RNA指導(dǎo)的DNA復(fù)制(逆轉(zhuǎn)錄)及病毒的復(fù)制

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1、RNA replicationReverse transcription=replication 逆轉(zhuǎn)錄酶 （reverse transcription) 1964年 ， Temin發(fā) 現(xiàn) Rous肉 瘤 病 毒 等 RNA病 毒所 造 成 的 感 染 可 被 DNA合 成 抑 制 劑 遏 制 。 表 明 ： RNA腫 瘤 病 毒 的 RNA復(fù) 制 過 程 中 要 合 成DNA。 Temin又 發(fā) 現(xiàn) 放 線 菌 素 D能 抑 制 致 癌 RNA病 毒的 復(fù) 制 ， 但 不 能 抑 制 一 般 RNA病 毒 的 復(fù) 制 。 表 明 ： 轉(zhuǎn) 錄 對 于 RNA病 毒 增 殖 是 必 需 的 。

2、Temin提 出 前 病 毒 假 說 ： 原 病 毒 DNA是RNA腫 瘤 病 毒 在 復(fù) 制 和 致 癌 中 的 中 間 物 。 1970年 ， Temin 在 Rouse肉 瘤 病 毒 、Baltimore在 白 血 病 病 毒 中 發(fā) 現(xiàn) 逆 轉(zhuǎn) 錄 酶 。 多功能酶：1、 RNA指 導(dǎo) 的 DNA聚 合 酶 活 性2、 RNA酶 H（ RNaseH） 活 性 ： 水 解RNA-DNA雜 交 體 上 的 RNA3、 DNA指 導(dǎo) 的 DNA聚 合 酶 活 性 ： 合 成 互補 DNA。4、 沒 有 35外 切 酶 活 性 。 特點：1. 含 有 Zn2+（ 是 否 有 鋅 指 結(jié) 構(gòu) 、

3、 DNA結(jié) 合功 能 ？ ）2. DNA合 成 反 應(yīng) 要 求 有 模 板 和 引 物 。3. 需 適 當(dāng) 濃 度 的 二 價 陽 離 子 （ Mg2+、 Mn2+）4. 5 3合 成 方 向 逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組復(fù)制過程 第 一 階 段 ： 合 成 負(fù) 股 cDNA的 大 部 分 第 二 階 段 ： 以 負(fù) 股 DNA為 模 板 合 成 一 小部 分 正 股 DNA鏈 。 第 三 階 段 ： 完 成 cDNA的 全 部 復(fù) 制 。 乙肝病毒基因組的復(fù)制 其 復(fù) 制 需 通 過 逆 轉(zhuǎn) 錄 過 程 經(jīng) RNA中 間 體實 現(xiàn) ， 其 DNA聚 合 酶 也 是 一 種 逆 轉(zhuǎn) 錄 酶 。 逆 轉(zhuǎn)

4、錄 病 毒 ： RNA DNA RNA 乙 肝 病 毒 ： DNARNA DNA 試管內(nèi)cDNA的合成 常 用 于 獲 得 或 研 究 真 核 生 物 基 因 的 方 法 。提 取 某 一 種 特 定 的 mRNA， 經(jīng) 逆 轉(zhuǎn) 錄 生成 的 cDNA可 代 表 某 一 特 定 基 因 。 常 用 的 逆 轉(zhuǎn) 錄 酶 有 兩 種 ：* 來 自 鳥 類 成 髓 細 胞 瘤 逆 轉(zhuǎn) 錄 病 毒 稱 為 AMV-RT；* 來 自 鼠 白 血 病 毒 稱 為 MMLV-RT。 病毒RNA復(fù)制的主要方式 1、 病 毒 含 有 正 鏈 RNA， 如 灰 質(zhì) 炎 病 毒 。 RNA（ +） 蛋 白 質(zhì) （

5、酶 ） RNA復(fù) 制 2、 病 毒 含 有 負(fù) 鏈 RNA和 復(fù) 制 酶 如 狂 犬 病 毒 。RNA（ -） RNA（ +） 蛋 白 質(zhì) 、 復(fù) 制 病 毒RNA（ -） 。 3、 病 毒 含 有 雙 鏈 RNA和 復(fù) 制 酶 。 如 呼 腸 孤 病毒 。 雙 鏈 RNA RNA（ +） 蛋 白 質(zhì) RNA（ -） 雙 鏈 RNA 4、 逆 轉(zhuǎn) 錄 病 毒 。 討論題 如 何 知 道 DNA復(fù) 制 中 先 要 有 RNA引 物 的合 成 ？ (原 料 /新 合 成 DNA序 列 分 析 /專 一 核 酸 酶水 解 ) 病毒的復(fù)制 病 毒 在 活 細 胞 內(nèi) ， 以 其 基 因 為 模 板 ，

6、 在 酶 的 作 用 下 ，分 別 合 成 病 毒 基 因 及 蛋 白 質(zhì) ， 再 組 裝 成 完 整 的 病 毒 顆粒 ， 這 種 方 式 稱 為 復(fù) 制 （ replication)。 從 病 毒 進 入 宿 主 細 胞 開 始 ， 經(jīng) 過 基 因 組 復(fù) 制 和 病 毒 蛋白 合 成 ， 至 釋 放 出 子 代 病 毒 的 全 過 程 ， 稱 為 一 個 復(fù) 制周 期 。 病 毒 的 復(fù) 制 周 期 主 要 包 括 吸 附 和 穿 入 、 脫 殼 、 生 物 合成 、 組 裝 和 釋 放 四 個 連 續(xù) 步 驟 。 復(fù) 制 周 期 病 毒 的 一 步 生 長 曲 線病 毒 的 一 步 生

7、 長 曲 線 ： 以 感 染 時 間 為 橫 坐 標(biāo) ， 病 毒 效 價 為 縱 坐 標(biāo) ， 繪 制 出 的 病 毒 特 征 曲 線 。 一 、 吸 附 和 穿 入（ 一 ） 吸 附 (adsorption)分 兩 個 階 段 ：1. 靜 電 吸 附 ： 病 毒 體 與 細 胞 接 觸 ， 進 行 靜 電 結(jié) 合 。非 特 異 性 、 可 逆 。2. 真 正 的 吸 附 ： 病 毒 體 表 面 位 點 （ 蛋 白 質(zhì) 結(jié) 構(gòu) ） 與宿 主 細 胞 膜 上 相 應(yīng) 的 受 體 結(jié) 合 。 是 決 定 病 毒 感 染 的真 正 開 始 。 裸露病毒的吸附 囊 膜 病 毒 的 吸 附 （ 二 ） 穿

8、 入 (penetration) 病 毒 體 吸 附 在 宿 主 細 胞 膜 上 后 ， 可 通 過 數(shù) 種 穿入 方 式 進 入 細 胞 ：1.無 囊 膜 的 病 毒 一 般 經(jīng) 過 細 胞 膜 吞 入 ， 稱 為 病 毒 胞 飲 ,如 腺病 毒 、 小 RNA病 毒 等 病毒胞飲 2. 有 囊 膜 的 病 毒 囊 膜 與 宿 主 細 胞 膜 融 合 ， 病 毒 的 核 衣 殼 直 接 進 入 細 胞 漿 內(nèi) 病 毒 胞 飲 : 細 胞 膜 吞 入 (1) 膜融合后進入 (2) 病毒胞飲 二 、 脫 殼 (uncoating) 不 同 病 毒 脫 殼 方 式 不 一 ， 多 數(shù) 在 宿 主

9、細 胞 溶 酶 體 酶作 用 下 脫 殼 ， 釋 放 出 基 因 組 核 酸 。 三 、 生 物 合 成 (biosynthesis) 病 毒 基 因 組 一 旦 從 衣 殼 中 釋 放 后 ， 就 利 用 宿 主 細 胞 提供 的 低 分 子 物 質(zhì) 合 成 大 量 的 病 毒 核 酸 和 結(jié) 構(gòu) 蛋 白 。 早 期 ， 根 據(jù) 病 毒 基 因 組 轉(zhuǎn) 錄 成 mRNA、 指 令 合 成 轉(zhuǎn) 錄合 成 所 必 需 的 復(fù) 制 酶 和 一 些 抑 制 蛋 白 ； 生 物 合 成 階 段 ， 病 毒 處 于 隱 蔽 期 病 毒 的 生 物 合 成 過 程 可 基 本 歸 為 6大 類 ： 雙 股

10、 DNA病毒 、 單 股 DNA病 毒 、 單 正 股 RNA病 毒 、 單 負(fù) 股 RNA病 毒 、 逆 轉(zhuǎn) 錄 病 毒 和 雙 股 RNA病 毒 。 病 毒 DNA早 期 mRNA早 期 蛋 白 （ 酶 等 ） 子 代 病 毒 DNA 晚 期 mRNA病 毒 結(jié) 構(gòu) 蛋 白子 代 病 毒 子雙 股 DNA病 毒 復(fù) 制宿 主 細 胞轉(zhuǎn) 錄 酶 單 鏈 正 股 RNA病 毒（ -）ssRNA親 代 病 毒 （ +） ssRNA 早 期 蛋 白（ +） ssRNAdsRNA復(fù) 制 中 間 型（ -）ssRNA （ +） ssRNA大 量 子 代 （ +） ssRNA 晚 期 蛋 白 裝 配 子

11、 代 病 毒 單 股 負(fù) 股 RNA病 毒病 毒 自 身 攜 帶 依 賴 RNA的 RNA多 聚 酶 。親 代 （ -ssRNA） （ +） mRNA 蛋 白 質(zhì)（ +） ssRNA子 代 （ -） sRNA子 代 病 毒 多 聚 酶 逆 轉(zhuǎn) 錄 病 毒病 毒 RNA 逆 轉(zhuǎn) 錄 酶 雙 股 DNA整 合 至 宿 主 細 胞 （ 前 病 毒 ）mRNA 病 毒 RNA結(jié) 構(gòu) 蛋 白 裝 配 子 代 病 毒RNA:DNA轉(zhuǎn) 錄 酶 聚 合 酶 四 、 組 裝病 毒 核 酸 與 衣 殼 裝 配 在 一 起 ， 形 成 病 毒 子 。絕 大 多 數(shù) DNA病 毒 均 在 細 胞 核 內(nèi) 組 裝 ;R

12、NA病 毒 和 痘 病 毒 在 細 胞 漿 內(nèi) 組 裝 。 絕 大 多 數(shù) 無 囊 膜 病 毒 釋 放 ， 一 次 同 步 ， 破 壞 宿 主 細胞 膜 ， 細 胞 裂 解 釋 放 病 毒 顆 粒 ， 細 胞 迅 速 死 亡 。絕 大 多 數(shù) 有 囊 膜 病 毒 以 出 芽 方 式 釋 出 時 包 上 細 胞 核膜 或 細 胞 膜 而 成 為 成 熟 病 毒 。 逐 個 釋 出 ， 非 一 次 同步 ， 細 胞 死 亡 緩 慢 。五 、 釋 放 Virus Obtaining Its Envelope from Host Cell Membrane by Budding 復(fù) 制 周 期 思考題

13、1 某 種 病 毒 DNA的 堿 基 組 成 （ 摩 爾 百 分 比 ）如 下 ： A=32； G=16； T=40； C=12 該 病 毒 DNA的 特 點 如 何 ？ 思考題2 簡 要 說 明 怎 樣 進 行 構(gòu) 建 cDNA文 庫 ？ 思考題3 組 織 培 養(yǎng) 的 哺 乳 動 物 細 胞 S期 長 達 5 小 時 ，經(jīng) 放 射 自 顯 影 測 定 DNA復(fù) 制 的 速 度 是 0.5微 米 /分 ， 已 知 哺 乳 動 物 細 胞 DNA全 長 1.2米 ， 計 算 染 色 體 復(fù) 制 時 共 有 多 少 復(fù) 制 叉在 復(fù) 制 ？ 8 103（ 如 何 分 析 ？ ） 思考題4 已 知 抹 香 鯨 和 豬 的 胰 島 素 具 有 相 同 的 氨基 酸 序 列 ， 然 而 某 些 抗 血 清 卻 能 將 它 們區(qū) 別 開 來 ， 這 豈 不 與 “ 蛋 白 質(zhì) 的 一 級 結(jié)構(gòu) 決 定 其 高 級 結(jié) 構(gòu) ” 的 理 論 相 矛 盾 嗎 ？你 如 何 解 釋 ？ 思考題5 將 某 種 純 蛋 白 1mg進 行 氨 基 酸 分 析 ， 得19.5ug的 異 亮 氨 酸 （ 分 子 量 =131.2） ，那 么 該 蛋 白 質(zhì) 的 最 小 分 子 量 是 多 少 ？