《熒光免疫技術(shù)》PPT課件

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1、第 八 章 熒 光 免 疫 技 術(shù)第 一 節(jié) 概 述 一 、 熒 光 的 基 本 知 識(shí) 二 、 熒 光 物 質(zhì) 第 二 節(jié) 熒 光 抗 體 技 術(shù) 一 、 標(biāo) 本 的 制 作 二 、 熒 光 抗 體 的 制 備 三 、 熒 光 抗 體 染 色 與 結(jié) 果 判 斷 四 、 熒 光 顯 微 鏡 的 基 本 結(jié) 構(gòu)第 三 節(jié) 熒 光 免 疫 分 析 的 類 型 一 、 時(shí) 間 分 辨 熒 光 免 疫 測(cè) 定 二 、 熒 光 偏 振 免 疫 測(cè) 定 三 、 熒 光 酶 免 疫 測(cè) 定 第 四 節(jié) 熒 光 免 疫 技 術(shù) 在 醫(yī) 學(xué) 檢 驗(yàn) 中 的 應(yīng) 用 一 、 熒 光 抗 體 技 術(shù) 的 應(yīng) 用

2、二 、 熒 光 免 疫 測(cè) 定 的 應(yīng) 用思 考 題小 結(jié) 第 一 節(jié) 概 述 熒 光 （ fluorescence） 熒 光 物 質(zhì) 吸 收 激 發(fā) 光 的 能 量 后 ， 電 子 從 基 態(tài) 躍遷 到 激 發(fā) 態(tài) ， 當(dāng) 其 回 復(fù) 至 基 態(tài) 時(shí) ， 以 發(fā) 射 光 形 式 釋放 出 能 量 ， 稱 為 熒 光 。 一 、 熒 光 的 基 本 知 識(shí) 發(fā) 射 光 譜 和 激 發(fā) 光 譜 發(fā) 射 光 譜 是 指 固 定 激 發(fā) 波 長(zhǎng) ， 在 不 同 波 長(zhǎng) 下 記 錄 的 樣品 發(fā) 射 熒 光 的 強(qiáng) 度 。激 發(fā) 光 譜 是 指 固 定 檢 測(cè) 發(fā) 射 波 長(zhǎng) ， 用 不 同 波 長(zhǎng)

3、的 激 發(fā)光 激 發(fā) 樣 品 記 錄 的 相 應(yīng) 的 熒 光 發(fā) 射 強(qiáng) 度 。 熒 光 的 基 本 知 識(shí) 熒 光 效 率定 義 :熒 光 物 質(zhì) 分 子 將 光 能 轉(zhuǎn) 變 成 熒 光 的 百 分 率計(jì) 算 公 式 : 熒 光 效 率 = 發(fā)光強(qiáng)度）吸收光的光量子數(shù)（激熒光強(qiáng)度）發(fā)射熒光的光量子數(shù)（熒 光 的 基 本 知 識(shí) 熒 光 壽 命定 義 :熒 光 物 質(zhì) 被 激 發(fā) 后 所 產(chǎn) 生 的 熒 光 衰 減 到 一 定 程度 時(shí) 所 用 的 時(shí) 間 。各 種 熒 光 物 質(zhì) 的 熒 光 壽 命 不 同 。 熒 光 的 基 本 知 識(shí) 熒 光 淬 滅 定 義 :熒 光 物 質(zhì) 在 某 些

4、 理 化 因 素 作 用 下 ， 發(fā) 射 熒 光 減 弱 甚 至消 退 稱 為 熒 光 淬 滅 。 如 紫 外 線 照 射 、 高 （ 20 ） 、 苯 胺 、酚 、 硝 基 苯 、 I-等 。熒 光 的 基 本 知 識(shí) 熒 光 偏 振 FHFL PFHFL熒 光 的 基 本 知 識(shí) 熒 光 物 質(zhì) 最 大 吸 收 光 譜 最 大 發(fā) 射 光 譜 應(yīng) 用異 硫 氰 酸 熒 光 素 (FITC) 490 495nm 520 530nm （ 黃 綠 色 ） FAT、 熒 光 偏 振 免 疫 測(cè) 定四 乙 基 羅 丹 明 (RB200) 570 575nm 595 600nm（ 橙 紅 色 ） FI

5、TC的 襯 比 染 色 或 雙 標(biāo)記 FAT四 甲 基 異 硫 氰 酸 羅 丹明 (TRITC) 550nm 620nm（ 橙 紅 色 ） FITC的 襯 比 染 色 或 雙 標(biāo)記 FAT藻 紅 蛋 白 （ PE） 490-560nm 595nm（ 紅 色 ） 雙 標(biāo) 記 FAT、 流 式 細(xì) 胞 術(shù)7-氨 基 -4-甲 基 香 豆 素 354nm 430nm（ 藍(lán) 色 ） 雙 標(biāo) 記 或 多 標(biāo) 記 FATEu 3+螯 合 物 340nm 613nm 時(shí) 間 分 辨 熒 光 免 疫 測(cè) 定 熒 光 物 質(zhì) 是 一 類 能 吸 收 激 發(fā) 光 的 光 能 而 發(fā) 射 熒 光 的 物 質(zhì) 。 常

6、 用 的 熒 光 物 質(zhì) 二 、 熒 光 物 質(zhì) 第 二 節(jié) 熒 光 抗 體 技 術(shù) 熒 光 抗 體 技 術(shù) 的 基 本 原 理 熒 光 素 標(biāo) 記 抗 體 與 切 片 中 組 織 細(xì) 胞 抗 原 反 應(yīng) ，洗 滌 分 離 后 熒 光 顯 微 鏡 觀 察 呈 現(xiàn) 特 異 熒 光 的 抗 原 抗體 復(fù) 合 物 及 其 部 位 ， 對(duì) 組 織 細(xì) 胞 抗 原 進(jìn) 行 定 性 和 定位 檢 測(cè) ， 或 對(duì) 自 身 抗 體 進(jìn) 行 定 性 和 滴 度 測(cè) 定 。 熒 光 抗 體 技 術(shù) 的 內(nèi) 容 熒 光 抗 體 制 備 標(biāo) 本 制 作 熒 光 抗 體 染 色 熒 光 顯 微 鏡 檢 查 抗 體 要

7、求 高 特 異 性 高 親 和 力 經(jīng) 純 化 提 取 IgG 一 、 熒 光 抗 體 的 制 備 v有 能 與 蛋 白 質(zhì) 形 成 共 價(jià) 健 的 化 學(xué) 基 團(tuán) ， 與 蛋 白 質(zhì) 結(jié) 合 后 不 易 解離 ， 而 未 結(jié) 合 的 色 素 及 其 降 解 產(chǎn) 物 易 于 清 除 。v熒 光 效 率 高 ， 與 蛋 白 質(zhì) 結(jié) 合 后 ， 仍 保 持 較 高 的 熒 光 效 率 。v熒 光 色 澤 與 背 景 組 織 的 色 澤 對(duì) 比 鮮 明 。v與 蛋 白 質(zhì) 結(jié) 合 后 不 影 響 蛋 白 質(zhì) 原 有 的 生 化 與 免 疫 性 質(zhì) 。v標(biāo) 記 方 法 簡(jiǎn) 單 、 安 全 無(wú) 毒 。v

8、與 蛋 白 質(zhì) 的 結(jié) 合 物 穩(wěn) 定 ， 易 于 保 存 。熒 光 素 要 求熒 光 抗 體 的 制 備 抗 體 的 熒 光 素 標(biāo)記v標(biāo) 記 原 理 :利 用 抗 體 蛋 白 的 自 由 氨 基 與 FITC的 異 硫 氰 基 在 堿 性 溶 液中 形 成 硫 碳 酰 胺 鍵 ， 使 抗 體 與 FITC結(jié) 合 成 熒 光 抗 體 。v標(biāo) 記 方 法 : 攪 拌 法 ： 適 于 標(biāo) 記 體 積 較 大 、 蛋 白 含 量 較 高 的 抗 體 。 標(biāo) 記 時(shí) 間 短 ， 熒 光 素 用 量 少 ， 但 有 非 特 異 性 染 色 。 透 析 法 ： 適 于 標(biāo) 記 樣 品 量 少 ， 蛋 白

9、 含 量 低 的 抗 體 。 標(biāo) 記 比 較 勻 ， 非 特 異 染 色 較 低 。 熒 光 抗 體 的 制 備 v去 除 游 離 熒 光 素 及 其 降 解 產(chǎn) 物 ： 透 析 或 凝 膠 過(guò) 濾v去 除 熒 光 素 未 結(jié) 合 和 結(jié) 合 過(guò) 度 的 抗 體 ： 陰 離 子 交 換 層 析 法v去 除 交 叉 反 應(yīng) 或 非 期 望 抗 體 ： 動(dòng) 物 肝 粉 吸 收 或 固 相 抗 原 吸 收熒 光 抗 體 的 純 化熒 光 抗 體 的 制 備 v熒 光 素 與 蛋 白 結(jié) 合 率 ： F/P=v抗 體 效 價(jià) ： 雙 向 免 疫 擴(kuò) 散 試 驗(yàn)v抗 體 特 異 性 ： 吸 收 試 驗(yàn)

10、、 抑 制 試 驗(yàn)v抗 體 抗 體 特 異 性 染 色 滴 度 ： 倍 比 稀 釋 nmnm AA A 495280 495nm35.087.2 熒 光 抗 體 的 鑒 定熒 光 抗 體 的 制 備 v-20 ： 保 存 1 2年v真 空 干 燥 ： 長(zhǎng) 期 保 存熒 光 抗 體 的 保 存熒 光 抗 體 的 制 備 組 織 切 片 ： 冷 凍 切 片 、 石 蠟 切 片 （ 最 常 用 ）印 片 ： 肝 、 脾 、 淋 巴 結(jié) 等 器 官 或 組 織 涂 片 ： 各 種 體 液 、 穿 刺 液 、 細(xì) 菌 培 養(yǎng) 物 和 細(xì) 胞 懸 液培 養(yǎng) 細(xì) 胞 ： 單 層 培 養(yǎng) 細(xì) 胞標(biāo) 本 的 類

11、 型二 、 標(biāo) 本 的 制 作 冷 凍 切 片 ： 操 作 簡(jiǎn) 單 ， 抗 原 損 失 少 ， 組 織 細(xì) 胞 結(jié) 構(gòu) 欠 清 晰 。 石 蠟 切 片 ： 組 織 細(xì) 胞 結(jié) 構(gòu) 顯 現(xiàn) 清 楚 ， 抗 原 損 失 多 。組 織 切 片 的 類 型標(biāo) 本 的 制 作 固 定 劑 ： 乙 醇 、 甲 醇 、 丙 酮 、 甲 醛 等 保 存 ： 4 、 -20標(biāo) 本 的 固 定 和 保 存標(biāo) 本 的 制 作 直 接 法 直 接 熒 光 抗 體 染 色 法 示 意 圖 熒 光 素 標(biāo) 記 的 特 異性 抗 體 直 接 與 相 應(yīng)抗 原 反 應(yīng) 。三 、 熒 光 抗 體 染 色 及 結(jié) 果 判 斷 間

12、 接 法特 異 性 抗 體 與 相 應(yīng) 抗原 反 應(yīng) ， 熒 光 素 標(biāo) 記的 抗 抗 體 再 與 第 一 抗體 結(jié) 合 。 間 接 熒 光 抗 體 染 色 法 示 意 圖 熒 光 抗 體 染 色 及 結(jié) 果 判 斷 雙 標(biāo) 記 法 兩 種 熒 光 素 分 別 標(biāo) 記 的 兩 種 不 同 的 特 異 性 抗 體 ，與 同 一 標(biāo) 本 反 應(yīng) ， 熒 光 顯 微 鏡 觀 察 兩 種 顏 色 熒 光 。熒 光 抗 體 染 色 及 結(jié) 果 判 斷 設(shè) 立 實(shí) 驗(yàn) 對(duì) 照 :陽(yáng) 性 對(duì) 照 和 陰 性 對(duì) 照 區(qū) 分 特 異 和 非 特 異 染 色 陽(yáng) 性 細(xì) 胞 顯 色 分 布 :胞 質(zhì) 型 、 胞

13、 核 型 和 膜 表 面 型熒 光 抗 體 染 色 結(jié) 果 判 斷熒 光 抗 體 染 色 及 結(jié) 果 判 斷 “ -” ： 無(wú) 或 僅 見(jiàn) 極 微 弱 熒 光 。 “ +” ： 熒 光 較 弱 但 清 楚 可 見(jiàn) 。 “ +” ： 熒 光 明 亮 。 “ +” ： 耀 眼 強(qiáng) 熒 光 。特 異 熒 光 強(qiáng) 度 “ +” 以 上 判 定 為 陽(yáng) 性 ， 對(duì) 照 光 應(yīng) 呈 “ -” 或“ ” 。根 據(jù) 呈 +的 血 清 最 高 稀 釋 度 判 定 特 異 性 抗 體 效 價(jià) 。 熒 光 抗 體 染 色 結(jié) 果 判 斷熒 光 抗 體 染 色 及 結(jié) 果 判 斷 熒 光 顯 微 鏡 利 用 一 定

14、波 長(zhǎng) 的 激 發(fā) 光 對(duì)樣 品 進(jìn) 行 激 發(fā) ， 產(chǎn) 生 一 定 波 長(zhǎng)的 熒 光 ， 對(duì) 樣 品 結(jié) 構(gòu) 或 其 組 分進(jìn) 行 定 性 、 定 位 、 定 量 觀 察 檢測(cè) 。 四 、 熒 光 顯 微 鏡 的 基 本 結(jié) 構(gòu) 光 源 ： 高 壓 汞 燈 、 氙 燈 或 鹵 素 燈 濾 光 片 ： 隔 熱 、 激 發(fā) 和 吸 收 濾 光 片光 路 ： 透 射 光 、 落 射 光聚 光 器 ： 明 視 野 、 暗 視 野 和 相 差 熒 光 聚 光 器鏡 頭 ： 消 色 差 鏡 頭 熒 光 顯 微 鏡熒 光 顯 微 鏡 的 基 本 結(jié) 構(gòu) 隔 熱 濾 光 片 ： 阻 斷 紅 外 線 通 過(guò)

15、而 隔 熱 。 激 發(fā) 濾 光 片 ： 位 于 光 源 和 物 鏡 之 間 ， 能 選 擇 性 地 透 過(guò) 紫 外 線 可 見(jiàn) 波 長(zhǎng) 的 光 域 ， 提 供 合 適 的 激 發(fā) 光 。 吸 收 濾 光 片 ： 位 于 物 鏡 和 目 鏡 之 間 ， 阻 斷 激 發(fā) 光 而 使 發(fā) 射 的 熒 光 透 過(guò) ，保 護(hù) 眼 睛 。 熒 光 顯 微 鏡濾 光 片 熒 光 顯 微 鏡 的 基 本 結(jié) 構(gòu) 透 射 光 ： 照 明 光 線 從 標(biāo)本 下 經(jīng) 聚 光 器 透 過(guò) 標(biāo) 本進(jìn) 入 物 鏡 。落 射 光 ： 照 明 光 線 從 標(biāo)本 上 經(jīng) 垂 直 照 明 器 落 射到 標(biāo) 本 ， 經(jīng) 標(biāo) 本 反

16、 射 進(jìn)入 物 鏡 。 透 射 熒 光 顯 微 鏡 光 路 (a) 落 射 熒 光 顯 微 鏡 光 路 (b)熒 光 顯 微 鏡光 路 熒 光 顯 微 鏡 的 基 本 結(jié) 構(gòu) 第 三 節(jié) 熒 光 免 疫 分 析 的 類 型 熒 光 免 疫 分 析 的 基 本 原 理 將 抗 原 抗 體 反 應(yīng) 與 熒 光 物 質(zhì) 發(fā) 光 分 析 相 結(jié) 合 ，用 熒 光 檢 測(cè) 儀 檢 測(cè) 抗 原 抗 體 復(fù) 合 物 中 特 異 性 熒光 強(qiáng) 度 ， 對(duì) 液 體 標(biāo) 本 中 微 量 或 超 微 量 物 質(zhì) 進(jìn) 行定 量 測(cè) 定 。 熒 光 抗 體 技 術(shù)熒 光 免 疫 測(cè) 定 均 相 熒 光 免 疫 測(cè) 定（

17、 homogeneous fluorescence immunoassay） 非 均 相 熒 光 免 疫 測(cè) 定（ heterogeneous fluorescence immunoassay）熒 光 免 疫 技 術(shù)熒 光 免 疫 技 術(shù) 是 將 抗 原 抗 體 反 應(yīng) 的 特 異 性 與 熒 光 技 術(shù) 的 敏感 性 相 結(jié) 合 ， 對(duì) 抗 原 或 抗 體 進(jìn) 行 定 性 、 定 位 或 定 量 檢 測(cè) 。熒 光 免 疫 技 術(shù) 的 類 型 熒 光 免 疫 測(cè) 定 的 方 法 類 型 非 均 相 熒 光 免 疫 測(cè) 定 ： 時(shí) 間 分 辨 熒 光 免 疫 測(cè) 定 、 熒 光 酶 免 疫 測(cè)

18、定 均 相 熒 光 免 疫 測(cè) 定 ： 熒 光 偏 振 免 疫 測(cè) 定 自 發(fā) 熒 光 壽 命 短 :1ns 10ns鑭 系 元 素 壽 命 長(zhǎng) :10 s 1000 s短 壽 命 熒 光 完 全 衰 變 后 再 測(cè) 定 鑭 系 元 素 特 異 熒 光 基 本 原 理 時(shí) 間 分 辨 檢 測(cè) 原 理 示 意 圖時(shí) 間 分 辨一 、 時(shí) 間 分 辨 熒 光 免 疫 測(cè) 定 stokes位 移 :激 發(fā) 光 譜 和 發(fā) 射 光 譜 的 波 長(zhǎng) 差鑭 系 元 素 Stokes位 移 大 (273nm)， 激 發(fā) 光 譜 和 發(fā) 射 光 譜 不 重 疊stokes位 移基 本 原理時(shí) 間 分 辨 熒

19、光 免 疫 測(cè) 定 發(fā) 射 光 譜 帶 較 窄 ： 613nm 10nm， 干 擾 少 激 發(fā) 光 譜 帶 較 寬 ： 300nm 350nm， 靈 敏 度 高基 本 原 理發(fā) 射 光 譜 和 激 發(fā) 光 譜時(shí) 間 分 辨 熒 光 免 疫 測(cè) 定 比 活 性 ： 單 位 時(shí) 間 每 個(gè) 標(biāo) 記 分 子 被 探 測(cè) 的 信 號(hào) 量熒 光 激 發(fā) 光 源 1000次 /S激 發(fā) ， 比 活 性 提 高基 本 原理熒 光 標(biāo) 記 物 的 相 對(duì) 比 活 性時(shí) 間 分 辨 熒 光 免 疫 測(cè) 定 結(jié) 合 -二 酮 體Eu3+解 離酸 性 增 強(qiáng) 液 熒 光 增 強(qiáng)Eu3+標(biāo) 記 抗 原抗 體 復(fù) 合

20、物 基 本 原 理信 號(hào) 增 強(qiáng)時(shí) 間 分 辨 熒 光 免 疫 測(cè) 定 鑭 系 元 素銪 (Eu3+)（ 最 常 用 ）釤 (Sm3+)鋱 (Tb3+)釹 (Nd3+)鏑 (Dy3+)標(biāo) 記 物 熒 光 物 質(zhì) 熒 光 壽 命 (ns) 熒 光 物 質(zhì) 熒 光 壽 命 (ns)非 特 異 熒 光 背 景 1 10 Sm3+ - -NTA 65000人 血 清 蛋 白 4.1 Sm3+-PTA 60000球 蛋 白 3.0 Eu3+- -NTA 714000細(xì) 胞 色 素 C 3.5 Eu3+-PTA 925000FITC 4.5 Tb3+-PTA 96000丹 黃 酰 氯 14 Dy3+-PT

21、A 1000羅 丹 明 B 3.0常 見(jiàn) 熒 光 物 質(zhì) 的 熒 光 壽 命時(shí) 間 分 辨 熒 光 免 疫 測(cè) 定 標(biāo) 記 方 法 雙 功 能 螯 合 劑 ：1-（ 對(duì) -苯 偶 氮 ） -EDTA異 硫 氰 酸 苯 基 -EDTA異 硫 氰 酸 苯 甲 基 -DTTA二 乙 烯 三 胺 五 乙 酸 （ DTPA） 標(biāo) 記 方 法 ：一 步 法 ： 先 螯 合 Eu3+， 再 連 接 蛋 白 質(zhì)二 步 法 ： 先 連 接 蛋 白 質(zhì) ， 再 螯 合 Eu3+時(shí) 間 分 辨 熒 光 免 疫 測(cè) 定 方 法 類 型 雙 抗 體 夾 心 法 固 相 抗 體 競(jìng) 爭(zhēng) 法 固 相 抗 原 競(jìng) 爭(zhēng) 法時(shí)

22、間 分 辨 熒 光 免 疫 測(cè) 定 方 法 類 型時(shí) 間 分 辨 熒 光 免 疫 測(cè) 定 （ 雙 抗 體 夾 心 法 ） 示 意 圖雙 抗 體 夾 心 法固 相 抗 體 和 Eu3+標(biāo) 記 抗 體 與 待 檢抗 原 結(jié) 合 ， 形 成 固 相 抗 體 -待 檢抗 原 -Eu3+標(biāo) 記 抗 體 復(fù) 合 物 ， 酸性 增 強(qiáng) 液 下 ， Eu 3+解 離 ， 340nm激 發(fā) 光 下 發(fā) 射 613nm熒 光 。 時(shí) 間 分 辨 熒 光 免 疫 測(cè) 定 方 法 類 型固 相 抗 體 競(jìng) 爭(zhēng) 法 待 檢 抗 原 和 Eu3+標(biāo) 記 抗 原 與 固 相 抗 體 競(jìng) 爭(zhēng) 結(jié) 合 ,溫 育 洗 滌 后 在

23、 固 相 中 加 入 熒 光 增 強(qiáng) 液 ,測(cè) 定 熒光 強(qiáng) 度 ， 熒 光 強(qiáng) 度 與 待 檢 抗 原 含 量 成 反 比 。時(shí) 間 分 辨 熒 光 免 疫 測(cè) 定 方 法 類 型固 相 抗 原 競(jìng) 爭(zhēng) 法 待 檢 抗 原 和 固 相 抗 原 競(jìng) 爭(zhēng) 結(jié) 合 定 量 的 Eu3+標(biāo) 記 抗 體 ，溫 育 洗 滌 后 在 固 相 中 加 入 熒 光 增 強(qiáng) 液 ,測(cè) 定 熒 光 強(qiáng)度 ， 熒 光 強(qiáng) 度 與 待 檢 抗 原 含 量 成 反 比 。時(shí) 間 分 辨 熒 光 免 疫 測(cè) 定 靈 敏 度 高 ： 最 小 檢 出 量 10-18mol/L分 析 范 圍 寬 ： 4 5個(gè) 數(shù) 量 級(jí)標(biāo) 記

24、 物 穩(wěn) 定 ： 有 效 使 用 期 長(zhǎng)測(cè) 量 快 速 ， 易 自 動(dòng) 化易 受 污 染 ， 本 底 增 高方 法 評(píng) 價(jià)時(shí) 間 分 辨 熒 光 免 疫 測(cè) 定 光 線 通 過(guò) 偏 振 濾 光 片 后 ，形 成 一 個(gè) 方 向 的 平 面 光 稱為 偏 振 光 。 偏 振 熒 光 (綠 光 ,525nm 550nm)偏 振 光 (藍(lán) 光 ,485nm)熒 光 物 質(zhì)基 本 原 理二 、 熒 光 偏 振 免 疫 測(cè) 定 抗 原 抗 體 競(jìng) 爭(zhēng) 反 應(yīng)AgF分 子 小 ， 轉(zhuǎn) 動(dòng) 速 度 快 ， 偏 振 熒 光 弱 AgF-Ab分 子 大 ， 轉(zhuǎn) 動(dòng) 速 度 慢 ， 偏 振 熒 光 強(qiáng) 若 待 檢

25、 抗 原 多 ， 則 AgF-Ab少 ， AgF多 ， 偏 振 熒 光 弱待 檢 抗 原 含 量 與 偏 振 熒 光 強(qiáng) 度 成 反 比熒 光 偏 振 免 疫 測(cè) 定 原 理 示 意 圖 基本原理 熒 光 偏 振 免 疫 測(cè) 定 方 法 評(píng) 價(jià) 樣 品 用 量 少 熒 光 素 標(biāo) 記 試 劑 穩(wěn) 定 ， 使 用 壽 命 長(zhǎng) 重 復(fù) 性 好 快 速 ， 易 自 動(dòng) 化 適 于 小 、 中 等 分 子 物 質(zhì) 檢 測(cè) 靈 敏 度 較 非 均 相 熒 光 免 疫 測(cè) 定 法 低熒 光 偏 振 免 疫 測(cè) 定 基 本 原 理熒 光 酶 免 疫 測(cè) 定 熒 光 物 質(zhì) 產(chǎn) 生 示 意 圖 堿 性 磷 酸

26、 酶 標(biāo) 記 抗 體 或 抗原 ， 固 相 載 體 包 被 抗 原 或抗 體 ， 酶 分 解 4-MUP， 脫磷 酸 根 基 團(tuán) 形 成 4-MU，360nm激 發(fā) 光 照 射 ， 發(fā) 出450nm熒 光 。 三 、 熒 光 酶 免 疫 測(cè) 定 酶 和 熒 光 底 物熒 光 酶 免 疫 測(cè) 定 標(biāo) 記 用 酶 及 熒 光 底 物 標(biāo) 記 酶 底 物 熒 光 產(chǎn) 物 激 發(fā) 光 (nm) 熒 光 (nm) 相 應(yīng) 信 號(hào)堿 性 磷 酸 酶 4-MUP 4-MU 360 450 10 -半 乳 糖 苷 酶 4-MUG 4-MU 360 450 10辣 根 過(guò) 氧 化 物 酶 HPA 二 聚 體 3

27、17 414 0.03熒 光 酶 免 疫 測(cè) 定 方 法 類 型 雙 抗 體 夾 心 法 雙 抗 原 夾 心 法 固 相 抗 原 競(jìng) 爭(zhēng) 法熒 光 酶 免 疫 測(cè) 定 方 法 類 型雙 抗 體 夾 心 法固 相 抗 體 和 酶 標(biāo) 記 抗 體 與待 檢 原 反 應(yīng) ， 形 成 固 相 抗體 -抗 原 -酶 標(biāo) 抗 體 復(fù) 合物 ， 加 入 底 物 進(jìn) 行 酶 促 發(fā)光 反 應(yīng) ， 發(fā) 光 量 與 待 檢 抗原 含 量 成 正 比 。 熒 光 酶 免 疫 測(cè) 定 （ 雙 抗 體 夾 心 法 ） 示 意 圖 熒 光 酶 免 疫 測(cè) 定 方 法 類 型雙 抗 原 夾 心 法 固 相 抗 原 和 酶

28、標(biāo) 抗 原 與 待 檢 抗 體 反 應(yīng) ， 形 成 固 相抗 原 -待 檢 抗 體 -酶 標(biāo) 抗 原 復(fù) 合 物 ， 加 入 底 物 進(jìn) 行酶 促 發(fā) 光 ， 發(fā) 光 量 與 待 檢 抗 體 含 量 成 正 比 。 熒 光 酶 免 疫 測(cè) 定 方 法 類 型固 相 抗 原 競(jìng) 爭(zhēng) 法 待 檢 抗 原 和 固 相 抗 原 競(jìng) 爭(zhēng) 結(jié) 合 定 量 的 酶 標(biāo) 抗 體 ， 洗 滌除 去 未 結(jié) 合 部 分 ， 固 相 抗 原 與 酶 標(biāo) 抗 體 形 成 的 復(fù) 合 物 被 留下 來(lái) ， 加 入 底 物 進(jìn) 行 酶 促 發(fā) 光 反 應(yīng) ， 熒 光 強(qiáng) 度 與 待 檢 抗 原含 量 成 反 比 。 熒

29、光 酶 免 疫 測(cè) 定 方 法 評(píng) 價(jià) 用 酶 和 熒 光 底 物 的 化 學(xué) 反 應(yīng) 作 為 放 大 系 統(tǒng) ， 提 高 靈 敏 度背 景 熒 光 干 擾 測(cè) 定 ， 用 固 相 熒 光 酶 免 疫 測(cè) 定 效 果 好熒 光 酶 免 疫 測(cè) 定 第 四 節(jié) 熒 光 免 疫 技 術(shù) 在 醫(yī) 學(xué) 檢 驗(yàn) 中 的 應(yīng) 用 自 身 抗 體 檢 測(cè) 抗 核 抗 體 (均 質(zhì) 型 ) 抗 核 抗 體 (核 膜 型 )抗 核 抗 體 (斑 點(diǎn) 型 ) 一 、 熒 光 抗 體 技 術(shù) 的 應(yīng) 用 病 原 體 檢 測(cè)寄 生 蟲 （ 猴 胚 腎 細(xì) 胞 內(nèi) 弓 形 蟲 ）細(xì) 菌 （ 藤 黃 微 球 菌 )熒 光

30、 抗 體 技 術(shù) 的 應(yīng) 用 免 疫 病 理 檢 測(cè)腫 瘤 （ 人 肝 癌 細(xì) 胞 ）熒 光 抗 體 技 術(shù) 的 應(yīng) 用 細(xì) 胞 表 面 抗 原 和 受 體 檢 測(cè)將 游 離 細(xì) 胞 作 熒 光 抗 體 特 異 染 色 后 ， 在 特 殊設(shè) 計(jì) 的 儀 器 中 通 過(guò) 噴 嘴 逐 個(gè) 流 出 ， 經(jīng) 單 色 激光 照 射 發(fā) 出 的 熒 光 信 號(hào) 由 熒 光 檢 測(cè) 計(jì) 檢 測(cè) ，并 自 動(dòng) 處 理 各 種 數(shù) 據(jù) 。 特 殊 應(yīng) 用 ： 流 式 細(xì) 胞 分 析熒 光 免 疫 技 術(shù) 可 用 于 淋 巴 細(xì) 胞 表 面 CD抗 原 、抗 原 受 體 、 補(bǔ) 體 受 體 、 Fc受 體 等 的

31、 檢 測(cè) 以 及淋 巴 細(xì) 胞 及 其 亞 群 的 鑒 定 和 計(jì) 數(shù) 。 熒 光 抗 體 技 術(shù) 的 應(yīng) 用 |時(shí) 間 分 辨 熒 光 免 疫 測(cè) 定 ： 蛋 白 質(zhì) 、 激 素 、 藥 物 、 腫 瘤 標(biāo) 記 物 、 病 原 體 抗 原 /抗 體 等|熒 光 偏 振 免 疫 測(cè) 定 ： 藥 物 、 維 生 素 、 激 素 、 常 規(guī) 生 化 項(xiàng) 目 等|熒 光 酶 免 疫 測(cè) 定 ： 病 毒 抗 體 、 細(xì) 菌 和 毒 素 抗 原 、 激 素 、 腫 瘤 標(biāo) 志 物 等二 、 熒 光 免 疫 測(cè) 定 的 應(yīng) 用 1 熒 光 、 熒 光 效 率 、 熒 光 壽 命 和 熒 光 淬 滅 的 概

32、 念 是 什 么 ？2 常 用 的 熒 光 物 質(zhì) 有 哪 些 ？3 熒 光 免 疫 技 術(shù) 有 哪 些 類 型 ？4 熒 光 抗 體 技 術(shù) 的 基 本 原 理 是 什 么 ？3 什 么 是 熒 光 抗 體 ？ 如 何 制 備 、 純 化 和 鑒 定 熒 光 抗 體 ？4 熒 光 抗 體 染 色 有 哪 些 方 法 ？ 各 自 的 反 應(yīng) 原 理 是 什 么 ？ 5 熒 光 免 疫 測(cè) 定 的 基 本 原 理 是 什 么 ？ 有 哪 些 方 法 類 型 ?思 考 題 6 時(shí) 間 分 辨 熒 光 免 疫 測(cè) 定 的 原 理 是 什 么 ？ 有 哪 些 方 法 類型 ?7 熒 光 偏 振 免 疫

33、 測(cè) 定 的 原 理 是 什 么 ？8 熒 光 酶 免 疫 測(cè) 定 的 原 理 是 什 么 ？ 有 哪 些 方 法 類 型 ?9 如 何 評(píng) 價(jià) 各 種 類 型 的 熒 光 免 疫 測(cè) 定 ？10 熒 光 免 疫 測(cè) 定 有 何 應(yīng) 用 ？思 考 題 熒 光 免 疫 技 術(shù) 是 將 抗 原 抗 體 反 應(yīng) 的 特 異 性 與 熒 光 技 術(shù) 的敏 感 性 相 結(jié) 合 ， 對(duì) 抗 原 或 抗 體 進(jìn) 行 定 性 、 定 位 或 定 量 檢測(cè) ， 包 括 熒 光 抗 體 技 術(shù) 和 熒 光 免 疫 測(cè) 定 。 熒 光 抗 體 技 術(shù) 是 以 熒 光 素 標(biāo) 記 抗 體 ,與 抗 原 反 應(yīng) , 在 熒 光顯 微 鏡 下 觀 察 呈 現(xiàn) 特 異 熒 光 的 抗 原 抗 體 復(fù) 合 物 ， 進(jìn) 行 定性 和 定 位 檢 測(cè) , 分 為 直 接 法 、 間 接 法 和 雙 標(biāo) 記 法 等 。 熒 光 免 疫 測(cè) 定 是 將 抗 原 抗 體 反 應(yīng) 與 熒 光 物 質(zhì) 發(fā) 光 分 析 相結(jié) 合 ， 檢 測(cè) 抗 原 抗 體 復(fù) 合 物 中 特 異 性 熒 光 強(qiáng) 度 ， 進(jìn) 行 定量 測(cè) 定 ， 分 為 均 相 和 非 均 相 。小 結(jié)