《《免疫共沉淀》PPT課件》由會員分享，可在線閱讀，更多相關《《免疫共沉淀》PPT課件（10頁珍藏版）》請在裝配圖網(wǎng)上搜索。
1、免疫共沉淀揚州大學生物科學與技術學院 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用于研究蛋白質相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質在完整細胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。 其原理是：當細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內(nèi)存在的許多蛋白質蛋白質間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質x的抗體免疫沉淀x，那么與x在體內(nèi)結合的蛋白質y也能沉淀下來。這種方法常用于測定兩種目標蛋白質是否在體內(nèi)結合；也可用于確定一種特定蛋白質的新的作用搭檔。原理 優(yōu)點1.相互作用的蛋白質都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)；2.蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進行的，可以避免人
2、為的影響；3.可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復合物。 缺點1.可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質蛋白質相互作用2.兩種蛋白質的結合可能不是直接結合，而可能有第三者在中間起橋梁作用； 3.如用western blot檢驗，必須在實驗前預測目的蛋白是什么，以選擇最后檢測的抗體，若預測不正確，實驗就得不到結果。 實驗的關鍵1.實驗最需要注意點就是抗體的性質?？贵w不同和抗原結合能力也不同，免染能結合未必能用在IP反應。建議仔細檢查抗體的說明書。特別是多抗的特異性是問題。2.為防止蛋白的分解，修飾，溶解抗原的緩沖液必須加蛋白酶抑制劑，低溫下進行實驗。3.考慮抗體/緩沖液的比例?？贵w過少就不能檢出抗原
3、，過多則就不能沉降在beads上，殘存在上清。緩沖劑太少則不能溶解抗原，過多則抗原被稀釋。 Co-IP工作示意圖Co-immunoprecipitation binding wash elutionY Y Y Y Y 利用western blot 確定捕獲蛋白 通過質譜確定捕獲的蛋白 1.收獲細胞，加入適量細胞裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30min, 細胞裂解液于4c， 最大轉速離心30 min后取上清；2.取少量裂解液以備western blot分析，剩余裂解液加1g相應的抗體加入到細胞裂解液，4c緩慢搖晃孵育過夜；3.取10l protein a 瓊脂糖珠，用適量裂解緩沖液洗3
4、次，每次3,000 rpm離心3 min；4.將預處理過的10l protein a 瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過夜的細胞裂解液中4c緩慢搖晃孵育2-4h，使抗體與protein a瓊脂糖珠偶連；5.免疫沉淀反應后，在4c 以3,000 rpm 速度離心3 min，將瓊脂糖珠離心至管底；將上清小心吸去，瓊脂糖珠用1ml裂解緩沖液洗34次；最后加入15l的2sds 上樣緩沖液，沸水煮5分鐘；6. sds-page, western blotting或質譜儀分析。實驗步驟 實驗注意事項 （1）細胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破壞細胞內(nèi)存在的所有蛋白質蛋白質相互作用，多采用非離子變性劑（np40或tr
5、iton x-100)。每種細胞的裂解條件是不一樣的，通過經(jīng)驗確定。不能用高濃度的變性劑（0.2 sds)，細胞裂解液中要加各種酶抑制劑，如商品化的cocktailer。 （2）使用明確的抗體，可以將幾種抗體共同使用 （3）使用對照抗體： 單克隆抗體：正常小鼠的igg或另一類單抗 兔多克隆抗體：正常兔igg (4) 確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的，而并非外源非特異蛋白，單克隆抗體的使用有助于避免污染的發(fā)生； (5) 要確?？贵w的特異性，即在不表達抗原的細胞溶解物中添加抗體后不會引起共沉淀； (6) 確定蛋白間的相互作用是發(fā)生在細胞中，而不是由于細胞的溶 解才發(fā)生的，這需要進行蛋白質的定位來確定。
《免疫共沉淀》PPT課件
