤。,,嘧啶,——,5-,甲基胞嘧啶、,5-,羥甲基胞嘧啶、二氫尿嘧啶、,4-,巰尿嘧啶,,都是基本堿基的,化學(xué)修飾型,。,,15,,醫(yī)學(xué)PPT,鳥嘌呤,,,次黃嘌呤,1-,甲基次黃嘌呤,,16,,醫(yī)學(xué)PPT,二、理化性質(zhì),（一）兩性性質(zhì)：,磷酸基；堿基（通常：酸性）,,,pH,影響堿基間氫鍵穩(wěn)定：,DNA
5、 pH4.0~11.0,,（二）水解性：,微溶于水，不溶于一般的有機(jī)溶劑,,（三）,UV,：,λ,max=260nm,蛋白質(zhì),280nm,,A,260,/A,280,純,DNA,＞,1.8,,,純,RNA,應(yīng)達(dá)到,2.0,,,混有雜蛋白 比值降低,17,,醫(yī)學(xué)PPT,18,,醫(yī)學(xué)PPT,（四）變性和復(fù)性,,1.,變性：,在某些理化因素影響下，,DNA,雙螺旋區(qū)的氫鍵斷裂和堿基堆積力破壞，有規(guī)律的雙螺旋結(jié)構(gòu)變成單鏈無規(guī)律的,“,線團(tuán),”,，但不發(fā)生共價(jià)鍵的斷裂，這過程稱之。,,變性原因：高溫（一般＞,75℃,）、強(qiáng)氧化劑、強(qiáng)酸、堿、尿素等；,,機(jī)理：,雙鏈間氫鍵斷開，成為兩條單鏈（,DNA,
6、雙螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞，生物活性的喪失）,,特征性,Tm---DNA,的變性溫度,82~95℃,19,,醫(yī)學(xué)PPT,20,,醫(yī)學(xué)PPT,2.,復(fù)性,,一定條件下，去除變性因素后，核酸,恢復(fù)二級(jí)結(jié)構(gòu)及生物活性的現(xiàn)象,；通常使用,熱復(fù)性,。（退火）,,,,高溫變性,,,,緩慢冷卻,,,熱復(fù)性,,急速冷卻,,,復(fù)性失敗,熱復(fù)性在基因測(cè)序中被廣泛應(yīng)用,21,,醫(yī)學(xué)PPT,22,,醫(yī)學(xué)PPT,（五）顏色反應(yīng),,苔黑酚反應(yīng),:,,RNA,中核糖,+,濃,HCl,（濃,H,2,SO,4,）→糠醛,+,苔黑酚,→深綠色化合物（,λ,max=670nm,）,,二苯胺反應(yīng),:,,DNA,中脫氧核糖,+,濃,H,2,
7、SO,4,→5-,羥基,-4-,羰基戊醛,+,二苯胺→藍(lán)色化合物（,λ,max=595nm,）,,水解后磷酸：,,磷酸,+,鉬酸,→磷鉬酸,+,還原劑（維生素,C,、氯化亞錫等） →鉬藍(lán)（,λ,max=660nm,）,,Fe,3+,脫水,23,,醫(yī)學(xué)PPT,第二節(jié) 嘌呤類核苷酸藥物分析,嘌呤堿（腺嘌呤、鳥嘌呤）,,戊糖,,磷酸,24,,醫(yī)學(xué)PPT,一、鑒別,戊糖鑒別,,嘌呤鑒別,,磷酸鑒別,,特征吸收光譜,,熔點(diǎn)測(cè)定,25,,醫(yī)學(xué)PPT,（一）戊糖的鑒別,苔黑酚反應(yīng),（地衣酚反應(yīng)）,---,凡核糖均有此反應(yīng),,試劑：濃鹽酸，苔黑酚試劑，三氯化鐵（催化劑,）,,現(xiàn)象：鮮綠色,,二苯胺反應(yīng),DNA
8、,,試劑：濃硫酸，二苯胺,,現(xiàn)象：藍(lán)色,,與間苯三酚反應(yīng)（核苷酸中的戊糖）,,現(xiàn)象：玫瑰紅色,26,,醫(yī)學(xué)PPT,（二）嘌呤的鑒別,+,氨制硝酸銀→白色↓→紅棕色（遇光）,,（嘌呤堿基的特殊鑒別反應(yīng)）,27,,醫(yī)學(xué)PPT,（三）磷酸的鑒別,有機(jī)磷→無機(jī)磷,+,鉬酸→磷鉬酸,+,還原劑→鉬藍(lán),28,,醫(yī)學(xué)PPT,（四）特征吸收光譜,UV,：嘌呤環(huán)，嘧啶環(huán),,IR,29,,醫(yī)學(xué)PPT,（五）熔點(diǎn)測(cè)定,30,,醫(yī)學(xué)PPT,二、檢查,一般檢查,,酸度，水分，無機(jī)鹽，有機(jī)物，溶液的顏色和澄清度,,蛋白質(zhì)檢查,,磺基水楊酸溶液,,有關(guān)物質(zhì),,紙色譜，薄層色譜，電泳，熒光檢查,,31,,醫(yī)學(xué)PPT,三、含量
9、測(cè)定,紫外,-,可見分光光度法,,現(xiàn)在國家已經(jīng)批準(zhǔn)的,嘌呤類核苷酸藥物,一般都用,,此法測(cè)定含量,,HPLC,32,,醫(yī)學(xué)PPT,四、實(shí)例分析,肌苷,,ATP,33,,醫(yī)學(xué)PPT,（一）肌苷的質(zhì)量分析,1.,結(jié)構(gòu)：,C,10,H,12,N,4,O,5,268.23,,本品為,9β-D-,核糖次黃嘌呤。按干燥品計(jì)算，含,C,10,H1,2,N,4,O,5,應(yīng)為,98.0,～,102.0,％。,,2.,性狀：,,本品為白色結(jié)晶性粉末；無臭，味微苦。,,本品在水中略溶，在氯仿或乙醇中不溶，在稀鹽,,酸和氫氧化鈉溶液中易溶。,34,,醫(yī)學(xué)PPT,3.,鑒別,,取,0.01,％供試品溶液適量,,,加等體
10、積的,3,5-,二羥基甲苯溶液,(,取,3,，,5-,二羥基甲苯與三氯化鐵各,0.1g,，加鹽酸使成,100ml),，混勻，在水浴中加熱約,10,分鐘，即顯,綠色。,---,苔黑酚反應(yīng),,取本品,1,％水溶液，加氨制硝酸銀試液數(shù)滴，即產(chǎn)生,白色膠狀,沉淀。,---,嘌呤堿基,,,取含量測(cè)定項(xiàng)下的溶液,,,照分光光度法測(cè)定，在,248nm,的波長處有最大吸收，在,222nm,的波長處有最小吸收。,,色譜圖,,IR,35,,醫(yī)學(xué)PPT,4.,檢查,,,溶液的澄清度與顏色（溶液的透光率）,取本品,0.5g,，加水,50ml,使溶解，照分光光度法在,430nm,的波長處測(cè)定透光率，不得低于,98.0,
11、％,(,供注射用,),。,,干燥失重,取本品，在,105℃,干燥至恒重，減失重量不得過,1.0,,熾灼殘?jiān)?不得過,0.1,％,(,供注射用,),,或不得過,0.2,％,(,供口服用,,重金屬,取本品,1.0g,，依法檢查含重金屬不得過百萬分之十。,,次黃嘌呤,,①,精密稱取本品,0.5g,，置,50ml,量瓶中,,,加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，照紙色譜法試驗(yàn)，吸取上述溶,10μl,，點(diǎn)于,3×25cm,色譜濾紙上，照上行法，以水為展開劑，展開約,20cm,處，取出晾干，置紫外光燈,(254nm),下檢視，不得出現(xiàn)雜質(zhì)斑點(diǎn)。,②,HPLC,36,,醫(yī)學(xué)PPT,5.,含量測(cè)定,,,1,）,UV,
12、法：,取本品，精密稱定，加水制成每,1ml,中約含,10μg,的溶液，照分光光度法在,248nm,的波長處測(cè)定吸收度，按,C,10,H,12,N,4,O,5,的吸收系數(shù)（,E,1,％,1cm,）為,460,計(jì)算。,,2,）,HPLC,37,,醫(yī)學(xué)PPT,6.,作用與用途,輔酶類藥。有改善機(jī)體代謝作用。用于各種類型肝臟疾患、心臟疾患、白細(xì)胞減少癥、血小板減少癥、中心視網(wǎng)膜炎、視神經(jīng)萎縮等。,,7.,用法與用量,口服，一次,0.2,～,0.6g,一日,0.6,～,1.8g,,8.,貯藏,遮光，密閉保存。,,9.,制劑,(1),肌苷口服溶液,(2),肌苷片,(3),肌苷注射液,(4),肌苷膠囊,(5
13、),肌苷顆粒劑,38,,醫(yī)學(xué)PPT,（二）三磷酸腺苷二鈉（,ATP,）的質(zhì)量分析,,拼音名：,Sanlinsuanxiangan,‘,erna,英文名：,Adenosine Disodium Triphosphate C,10,H,14,N,5,Na,2,O,13,P,3,551.15,,1.,結(jié)構(gòu)：,本品為腺嘌呤核苷,-5,’,-,三磷酸酯二鈉鹽三水化合物。按干燥品計(jì)算，含,C,10,H,14,N,5,Na,2,O,13,P,3,不得少于,90.0,％。,39,,醫(yī)學(xué)PPT,2.,性狀：,本品為白色或類白色粉末或結(jié)晶塊狀物；無臭，味咸；有引濕性。 本品在水中易溶，在乙醇、氯仿或乙醚
14、中幾乎不溶。,,40,,醫(yī)學(xué)PPT,3.,鑒別,,（,1,）取本品,20mg,,加稀硝酸,2ml,溶解后，加鉬酸銨試液,1ml,，加熱，放冷，即析出黃色沉淀。,---,磷酸鹽,,（,2,）取本品約,10mg,，加鹽酸溶液,(1→2)5ml,溶解后，加,間苯三酚,10mg,，混勻，置水浴中加熱約,1,分鐘，即顯玫瑰紅色。,--,戊糖,,（,3,）苔黑酚反應(yīng),—,戊糖,,（,3,）,UV,,（,4,）,IR,,（,5,）本品的水溶液顯鈉鹽的鑒別反應(yīng),41,,醫(yī)學(xué)PPT,4.,檢查,,酸度,,溶液的澄清度與顏色,,蛋白質(zhì),取本品,20mg,，加水,2ml,溶解后，滴加,30,％,磺基水楊酸,溶液,0
15、.5ml,，不得發(fā)生渾濁。,,有關(guān)物質(zhì),,水分,,氯化物,,鐵鹽,,重金屬,,熱原,42,,醫(yī)學(xué)PPT,5.,含量測(cè)定,,,（,1,）總核苷酸：,UV,,（,2,）三磷酸腺苷二鈉的重量比：,HPLC,,（,3,）色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn),,（,4,）測(cè)定法,43,,醫(yī)學(xué)PPT,6.,作用與用途,,輔酶類藥。用于進(jìn)行性肌萎縮、腦溢血后遺癥、心功能不全、心肌疾患及肝炎等。,,7.,注意,,緩慢注射。心肌硬塞和腦溢血在發(fā)病期患者慎用。,,8.,貯藏,,有陰涼干燥處密封保存。有效期１年。,,9.,制劑,,(1),三磷酸腺苷二鈉注射液,(2),注射用三磷酸腺苷二鈉,,44,,醫(yī)學(xué)PPT,第三節(jié) 嘧啶類核
16、苷酸藥物的分析,45,,醫(yī)學(xué)PPT,一、鑒別,,該類藥物的化學(xué)組成和性質(zhì)本與嘌呤類,,相似，唯一區(qū)別在于堿基的不同。,,,一元堿,46,,醫(yī)學(xué)PPT,二、檢查,常規(guī)檢查,,其他核苷酸：,TLC,47,,醫(yī)學(xué)PPT,三、含量測(cè)定,UV,法,,電位滴定法,48,,醫(yī)學(xué)PPT,四、實(shí)例分析,---,氟尿嘧啶,1.,通用名,:,氟尿嘧啶,,,,,化學(xué)名,: 5-,氟,-2,4(1H,3H)-,嘧啶二酮,,分子式,: C,4,H,3,FN,2,O,2,,,分子量,: 130.08,,熔 點(diǎn),: 278-286,℃,,,水溶性,: 12.2g/L 20,℃,,含氟尿嘧啶（,C4H3FN202,）應(yīng)為標(biāo)示
17、量的,93.0-107.0%,49,,醫(yī)學(xué)PPT,2.,性狀：,白色或類白色結(jié)晶或結(jié)晶性粉末。,,在水中略溶，乙醇中微溶，三氯甲烷中幾乎不溶，在稀鹽酸或氫氧化鈉溶液中溶解。,50,,醫(yī)學(xué)PPT,3.,鑒別,,（,1,）,+,溴，溴褪色；,+,氫氧化鋇，紫色,↓,,（,2,）,三,氧化鉻的飽和硫酸溶液，均勻涂于管壁,,本品，不能再均勻涂于管壁,,（,3,）,λ,max=265nm,λ,min=232nm,,（,4,）,IR,51,,醫(yī)學(xué)PPT,4.,檢查：,,氯化物,,硫酸鹽,,含氟量,,干燥失重,,重金屬,52,,醫(yī)學(xué)PPT,5.,含量測(cè)定：,取本品適量，加,0.1mol/L,鹽酸溶液制成每,
18、1mL,中約含,10μg,的溶液，照紫外,-,可見分光光度法，在,265nm,波長處，測(cè)定吸光度，按,C,4,H,3,FN,2,O,2,的吸收系數(shù)（,E,1%,1cm,）為,552,計(jì)算，即得。,53,,醫(yī)學(xué)PPT,54,,醫(yī)學(xué)PPT,用途：,本品為嘧啶類的氟化物，屬于抗代,,謝抗腫瘤藥，能抑制胸腺嘧啶核苷酸合成,,酶，阻斷脫氧嘧啶核苷酸轉(zhuǎn)換成胸腺嘧啶,,核苷核，干擾,DNA,合成。對(duì),RNA,的合成也有,,一定的抑制作用。,,55,,醫(yī)學(xué)PPT,不良反應(yīng)：,,骨髓抑制：主要為白細(xì)胞減少、血小板下降。,,食欲不振、惡心、嘔吐、口腔炎、胃炎、腹痛及腹瀉等胃腸道反應(yīng)。,,注射局部有疼痛、靜脈炎或動(dòng)
19、脈內(nèi)膜炎。,,其他：常有脫發(fā)、紅斑性皮炎、皮膚色素沉著手足綜合征及暫時(shí)性小腦運(yùn)動(dòng)失調(diào)，偶有影響心臟功能,56,,醫(yī)學(xué)PPT,注意事項(xiàng)：,,用藥期間應(yīng)嚴(yán)格檢查血象。避光置陰暗處保存，溫度不應(yīng)低于,10℃,，亦不宜超過,35℃,。治療期涂藥范圍有炎癥，,,停藥后炎癥消退。本品可引起嚴(yán)重的皮膚刺激，尤其在日光下。,,該藥還可經(jīng)皮損內(nèi)注射給藥用于角化棘皮病、疣和汗孔角化病。其主要副作用為注射期間有的燒感，繼之有局部紅斑、水腫甚至潰瘍。,57,,醫(yī)學(xué)PPT,第四節(jié) 反義寡核苷酸藥物分析,1.,定義,,2.,化學(xué)修飾：硫代修飾,,3.,序列分析：化學(xué)測(cè)序法；質(zhì)譜法,,4.,雜交性質(zhì),,5.,理化特性分析,,（鑒別：,HPLC,，,CE,）,,（特殊雜質(zhì)：失敗序列；硫代不充分）,,6.,生物活性測(cè)定,58,,醫(yī)學(xué)PPT,
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