內(nèi)毒素及其去除.ppt

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內(nèi)毒素及其去除,內(nèi)毒素結(jié)構(gòu)和性質(zhì),內(nèi)毒素的危害及檢測,內(nèi)毒素去除的方法,構(gòu)建生物經(jīng)濟(jì)體系 打造生物經(jīng)濟(jì)旗艦,,內(nèi)毒素也稱為脂多糖或LPS，是革蘭氏陰性菌胞壁上一種成分（少數(shù)陽性菌也能產(chǎn)生）。其細(xì)胞壁外膜的外部脂質(zhì)成分完全由內(nèi)毒素分子組成 ，死亡時(shí)則會釋放大量內(nèi)毒素。一個(gè)大腸桿菌細(xì)胞約含有200萬個(gè)LPS分子,內(nèi)毒素是什么,構(gòu)建生物經(jīng)濟(jì)體系 打造生物經(jīng)濟(jì)旗艦,,疏水性，毒性部分,結(jié)構(gòu)復(fù)雜，特異性部分,帶負(fù)電,功能部分,構(gòu)建生物經(jīng)濟(jì)體系 打造生物經(jīng)旗艦,,結(jié) 構(gòu),不同的革蘭氏陰性細(xì)菌,其 LPS的化學(xué)組成有一定的差別,但都含有內(nèi)脂 A 部分,,內(nèi)毒素性質(zhì),,單體,膠束,囊狀,內(nèi)毒素存在形式,構(gòu)建生物經(jīng)濟(jì)體系 造生物經(jīng)濟(jì)旗艦,構(gòu)建生物經(jīng)濟(jì)體系 打造生物經(jīng)濟(jì)旗艦,內(nèi)毒素的危害,冷顫,發(fā)熱，頭痛,惡心，嘔吐，臉色蒼白,血液循環(huán)障礙,休克,死亡,醫(yī)藥制劑 本身不合格或放置時(shí)間過長,輸液器 未消毒徹底,注射器 操作污染,2ng/kg體重即能引起發(fā)熱,構(gòu)建生物經(jīng)濟(jì)體系 打造生物經(jīng)濟(jì)旗艦,藥品、生物制品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L，EU/mg）一般按以下公式確定：,,,K 為人每公斤體重每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量，單位 EU/（kg h） M 為人每公斤體重每小時(shí)的最大供試品劑量，單位mg/（kg h）,生物制品中內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn),細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)在制定時(shí)應(yīng)定為計(jì)算值的1/3~1/2。,我國藥典要求注射劑中細(xì)菌內(nèi)毒素＜1EU/ml,內(nèi)毒素與鱟試劑的凝膠反應(yīng),簡單,經(jīng)濟(jì), 不需專用測定設(shè)備,特異性不強(qiáng) 精密度、定量性差,簡單、快速、靈敏度高、檢測范圍寬,需精密的專用儀器,精度高、靈敏度高,儀器和試劑貴,操作比較復(fù)雜,部分藥品由于自身特殊性無法通過稀釋法消除干擾，因此鱟試驗(yàn)還無法完全取代家兔熱原試驗(yàn),常用內(nèi)毒素檢測方法,內(nèi)毒素去除的難點(diǎn),構(gòu)建生物經(jīng)濟(jì)體系 打造生物經(jīng)濟(jì)旗艦,內(nèi)毒素,去除內(nèi)毒的方法,1.高溫烘烤 熱原的耐熱性能良好，60℃加熱1h不被分解破壞，100℃不降解，但180℃3～4h、200℃60min或250℃30～45min可使熱原徹底破壞。此法適合玻璃器皿的去內(nèi)毒,2.堿消毒（室溫條件下）,,主要用于玻璃、 塑料和其它高分子材料器皿上內(nèi)毒素的去除,4.蒸餾法，超濾法，反滲透，此法一般在生產(chǎn)注射用水時(shí)用到，蒸餾需要多級蒸餾并且加隔沫裝置，反滲透成本高。,5.吸附法，內(nèi)毒素在水溶液中可被活性炭、石棉、白陶土等吸附而除去。由于對蛋白有吸附故不適合用于生物制品。,6.層析法，選用合適的層析填料和溶液體系，能夠有效去除產(chǎn)品中的內(nèi)毒素，是目前單抗純化生產(chǎn)中的主流工藝。,內(nèi)毒素去除方法存在選擇性差，樣品回收率低等問題。下面主要介紹幾種生產(chǎn)中常用的方法,構(gòu)建生物經(jīng)濟(jì)體系 打造生物經(jīng)濟(jì)旗艦,7.相分離法、適用于蛋白制品，但各有缺點(diǎn)。,相分離法Triton X-114,此法用于較大重組蛋白質(zhì)（rCK-bb、Rck-mb）中LPS的去除，經(jīng)過三次相分離后，LPS從104 EU/ml降到了幾個(gè)EU/ml，去除率超過97%，蛋白的回收率大于90%。,適用于親水性蛋白的內(nèi)毒去除，會使一些有毒的 Triton X-114 殘存在蛋白溶液中,構(gòu)建生物經(jīng)濟(jì)體系 打造生物經(jīng)濟(jì)旗艦,離子交換層析的速度快、載量高、濃縮效應(yīng)好,在早期下游純化中擔(dān)當(dāng)重要角色。一般而言,內(nèi)毒素比蛋白質(zhì)在陰離子交換介質(zhì)上的結(jié)合強(qiáng)很多,分子量越小的內(nèi)毒素結(jié)合得越強(qiáng),多數(shù)要在柱再生(1M氯化鈉) 或在位清洗(1M氫氧化鈉)時(shí)才從介質(zhì)上洗脫下來,構(gòu)建生物經(jīng)濟(jì)體系 打造生物經(jīng)濟(jì)旗艦,陰離子交換層析,,,,,內(nèi)毒素在pH〉2時(shí)都是帶負(fù)電。陰離子層析填料自身帶正電能夠吸附內(nèi)毒。可使用流穿模式，上樣前樣品PH控制在目的蛋白PI以下，使其帶正電。這樣內(nèi)毒素結(jié)合在填料上，目的蛋白直接流穿,,如二乙胺乙基（DEAE）陰離子交換介質(zhì)適于從堿性蛋白質(zhì)（即帶正電的蛋白質(zhì)，如尿激酶）中去除內(nèi)毒素，,,成本低，吸附容量大，但這種方法不適用于帶負(fù)電荷的蛋白,構(gòu)建生物經(jīng)濟(jì)體系 打造生物經(jīng)濟(jì)旗艦,疏水與分子篩,疏水層析法利用高鹽增加蛋白疏水性與介質(zhì)結(jié)合，而在高鹽體系中內(nèi)毒素由于脂質(zhì)A部分有很強(qiáng)的疏水性發(fā)凝 集，無法與層析介質(zhì)結(jié)合，因此能夠有效去除內(nèi)毒素,分子篩是利用凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)根據(jù)分子大小進(jìn)行分離的一種方法。一般抗體分子量為幾萬道爾頓,而內(nèi)毒素分子量為幾十萬至上百萬道爾頓,常是多聚體,因此利用分子篩可以有效去除內(nèi)毒素,但其處理量小,處理時(shí)間較長。,構(gòu)建生物經(jīng)濟(jì)體系 打造生物經(jīng)濟(jì)旗艦,親和層析 以組氨酸 、 組胺、 多粘菌素 B、聚陽離子等為配基,,將內(nèi)毒素底物L(fēng)AL或多粘菌素B(PMB)偶聯(lián)于CNBr-Sepharose 或NHS-Sepharose上,以此介質(zhì)特異性吸附內(nèi)毒素,而讓蛋白通過 。,親和層析,構(gòu)建生物經(jīng)濟(jì)體系 打造生物經(jīng)濟(jì)旗艦,親和層析,親和配基 PMB 與內(nèi)毒素之間的作用主要是疏水與靜電作用,而鹽濃度即離子強(qiáng)度的變化會反方向影響這兩種作用 : 離子強(qiáng)度增大會增強(qiáng)親和配基PMB與內(nèi)毒素之間的疏水作用,同時(shí)又會減小兩者之間的靜電作用 ; 離子強(qiáng)度減小會減小親和配基PMB與內(nèi)毒素之間的疏水作用,同時(shí)又會增大兩者之間的靜電作用。疏水作用與靜電作用的協(xié)同作用導(dǎo)致了上述結(jié)果。,構(gòu)建生物經(jīng)濟(jì)體系 打造生物經(jīng)濟(jì)旗艦,在低pH時(shí),內(nèi)毒素分子中磷酸酯基和羧基離子化減小。在分子內(nèi)疏水作用的驅(qū)使下內(nèi)毒素分子趨于更為緊湊的結(jié)構(gòu),從而減少了相互作用的位點(diǎn),導(dǎo)致去除率的下降。隨著溶液pH的增大,內(nèi)毒素分子的緊湊結(jié)構(gòu)被分子內(nèi)靜電相互作用破壞,舒展的結(jié)構(gòu)使內(nèi)毒素分子與固載于瓊脂糖上的配基產(chǎn)生更為有效的作用,導(dǎo)致去除率的升高。 在高 pH 下內(nèi)毒素去除率的下降可能是因?yàn)殒I合于基質(zhì)上的疏水配基的構(gòu)像發(fā)生扭曲變形所致。,親和層析,多種層析方法組合效果,,構(gòu)建生物經(jīng)濟(jì)體系 打造生物經(jīng)濟(jì)旗艦,生物技術(shù)藥品的純化,主要是采用各種柱層析技術(shù),如疏水層析、離子交換、親和層析、分子篩等,這些技術(shù)純化目標(biāo)產(chǎn)品的同時(shí)也可以有效去除內(nèi)毒素,雖然生物制品中內(nèi)毒素的除去方法很多，但還是很難將內(nèi)毒素徹底去除，為了從根本上解決內(nèi)毒素的困擾，在生產(chǎn)前我們應(yīng)該對生產(chǎn)環(huán)境，生產(chǎn)器具，操作方法等進(jìn)行嚴(yán)格控制，將內(nèi)毒素污染風(fēng)險(xiǎn)降到最低,Thank You,