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1、蛋白質(zhì)折疊與折疊病,您知道蛋白質(zhì)折疊嗎？ 您知道“蛋白質(zhì)折疊病”嗎？ 您知道蛋白質(zhì)折疊有多復雜嗎？,蛋白質(zhì)折疊的定義,蛋白質(zhì)憑借相互作用在細胞環(huán)境(特定的酸堿度、溫度等)下自己組裝自己，這種自我組裝的過程被稱為蛋白質(zhì)折疊,蛋白質(zhì)折疊問題是生命科學領域的前沿課題之一，并且被列為“21世紀的生物物理學”的重要課題，它是分子生物學中心法則尚未解決的一個重大生物學問題。從一級序列預測蛋白質(zhì)分子的三級結(jié)構(gòu)并進一步預測其功能，是極富挑戰(zhàn)性的工作。研究蛋白質(zhì)折疊 ，尤其是折疊早期過程，即新生肽段的折疊過程是全面的最終闡明中心法則的一個根本問題。,蛋白質(zhì)折疊問題為什么會稱為當今生物學領域中的研究熱點之一？,破
2、譯生命的另一半遺傳密碼，完善中心法則 蛋白質(zhì)分子設計及蛋白質(zhì)工程的需要 越來越多的基因工程產(chǎn)物需要復性復活，要求蛋白質(zhì)折疊的理論及技術作為指導,研究的源動力,disease,,免 疫,,病毒,,庫魯病 (Kuru),瘋牛病,研究背景,卡里頓加德賽克,美國國立衛(wèi)生研究院病毒和神經(jīng)研究室主任，因發(fā)現(xiàn)神經(jīng)性傳染性疾病的新病因和傳播新機制而獲得1976年諾貝爾醫(yī)學/生理學獎。,加德賽克在新幾內(nèi)亞島發(fā)現(xiàn)了一種奇怪的疾病 ，當?shù)氐耐林朔Q之為“kuru”。由于找不到病因，被當?shù)厝朔Q為“終極巫術”。 Kuru在當?shù)氐暮x是顫抖，因某種未知的寒冷或恐懼而顫抖。一旦Kuru的顫抖開始，就不可逆轉(zhuǎn)，詛咒會越
3、來越烈，直至死亡為止。Kuru的詛咒非常殘酷：先是不可抑制的顫抖，然后喪失行走能力及無法言語，接著癱瘓。但中了巫術的人至死心智都很清醒，不會陷入昏睡狀態(tài)，因此格外痛苦。,蛋白質(zhì)折疊研究的背景,遺傳信息的傳遞,,DNA,,RNA,,Proteins,肽鏈,,有活性的蛋白質(zhì)天然構(gòu)象,實質(zhì)上是多肽鏈,遺傳信息的傳遞應該是從核苷酸序列到有完整結(jié)構(gòu)的功能蛋白質(zhì)的全過程。,蛋白質(zhì)折疊研究的概況,20世紀60年代，安芬森（Anfinsen）基于還原變性的牛胰RNase的研究提出“自組裝學說” Ellis 于1987年提出了蛋白質(zhì)折疊的“輔助性組裝學說”。 mRNA的二級結(jié)構(gòu)可能作為一種遺傳密碼從而影響蛋白質(zhì)
4、結(jié)構(gòu)的假說 那么，蛋白質(zhì)的氨基酸序列究竟是如何確定其空間構(gòu)象的呢？,牛胰核糖核酸酶的一級結(jié)構(gòu),牛胰核糖核酸酶的變性和復性,蛋白質(zhì)折疊的研究內(nèi)容,蛋白質(zhì)折疊的研究，狹義的定義就是研究蛋白質(zhì)特定三維空間結(jié)構(gòu)形成的規(guī)律、穩(wěn)定性及與其生物活性的關系。 在概念上有熱力學的問題和動力學的問題； 蛋白質(zhì)在體外折疊和在細胞內(nèi)折疊的問題； 有理論研究和實驗研究的問題。,蛋白質(zhì)折疊的研究內(nèi)容,最根本的科學問題就是多肽鏈的一級結(jié)構(gòu)到底如何決定它的空間結(jié)構(gòu)？ 既然前者決定后者，一級結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)之間肯定存在某種確定的關系，這是否也像核苷酸通過“三聯(lián)密碼”決定氨基酸順序那樣有一套密碼呢？ 后來，有人把這設想的一級結(jié)構(gòu)決
5、定空間結(jié)構(gòu)的密碼叫作“第二遺傳密碼”。,第二遺傳密碼,完整的提法應該是遺傳密碼的第二部分，即蛋白質(zhì)中氨基酸序列與其空間結(jié)構(gòu)的對應關系，國際上稱之為第二遺傳密碼或折疊密碼 Anfinsen原理： 自發(fā)折疊概念的轉(zhuǎn)變(有幫助的肽鏈的自發(fā)折疊和組裝) 三聯(lián)密碼的解決 國外對蛋白質(zhì)折疊的研究,第二遺傳密碼的特點,簡并性 在第一遺傳密碼中有所謂“簡并性”，即同一AA可以由不同密碼子所編碼，如CGA 和AGC 都編碼為Arg，UCC 和AGU都編碼為Ser等。 第二密碼也同樣有簡并性。現(xiàn)在已經(jīng)知道有很多氨基酸序列不同的肽鏈可以有極為相似甚至相同的空間結(jié)構(gòu)，這就是第二密碼的簡并性。,簡并性的證據(jù),1、不同生
6、物體中執(zhí)行相同功能的蛋白質(zhì)有AA序列上的差異, 但卻有相同的整體空間結(jié)構(gòu)。 例如：線粒體Cytc的AA序列已經(jīng)測定，AA殘基數(shù)均在104 左右, 但僅在21個位置上的AA在不同生物體的Cytc 是完全相同的，但是所有Cytc 的整體空間結(jié)構(gòu)卻是非常相似的。 另外，兩個在功能上完全無關的蛋白質(zhì)，卵類黏蛋白的第三結(jié)構(gòu)域和核糖體結(jié)構(gòu)蛋白L7/L12 的C-末端部分在AA序列上僅有3%相同, 卻具有幾乎完全相同的空間結(jié)構(gòu)。,2、化學修飾,改變側(cè)鏈性質(zhì)，包括大小、極性、電荷、氫鍵形成能力等的影響。 晶體衍射結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果表明：在分子內(nèi)部引入大小不同的疏水基團的結(jié)果，只不過是使某些側(cè)鏈基團在位置上有所重排
7、，但并不影響分子的總體結(jié)構(gòu)。,3、定點突變研究,定點突變技術的建立為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能關系研究提供了極大的方便。例如：金黃色葡萄球菌核酸酶是研究得最多的蛋白之一 結(jié)果表明：某些個別鍵的破壞并不能對結(jié)構(gòu)起到?jīng)Q定性的作用，所以個別殘基的單獨替換不會對分子的總體構(gòu)象產(chǎn)生明顯的影響。甚至把整段序列用相同殘基構(gòu)成的序列所取代，生物活性都沒有明顯影響。,多意性,某些相同的氨基酸序列還可以在不同條件下決定不同的空間結(jié)構(gòu)，這種情況可以稱之為第二遺傳密碼的多意性。 例如，Prusiner對天然型和感染型朊病毒(prion)的研究。天然型朊病毒(PrPc)在正常動物體內(nèi)存在, 不導致疾病, 而感染型的朊病毒(PrPS
8、C)則導致某些神經(jīng)性疾病, 并導致天然型朊病毒轉(zhuǎn)變?yōu)楦腥拘偷碾貌《?。初步研究表明天然型朊病毒主要?螺旋結(jié)構(gòu), 而感染型的朊病毒卻主要為-折疊結(jié)構(gòu).,全局性,第二密碼必須把蛋白分子作為一個全局來考慮，這就從根本上決定了第二密碼的復雜性，它不可能像第一密碼那樣有簡單的一對一的關系。某些蛋白C-末端少數(shù)氨基酸的去除, 或側(cè)鏈基團的翻譯后修飾，有時都可以對整體構(gòu)象和功能產(chǎn)生重大影響。,在新生肽鏈合成過程中，后形成的肽段可以影響已經(jīng)形成的肽段的構(gòu)象從而造成對分子整體的影響。以上這些情況可以稱之為第二密碼的全局性，全局性決定了第二密碼的復雜性。 第二密碼的全局性還體現(xiàn)在環(huán)境對分子結(jié)構(gòu)的影響上，水分子對于
9、維系蛋白質(zhì)一定的空間結(jié)構(gòu)有重要作用。,蛋白質(zhì)折疊的研究內(nèi)容,破譯“第二遺傳密碼”正是“蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預測”從理論上最直接地去解決蛋白質(zhì)的折疊問題，這是蛋白質(zhì)研究最后幾個尚未揭示的奧秘之一 “蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預測”屬于理論方面的熱力學問題。,蛋白質(zhì)折疊第二個根本的科學問題是具有完整一級結(jié)構(gòu)的多肽鏈又是如何折疊成為它特定的高級結(jié)構(gòu)？ 這是一個折疊的動力學的問題，長期以來，主要用體外的實驗方法研究，雖然已有四五十年，但至今尚未解決。 絕大多數(shù)蛋白質(zhì)從一條伸展的肽鏈，折疊成有其特定結(jié)構(gòu)的、有活性的蛋白質(zhì)，并不是一步完成的，而要經(jīng)過許多折疊的中間狀態(tài)。,細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)折疊,1988年，鄒承魯明確指出，新合成出來的
10、多肽鏈（稱為新生肽）在合成過程中長度不斷增加，并在延伸的同時進行著折疊，而不是在合成完成脫離核糖體后再自發(fā)折疊成為蛋白質(zhì)。 在新生肽成熟為功能蛋白的全過程中，每一步都涉及新生肽鏈的構(gòu)象變化、折疊和調(diào)整。,蛋白質(zhì)折疊機制的理論模型,框架模型（Framework Model） 疏水塌縮模型（Hydrophobic Collapse Model） 擴散-碰撞-粘合機制 （Diffusion-Collision-Adhesion Model） 成核-凝聚-生長模型（Nuclear-Condensation-Growth Model） 拼版模型（Jig-Saw Puzzle Model）,框架模型（Fr
11、amework Model）,P. S. Kim 和R. L. Baldwin 于1982 年提出，假設蛋白質(zhì)的局部構(gòu)象依賴于局部的氨基酸序列。在多肽鏈折疊過程的起始階段, 先迅速形成不穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)單元； 隨后這些二級結(jié)構(gòu)靠近接觸, 從而形成穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)框架；最后，二級結(jié)構(gòu)框架相互拼接，肽鏈逐漸緊縮，形成了蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)。這個模型認為即使是一個小分子的蛋白也可以一部分一部分的進行折疊, 其間形成的亞結(jié)構(gòu)域是折疊中間體的重要結(jié)構(gòu)。,疏水塌縮模型（Hydrophobic Collapse Model）,該模型中，疏水作用力在蛋白質(zhì)折疊過程中起決定性作用。疏水片段首先聚集在一起，然后進一步聚集
12、長大，形成蛋白中間體 ，進而形成高級結(jié)構(gòu),擴散-碰撞-粘合機制 （Diffusion-Collision-Adhesion Model）,該模型認為蛋白質(zhì)的折疊起始于伸展肽鏈上的幾個位點，在這些位點上生成不穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)單元或者疏水簇，主要依靠局部序列的3-4個殘基間的相互作用來維系。它們以非特異性布朗運動的方式擴散、碰撞、相互黏附，導致大的結(jié)構(gòu)生成并因此而增加了穩(wěn)定性。進一步的碰撞形成具有疏水核心和二級結(jié)構(gòu)的類熔球態(tài)中間體的球狀結(jié)構(gòu)。球形中間體調(diào)整為致密的、無活性的類似天然結(jié)構(gòu)的高度有序熔球態(tài)結(jié)構(gòu)。最后無活性的高度有序熔球態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橥暾挠谢盍Φ奶烊粦B(tài)。,成核-凝聚-生長模型（Nuclear-
13、Condensation-Growth Model）,肽鏈中的某一區(qū)域可以形成“折疊晶核”，以它們?yōu)楹诵?，整個肽鏈繼續(xù)折疊進而獲得天然構(gòu)象。所謂“晶核”實際上是由一些特殊的氨基酸殘基形成的類似于天然態(tài)相互作用的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，這些殘基間不是以非特異的疏水作用維系的，而是由特異的相互作用使這些殘基形成了緊密堆積。晶核的形成是折疊起始階段限速步驟。,拼版模型（Jig-Saw Puzzle Model）,此模型的中心思想就是多肽鏈可以沿多條不同的途徑進行折疊，在沿每條途徑折疊的過程中都是天然結(jié)構(gòu)越來越多，最終都能形成天然構(gòu)象。 折疊速度快 影響小,幫助新生肽折疊的蛋白（輔助蛋白）,分子伴侶 折疊酶 分子內(nèi)
14、伴侶,分子伴侶-蛋白質(zhì)的保姆,分子伴侶：(Chaperone或molecular chaperone,也可譯為侶伴蛋白)，是細胞內(nèi)的一類保守蛋白質(zhì)，可識別肽鏈的非天然構(gòu)象，促進各功能域和整體蛋白質(zhì)的正確折疊。,主要類型,1.熱休克蛋白(heat shock protein, HSP) HSP70、HSP40和GreE族 等 2.伴侶素(chaperonins) GroEL和GroES家族,熱休克蛋白促進蛋白質(zhì)折疊的基本作用結(jié)合保護待折疊多肽片段，再釋放該片段進行折疊。形成HSP70和多肽片段依次結(jié)合、解離的循環(huán)。,伴侶素GroEL/GroES系統(tǒng)促進蛋白質(zhì)折疊過程,伴侶素的主要作用 為非自
15、發(fā)性折疊蛋白質(zhì)提供能折疊形成天然空間構(gòu)象的微環(huán)境。,折 疊 酶,蛋白質(zhì)多膚鏈的折疊過程中，還需要酶的催化，稱之為折疊酶。它們催化與蛋白質(zhì)折疊直接有關的、對形成功能構(gòu)象所必需的共價鍵變化，幫助蛋白質(zhì)正確折疊。,折疊酶類型,(1) 蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶 PDI (Protein disulfide isomerase) (2) 肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶PPI (Peptidyl prolyl cis/trans isomerase),蛋白二硫鍵異構(gòu)酶 (PDI),真核生物的PDI在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔活性很高，細菌中的類似物是Dsb家族，位于細菌外周質(zhì)(periplasm)，在肽鏈中催化錯配二硫鍵斷裂并形成正確二硫
16、鍵連接，最終使蛋白質(zhì)形成熱力學最穩(wěn)定的天然構(gòu)象。通過催化巰基與二硫鍵的交換反應，從而催化蛋白質(zhì)二硫鍵的形成、還原（斷裂）或重排（異構(gòu)化）。在蛋白質(zhì)折疊過程中，主要催化含有二硫鍵的膜蛋白或分泌蛋白的正確折疊。,肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶 (PPI),PPI廣泛分布于各種生物體及各種組織中，多數(shù)定位于胞漿，但也存在于大腸桿菌的外周質(zhì)、紅色面包霉的線粒體基質(zhì)、酵母、果蠅和哺乳動物的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。 肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶是蛋白質(zhì)三維構(gòu)象形成的限速酶，在細胞中通過非共價鍵方式，穩(wěn)定扭曲的酰胺過度態(tài)，而催化肽基脯氨酰順反式的相互轉(zhuǎn)變。在肽鏈合成后需形成順式構(gòu)型時，可使多肽在各脯氨酸彎折處形成準確折疊。,PDI和PPI不
17、僅可以起到折疊酶的催化作用，而且具有防止折疊中間體聚集的類似分子伴侶的功能。 王志珍等最早提出PDI是分子伴侶的假說并驗證了PDI的這一功能,分子內(nèi)伴侶(intramolecular chaperones),1987年，Ikemura發(fā)現(xiàn)枯草桿菌素(subtilisin)的折疊需要前肽(propeptide)的幫助。這類前肽常位于信號肽與成熟多肽之間，在蛋白質(zhì)合成過程中與其介導的蛋白質(zhì)多肽鏈是一前一后合成的，并以共價鍵相連接，是成熟多肽正確折疊所必需的，成熟多肽完成折疊后即通過水解作用與前肽脫離。Shinde和Inouye將這類前肽稱為分子內(nèi)伴侶。,蛋白質(zhì)折疊病（fold disease),蛋
18、白質(zhì)分子的氨基酸序列沒有改變，即一級結(jié)構(gòu)正常，只是其二級結(jié)構(gòu)、乃至立體結(jié)構(gòu)（構(gòu)象）異常也可導致疾病，這類疾病稱為“構(gòu)象病”，或稱“折疊病”,從本質(zhì)上講,分子伴侶突變引起的疾病 蛋白折疊、轉(zhuǎn)運異常引起的疾病,從機制上講,質(zhì)量控制系統(tǒng)滯留（retaining） 折疊異常,質(zhì)量控制系統(tǒng)-滯留,許多編碼基因的細微突變?nèi)琰c突變或個別氨基酸的缺失，編碼蛋白還具有絕大部分生物活性，只是出現(xiàn)蛋白產(chǎn)物極細微的折疊異常，卻可導致疾病的發(fā)生。部分原因是“質(zhì)控系統(tǒng)”在發(fā)揮作用：蛋白產(chǎn)物極細微的折疊異常，雖然對活性影響不大，卻可以被分子伴侶等識別而滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，不能實現(xiàn)正常的轉(zhuǎn)位、轉(zhuǎn)運或分泌，從而不能到達生理位置執(zhí)行正
19、常的功能，導致疾病發(fā)生。,典型例子：1 抗胰蛋白酶缺陷病,1抗胰蛋白酶發(fā)生突變時，僅有 15% 的蛋白質(zhì)分泌出來，其余全部滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）中。這種滯留的原因部分是由 ER 的分子伴侶 calnexin 介導了折疊異常的突變蛋白的聚集。而異常產(chǎn)物的聚集大大妨礙了細胞的正?；顒?，導致肝硬化（cirrhosis）或肺氣腫 （emphysema）的發(fā)生。,當然，并不是所有的蛋白折疊異常都導致定位異常。有些蛋白質(zhì)錯誤折疊后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉樣纖維沉淀，產(chǎn)生毒性而致病，表現(xiàn)為蛋白質(zhì)淀粉樣纖維沉淀的病理改變。,這類疾病包括：人紋狀體脊髓變性?。–reutzfeldt-Jakob dise
20、ase, CJD）、老年癡呆癥（Alzheimers） 、亨停頓舞蹈病(Huntingtons disease, HD)、瘋牛病等等。,瘋牛病,牛海綿狀腦病(bovine spongiform encephalopathy, BSE): 俗稱瘋牛病(mad cow disease) :1986年首次在英國報道。該病潛伏期45年，發(fā)病初期表現(xiàn)為體質(zhì)變差，體重減輕，產(chǎn)奶量下降等非特異性癥狀。隨后神經(jīng)系統(tǒng)癥狀逐步明顯，出現(xiàn)小腦共濟失調(diào)、震顫等，由于病牛常表現(xiàn)出感覺過敏、恐懼甚至狂亂，因此俗稱“瘋牛病”。,瘋牛病中的蛋白質(zhì)構(gòu)象改變 瘋牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一組
21、人和動物神經(jīng)退行性病變。 正常的PrP富含-螺旋，稱為PrPc。 PrPc在某種未知蛋白質(zhì)的作用下可轉(zhuǎn)變?yōu)?折疊的PrPsc，從而致病。,研究蛋白質(zhì)折疊的意義,蛋白質(zhì)折疊機制的闡明將揭示生命體內(nèi)的第二套遺傳密碼，這是它的理論意義。 蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的預測,蛋白質(zhì)折疊研究的潛在應用前景,折疊機制的闡明對包涵體的復性會有重要幫助。 按照自己意愿設計我們需要的、具有特定功能的蛋白質(zhì)。,蛋白質(zhì)折疊研究的潛在應用前景,深入了解蛋白質(zhì)折疊與錯誤折疊的關系對于某些疾病的致病機制的闡明以及治療方法的尋找將大有幫助。 基因組序列的發(fā)展使我們得到了大量的蛋白質(zhì)序列，結(jié)構(gòu)信息的獲得對于揭示它們的生物學功能是十分重要的。,已知某相對分子質(zhì)量為240000的蛋白質(zhì)多肽鏈的一些節(jié)段是螺旋，另一些節(jié)段是折疊，其分子長度為5.0610-5cm,求分子中螺旋和折疊的百分率（2003年西南農(nóng)業(yè)大學考研題）,有一長鏈多肽，其側(cè)鏈上有30個羧基（pKa=4.3），10個咪唑基（pKa=7.0），15個-氨基（pKa=10）,設C-末端-羧基的pKa=3.5，N-末端-氨基的pKa=9.5，計算此多肽的等電點。（2002年中國科技大學考研題）,
蛋白質(zhì)折疊與折疊病.ppt
