參與DNA復(fù)制的酶類及DNA復(fù)制的調(diào)控(論文資料).ppt
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1、第三章 參與DNA復(fù)制的酶類及DNA復(fù)制的調(diào)控 第一節(jié) 參與DNA復(fù)制的酶類 DNA復(fù)制過(guò)程非常復(fù)雜,至少有20多種酶與蛋白質(zhì)參與。 一、DNA聚合酶(DNA polymerase)(一)作用機(jī)理 DNA聚合酶催化4種脫氧核苷酸合成DNA,即催化前一個(gè)脫氧核苷酸3OH與后一個(gè)脫氧核苷酸5P之間形成3,5-磷酸二酯鍵的反應(yīng),從而延長(zhǎng)DNA鏈,鏈延伸方向?yàn)?3,添加脫氧核苷酸的種類按堿基互補(bǔ)原則由模板DNA決定。 DNA聚合酶需要互補(bǔ)于DNA模板上的一小段RNA作引物,由引物提供DNA合成時(shí)需要的第一個(gè)3OH。因此DNA聚合酶需要的條件包括4種dNTP底物、Mg2、模板DNA和引物(圖3-1
2、)。,圖3-1 DNA聚合酶的催化作用,DNA聚合酶與3OH端周圍的單鏈DNA模板結(jié)合, 若進(jìn)入的脫氧核苷酸的堿基與模板配對(duì),該底物則結(jié)合到酶的三磷酸結(jié)合部位上。 在聚合酶催化下,引物鏈的3OH對(duì)底物的5P進(jìn)行親核攻擊,釋出焦磷酸根,形成磷酸二酯鍵,新生鏈由此延長(zhǎng)一個(gè)核苷酸,酶沿著模板鏈向前移動(dòng)一個(gè)核苷酸距離。 如此重復(fù),直至酶到達(dá)模板終點(diǎn)。在體內(nèi)釋放的焦磷酸被焦磷酸酶水解,使反應(yīng)平衡趨向DNA合成.,2005年12月Science報(bào)道了DNA聚合酶高保真機(jī)理的新發(fā)現(xiàn)。高保真聚合酶除具有廣為人知的校正功能外,最近實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明, 由不能及時(shí)校正或難于糾正的錯(cuò)配堿基引發(fā)“關(guān)閉” DNA聚合
3、反應(yīng)的效應(yīng), 同樣保證了DNA聚合反應(yīng)終產(chǎn)物純度。 高保真聚合酶這一“關(guān)閉” DNA聚合反應(yīng)的能力, 促成其與耐外切酶消化3末端敏感區(qū)堿基特異性引物共同構(gòu)成一個(gè)SNP敏感性納米級(jí)復(fù)合分子“開/關(guān)”,高保真聚合酶分子中相距三納米聚合中心和3端敏感區(qū) 5端敏感區(qū)外切酶酶解中心則既合作又獨(dú)立地起到了復(fù)合分子開關(guān)中“開”和“關(guān)”的效能:對(duì)配對(duì)的引物,則直接在該酶聚合中心進(jìn)行聚合反應(yīng),即“開”的效應(yīng);,而對(duì)于3 末端敏感區(qū)錯(cuò)配的引物,則從該酶聚合中心轉(zhuǎn)移至3末端敏感區(qū) 5 末端敏感區(qū)外切酶酶解中心,由于引物修飾了3 末端敏感區(qū)耐外切酶的特點(diǎn),繼而出現(xiàn)了一種長(zhǎng)時(shí)間無(wú)酶解產(chǎn)物的酶解過(guò)程,最后因酶聚合中心空轉(zhuǎn)
4、而“關(guān)”閉DNA聚合反應(yīng),即“關(guān)”的效應(yīng)。 這一新的復(fù)合分子“開/關(guān)”在很大程度上滿足了后基因時(shí)代對(duì)SNP分析的要求。該SNP分子開關(guān)的應(yīng)用, 使基因診斷提高到單堿基水平。同時(shí), 利用該方法通過(guò)SNP對(duì)基因組掃描, 在單基因遺傳病病因研究及法醫(yī)學(xué)鑒定上具有很強(qiáng)的理論和實(shí)用價(jià)值。,2006年7月Nature報(bào)道新發(fā)現(xiàn)突變相關(guān)的DNA聚合酶(Pol)可能導(dǎo)致DNA復(fù)制保真度下降而參與突變形成。除人細(xì)胞中已知的5種Pol,Pol、、、、,Pol、的復(fù)制保真度很低??赡茉谶z傳不穩(wěn)定形成中有作用。近兩年來(lái),據(jù)原核和低等真核細(xì)胞復(fù)制后修復(fù)(PRR)途徑的研究成果,在人細(xì)胞中克隆了5個(gè)新的Pol:Pol
5、 、、、和Rev1編碼蛋白。 大腸桿菌SOS反應(yīng)中的非定標(biāo)性突變的發(fā)生與dinB基因有關(guān)。DinB蛋白有Pol活性(Pol ),無(wú)35校讀功能。高表達(dá)時(shí)可導(dǎo)致非定標(biāo)性突變明顯升高達(dá)上千倍。無(wú)損傷模板摻入錯(cuò)誤率達(dá)10-310-4;大腸桿菌跨損傷DNA合成依賴于UmuD2C復(fù)合體,其中介導(dǎo)的途徑通常是易誤性的,它的突變引起誘發(fā)突變頻率的抑制。,UmuD2C復(fù)合體也具有Pol活性(稱為Pol V)。它在損傷或未損傷DNA模板皆表現(xiàn)為高度易誤性,能有效跨越DNA上無(wú)堿基部位(abasic site)并優(yōu)先插入一個(gè)腺嘌呤。 釀酒酵母PRR途徑有三個(gè)獨(dú)立旁路(一個(gè)易誤,兩個(gè)無(wú)誤)?;騌EV1、REV3和
6、REV7與易誤性旁路有關(guān)。其中Rev3和Rev7蛋白構(gòu)成Pol,Rev1蛋白為有DNA模板指導(dǎo)的dCMP轉(zhuǎn)移酶活性,因此也是一種Pol。 在芽生酵母中的兩條無(wú)誤PRR途徑依賴RAD5和RAD30基因。RAD30基因與大腸桿菌的DinB和UmuC和釀酒酵母中的Rev1基因同源。它可在DNA合成時(shí)在嘧啶二聚體的對(duì)面正確摻入兩個(gè)腺嘌呤。它是一個(gè)保真度很低的Pol,其摻入差錯(cuò)率高達(dá)10-2到10-3。,這些與突變形成密切相關(guān)的Pol在人細(xì)胞中都找到了相應(yīng)的同源物基因,與酵母中的REV3同源的hREV3編碼的Pol以及與Rev1同源的基因;與大腸桿菌中的DinB和酵母RAD30同源的hDinB基因編碼P
7、ol;與大腸桿菌UmuC和酵母RAD30同源的hRAD30基因編碼Pol、另一與酵母RAD30同源的hRAD30B編碼的Pol。已證明著色性干皮病變型(XPV)系Po1的突變所致。 這些新發(fā)現(xiàn)的Pol,可能與誘發(fā)的細(xì)胞遺傳不穩(wěn)定的形成有關(guān)。我們證明用反義核酸技術(shù)阻斷Pol表達(dá)的細(xì)胞系MNNG誘發(fā)的非定標(biāo)性突變的頻率減低。,(二)原核生物DNA聚合酶 在大腸桿菌體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了三類DNA聚合酶,根據(jù)發(fā)現(xiàn)時(shí)間順序分別命名為DNA聚合酶、、。 1.DNA聚合酶I 大腸桿菌DNA聚合酶I是第一個(gè)被鑒定的DNA聚合酶,它由polA基因座編碼,是一個(gè)103kD的單鏈多肽。每個(gè)大腸桿菌細(xì)胞中約有400個(gè)分子
8、DNA聚合酶I。 當(dāng)?shù)孜锖湍0宕嬖跁r(shí),聚合酶I可使脫氧核糖核苷酸依次加到具有3-OH末端的多核苷酸鏈上。它的催化需要引物鏈(DNA或RNA鏈)的存在。在37條件下,每分子DNA聚合酶I每分鐘中催化約1000個(gè)核苷酸的聚合。,DNA聚合酶I是一個(gè)多功能酶,它可以催化以下的反應(yīng): (1)DNA鏈沿53方向延長(zhǎng)(DNA聚合酶活性)。 (2)從3端水解DNA鏈(35核酸外切酶活性)。 (3)從5端水解DNA鏈(53核酸外切酶活性)。 (4)具有很強(qiáng)的校對(duì)功能( 35核酸外切酶活性)。 (5)有切口平移功能(53核酸外切酶活性)。 用蛋白水解酶將DNA聚合酶I作有限水解,可得到分子量68kD和36k
9、D的兩個(gè)片段。,較大的斷裂產(chǎn)物(68kD)叫Klenow片段,在體外它可催化DNA的合成反應(yīng),Klenow片段有DNA聚合酶活性和35核酸外切酶活性,兩種活性分別處于片段的不同區(qū)域。 C端的2/3片段具有聚合酶活性,N端的13片段有核酸外切酶活性,在蛋白質(zhì)中,兩個(gè)活性位點(diǎn)的距離為3nm,表明堿基的加入和去除功能在空間上是分開的。 小片段(35kD)有53核酸外切酶活性,可以切除少量的核苷酸,一次最多切除10 個(gè)鹼基。,該酶在切除由紫外線照射而形成嘧啶二聚體中起重要作用,在DNA的半不連續(xù)合成中,岡崎片段5-端RNA引物的切除可能也依賴于該外切酶,小亞基的外切酶活性和大亞基的聚合校對(duì)功能協(xié)同作
10、用,使DNA聚合酶I在體外具有從切口處起始復(fù)制的獨(dú)特能力,而其他DNA聚合酶不具備這種能力。 在雙鏈DNA的磷酸二酯鍵斷裂處,DNA聚合酶I可延伸3末端,合成新的DNA片段后,DNA聚合酶I可置換雙螺旋中已有的同源鏈。,置換出的同源鏈被53核酸外切酶降解。除部分片段被新合成的材料取代且缺口位置沿雙螺旋移動(dòng)外,DNA性質(zhì)沒有任何改變。 該反應(yīng)在實(shí)踐中很有意義,體外的切口移位是在DNA分子上引入放射性標(biāo)記核苷酸的重要技術(shù),在體內(nèi),53聚合酶合成活性和35核酸外切酶活性主要用來(lái)填充DNA雙鏈中短的單鏈區(qū)域,復(fù)制過(guò)程中或從DNA中切除受損的鹼基后會(huì)產(chǎn)生這些單鏈區(qū)域。,2.DNA聚合酶II DNA聚合
11、酶II是一條分子量為120KD的多肽鏈。該酶活性很低,只有DNA聚合酶I的5。它也以4種脫氧核苷酸為底物,按53方向合成DNA。DNA聚合酶II具有35核酸外切酶活性,但無(wú)53外切酶活性。它在DNA修復(fù)中起一定作用。 3.DNA聚合酶III 盡管細(xì)菌中存在大量的DNA聚合酶I,但它并不是復(fù)制的主要酶。在polA的突變型中,復(fù)制仍可繼續(xù)進(jìn)行。 目前,DNA聚合酶III(PolIII)被認(rèn)為是真正負(fù)責(zé)大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)DNA合成的復(fù)制酶。 DNA聚合酶III是多個(gè)亞基組成的蛋白質(zhì),細(xì)胞中含量很少,在每個(gè)細(xì)胞中只有1020個(gè)拷貝的全酶。 PolIII全酶由、、、、、、、、、10種不同的亞基組
12、成,至少含3種重要的酶活性。,核心聚合酶(core polymerase)由、、三種亞基組成,其中亞基分子量為130kD,由dnaE編碼,具有53的聚合活性,每秒可以合成8個(gè)核苷酸。 亞基具有35核酸外切酶的校對(duì)功能,由dnaQ編碼合成。在體內(nèi)亞基基本功能是保證復(fù)制的忠實(shí)性,這可由dnaQ突變體的表型所證實(shí),在細(xì)菌株中突變發(fā)生的概率增加了1000倍。亞基常與亞基形成一個(gè)緊密的1:l復(fù)合物,協(xié)同發(fā)揮功能。 細(xì)胞中大約有40分子核心酶,其中只有一半被組裝到全酶中,核心酶活性較低,以大約每秒20個(gè)核苷酸的速度合成DNA。,二聚體:亞基是以二聚體的形式存在,在復(fù)制過(guò)程中二聚體環(huán)繞著DNA,并能在D
13、NA上自由滑動(dòng),構(gòu)成一個(gè)滑動(dòng)鉗。 滑動(dòng)鉗可把全酶束縛在DNA模板上,從而保證高度的進(jìn)行性,當(dāng)pol結(jié)合鉗時(shí),全酶的進(jìn)行性可從每次聚合10個(gè)核苷酸提高到每次聚合50000個(gè)核苷酸,聚合反應(yīng)速度從每秒20個(gè)核苷酸上升到每秒750個(gè)核苷酸,因此鉗的存在對(duì)大腸桿菌染色體高效復(fù)制是十分重要的,亞基可以很容易從全酶中脫離。 與核心酶相比,在細(xì)胞中亞基含量很豐富,大約每個(gè)細(xì)胞中含300個(gè)二聚體。,復(fù)合物:復(fù)合物(complex)是滑動(dòng)鉗的載體,可幫助滑動(dòng)鉗結(jié)合到DNA上。復(fù)合物含有5個(gè)不同亞基,形成一種化學(xué)計(jì)量為21111的結(jié)構(gòu)。和亞基是由不同基因編碼產(chǎn)生的不同蛋白質(zhì)。復(fù)合物有依賴DNA的ATP酶活性。
14、 二聚體自己并不能組裝到DNA上 ,它是通過(guò)復(fù)合物與ATP協(xié)同作用催化ATP的水解而組裝到DNA上。 DNA聚合酶、、均具有53聚合酶活性和35核酸外切酶活性,因此在合成DNA時(shí),能識(shí)別和切除不配對(duì)的引物末端,起著嚴(yán)格校對(duì)作用,以保證復(fù)制的真實(shí)性。,DNA聚合酶的特別之處在于它具有53外切酶活性。這種活性只作用于雙鏈DNA,從5-端切除寡核苷酸。由于它能跳過(guò)幾個(gè)核苷酸起作用,因此能切除由紫外線照射形成的胸腺嘧啶二聚體,參與DNA損傷的修復(fù)。 DNA聚合酶能催化切口平移和鏈置換反應(yīng),雙鏈DNA的一條鏈發(fā)生斷裂,出現(xiàn)切口,DNA聚合酶與切口結(jié)合,其53外切酶活性與聚合作用同時(shí)發(fā)生。即它一邊催
15、化3-OH與三磷酸核苷酸產(chǎn)生聚合反應(yīng),一邊在5端逐一水解核苷酸,切口就沿著DNA鏈從53方向移動(dòng)。這種移動(dòng)稱為切口平移(nick translation)(圖3-2)。,圖3-2 DNA聚合酶I的切口平移,如果選擇合適的實(shí)驗(yàn)條件,使聚合作用發(fā)生在單鏈切口處而不同時(shí)出現(xiàn)53外切酶活性,這種延伸中的鏈就置換了親鏈,即所謂鏈置換反應(yīng),這被認(rèn)為是遺傳重組機(jī)制中的一個(gè)重復(fù)步驟。 在迄今所知的大腸桿菌聚合酶中,唯有DNA pol能獨(dú)立地進(jìn)行鏈置換反應(yīng)。其它鏈置換反應(yīng)中,需要輔助蛋白,并裂解ATP為解螺旋提供能量。,利用切口平移反應(yīng),可獲得標(biāo)記的DNA探針。 將DNA聚合酶、帶有切口的雙鏈DNA分子以及放
16、射性標(biāo)記的三磷酸脫氧核糖核苷一起反應(yīng),可合成帶有放射性標(biāo)記的DNA探針,而同時(shí)降解未被標(biāo)記的DNA。 DNA聚合酶在DNA損傷時(shí)表達(dá)增加,還參與SOS修復(fù)反應(yīng),能以損傷的DNA鏈為模板合成新生鏈。這種特性易于造成DNA的永久突變。 表3-1總結(jié)了原核生物三種DNA聚合酶的特性和功能。,表3-1 原核生物DNA聚合酶性質(zhì)比較,(三)真核生物DNA聚合酶 真核生物中現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)五種DNA聚合酶,分別命名為....等。 它們的基本性質(zhì)與原核生物DNA聚合酶相似,其活性依賴于帶有3OH的引物、DNA模板和4種dNTP。表3-2列出了真核生物DNA聚合酶的基本特性和功能。,,,,,,表3-2 真核生
17、物DNA聚合酶性質(zhì)總結(jié),二、真核生物DNA聚合酶附屬蛋白 利用SV40體外復(fù)制系統(tǒng),已相繼鑒定出一些真核生物DNA聚合酶附屬蛋白。主要有增殖細(xì)胞核抗原(PCNA),復(fù)制因子C(RFC)、識(shí)別引物的PRP1和PRP2蛋白以及聚合酶相關(guān)因子(AAF)等。 1.PCNA是DNApol的附屬蛋白 能極大地促進(jìn)DNApol的合成活性。其分子量為36103。已在人、大鼠、小鼠、果蠅、酵母等生物中克隆了PCNA的基因。它們的氨基酸序列有較高同原性,結(jié)構(gòu)也相當(dāng)保守。 PCNA可能是通過(guò)與RFC和ATP自由結(jié)合到引物末端,或通過(guò)ATP非依賴方式滑動(dòng)到引物末端而增強(qiáng)DNApol的催化效率。最近有研究表明,P
18、CNA在DNA的切除修復(fù)中起一定作用。,2.RFC是一個(gè)多亞基復(fù)合物 因細(xì)胞類型的不同,RFC亞基數(shù)也從3個(gè)到7個(gè)不等。140103的大亞基識(shí)別DNA模板引物,40103小亞基結(jié)合ATP,RFC在體外能增強(qiáng)DNApol和的活性。RFC結(jié)合到引物末端并通過(guò)DNA刺激的ATPase活性與PCNA結(jié)合形成一個(gè)引物識(shí)別復(fù)合物。此復(fù)合物對(duì)DNApol的親和力高而與DNApol的親和力低。 3.PRP1和PRP2是兩個(gè)引物識(shí)別蛋白 分子量分別為36103和43103,它們降低引物末端的Km,使DNApol與模板引物末端的親和力增加2030倍,從而促進(jìn)DNApol的活性。 4.AAF是模板親和蛋白 A
19、AF由兩個(gè)亞基組成,分子量分別為132103和44103。它是一種模板親和蛋白,有促進(jìn)DNApol引發(fā)酶利用未經(jīng)引發(fā)的模板,作為一種DNApol引發(fā)酶的活化因子,AAF輔助它們?cè)诤箅S鏈上的催化活性。,三、DNA引物酶 E-coli的引物酶由DnaG基因編碼,合成的引物是pppAC(N)7-10。真核生物引物酶是由48X103和58X103二個(gè)亞基組成的異源二聚體,與DNApol形成緊密復(fù)合物,合成的引物為pppA(N)10,其特點(diǎn)是緩慢起始,快速聚合及在DNApol起始合成前準(zhǔn)確終止。 四、DNA連接酶 DNA連接酶催化岡崎片段間磷酸二酯鍵的形成,不同于聚合酶的催化反應(yīng)。當(dāng)DNA雙鏈中
20、的一條單鏈?zhǔn)峭暾?,DNA連接酶能催化另一條鏈的相鄰5P與3OH之間形成3,5-磷酸二酯鍵,且偶聯(lián)NAD(原核生物)或ATP(真核生物)的水解(圖 3-3)。,圖3-3 連接酶連接模板鏈上相鄰兩個(gè)片段的切口,DNA連接酶除了可以閉合雙鏈DNA中的單鏈切口,還可閉合RNADNA雜交體雙鏈中的單鏈切口,但不能閉合雙鏈RNA中的單鏈切口。在有過(guò)量ATP存在時(shí),T4噬菌體連接酶可連接平頭雙鏈DNA,但大腸桿菌連接酶不能催化這種連接反應(yīng)。 原核生物大多只有一種形式連接酶,真核生物則有多種形式連接酶。不同形式連接酶的催化特性,對(duì)底物及ATP親和力以及對(duì)細(xì)胞增殖的作用均有所不同。 DNA連接酶的催化性質(zhì),
21、決定了該酶在DNA復(fù)制中的重要地位,它的作用還涉及到DNA修復(fù)和重組以及DNA重組技術(shù)。,五、與DNA解旋和解鏈有關(guān)的酶 在雙鏈DNA復(fù)制過(guò)程中,由于復(fù)制叉的移動(dòng)速度快(原核生物為1000bp/s,真核生物為100bp/s),DNA雙螺旋不斷解開,在復(fù)制叉前方的DNA雙鏈會(huì)出現(xiàn)過(guò)度的正超螺旋甚至打結(jié)現(xiàn)象,阻礙DNA的繼續(xù)復(fù)制,生物體依靠一系列DNA解旋解鏈酶,不斷消除產(chǎn)生的正超螺旋,保證復(fù)制的進(jìn)行。 (一)DNA螺旋酶(DNA helicase) 也稱DNA解旋蛋白(DNA unwinding protein)。它的作用是催化雙螺旋DNA的解旋和解鏈。該過(guò)程需水解ATP提供能量(打開
22、一個(gè)AT對(duì)約需5KJ.mol-1,打開一個(gè)GC對(duì)約需21KJ.mol-1)。,從大腸桿菌分離得到數(shù)種DNA螺旋酶,分別稱為螺旋酶、、和rep蛋白等,后三者與大腸桿菌DNA復(fù)制有關(guān)。 在復(fù)制過(guò)程中,螺旋酶、沿著后隨鏈模板,從53方向移動(dòng),促使復(fù)制叉向前延伸,而rep蛋白是沿著前導(dǎo)鏈模板,以35方向向前移動(dòng),促進(jìn)雙鏈不斷解開。 在真核生物中也發(fā)現(xiàn)多種螺旋酶,如從小牛胸腺中分離到8種螺旋酶,但有關(guān)其作用機(jī)制及其在DNA復(fù)制中所起的確切作用仍不清楚。 現(xiàn)在正試圖克隆和表達(dá)螺旋酶的基因,分析它的結(jié)構(gòu)并研究其是否細(xì)胞存活所必需,研究其是否受細(xì)胞周期調(diào)控以及在復(fù)制叉模型中的作用。,(二)拓?fù)洚悩?gòu)酶(T
23、opo merase) 在原核和真核生物中都發(fā)現(xiàn)二類拓?fù)洚悩?gòu)酶(和)。原核生物中與復(fù)制有關(guān)的主要是Topo,又稱DNA回旋酶(DNA gyrase),原核生物Topo可能與轉(zhuǎn)錄有關(guān)。 DNA回旋酶的作用是在水解ATP的同時(shí)使松馳態(tài)環(huán)狀DNA轉(zhuǎn)變?yōu)樨?fù)超螺旋DNA。這種作用很復(fù)雜,涉及三個(gè)步驟: (1)DNA回旋酶首先與DNA結(jié)合,并使環(huán)狀DNA扭曲而形成一“右手結(jié)”結(jié)構(gòu)。這個(gè)作用是形成一個(gè)穩(wěn)定的正超螺旋(以“”表示),同時(shí)又引入一個(gè)負(fù)超螺旋(以“”表示)。,(2)然后DNA回旋酶在右手結(jié)的背后打斷雙鏈DNA,并穿到另一條鏈前面,這樣就將右手性正超螺旋變?yōu)樽笫中载?fù)超螺旋。 (3)最后斷點(diǎn)再連
24、接起來(lái)。這個(gè)過(guò)程需ATP水解供能;引入的負(fù)超螺旋能使打開堿基對(duì)所需的能量降低約4.1KJ.mol-1,利于DNA解鏈復(fù)制(圖3-4) 。,圖3-4 拓?fù)洚悩?gòu)酶的催化作用,真核生物中Topo和均與復(fù)制有關(guān)。Topo不需消耗ATP,其酪氨酸殘基能與DNA 3P基團(tuán)形成共價(jià)結(jié)合的中間產(chǎn)物,它能使負(fù)或正超螺旋變?yōu)樗神Y態(tài)。 Topo需要ATP供能,它不僅參與DNA復(fù)制,還促進(jìn)兩個(gè)子代分子分離。 真核生物Topo無(wú)論在細(xì)胞增殖期還是在靜止期,都維持在較高水平,與細(xì)胞生長(zhǎng)速率無(wú)關(guān)。而Topo水平在細(xì)胞增殖期比在細(xì)胞靜止期高100倍以上。,令人感興趣的是Topo在腫瘤細(xì)胞水平很高,與其增殖潛能相平行。
25、有人從中得到啟發(fā),正在研究Topo的抑制劑,觀察它在腫瘤治療中的效果。 Topo與Topo的另一不同之處在于它獨(dú)特地沿著染色體分布,與染色體結(jié)構(gòu)、壓縮及核基質(zhì)組成有關(guān)。,(三)單鏈結(jié)合蛋白(Single-strand Binding protein,SSB) SSB對(duì)單鏈DNA的親和力極高,但幾乎沒有序列特異性。它們的基本特征是結(jié)合單鏈DNA,刺激DNA聚合酶的活化并與其他復(fù)制蛋白作用形成復(fù)合物等。 SSB常組成同亞基多聚體,它與DNA的結(jié)合呈現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)。 最早研究得較為清楚的是E-coli SSB蛋白以及T4噬菌體基因32產(chǎn)物。,在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中分離的單鏈結(jié)合蛋白,命名為復(fù)制因子A(RFA
26、)。 RFA由分子量分別為70KD、32-34KD和11-14KD的三個(gè)不同亞基組成。其中76KD的大亞基具有單鏈DNA結(jié)合活性,還能促進(jìn)DNApol和的聚合作用,32KD的亞基可被CDK2激酶磷酸化,與細(xì)胞周期有關(guān)。 RFA不僅在DNA復(fù)制時(shí),起始解鏈中起作用,還促進(jìn)DNA鏈的延長(zhǎng)。圖3-5總結(jié)了與DNA復(fù)制有關(guān)的酶在大腸桿菌復(fù)制叉中的作用。,圖3-5 各種因子在DNA復(fù)制中的作用,第二節(jié) DNA復(fù)制的調(diào)控 DNA復(fù)制是細(xì)胞增殖的一個(gè)關(guān)鍵事件,因此,DNA復(fù)制與細(xì)胞分裂是互相協(xié)調(diào)、互相調(diào)控的。 “細(xì)胞分裂周期” 也稱“細(xì)胞周期” ,是指一個(gè)細(xì)胞經(jīng)生長(zhǎng)、分裂而增殖成兩個(gè)細(xì)胞所經(jīng)歷的全過(guò)程
27、,通常可分為若干階段,即G1期、S期、G2期和M期。 細(xì)胞在G1期完成必要的生長(zhǎng)和物質(zhì)準(zhǔn)備,在S期完成其遺傳物質(zhì)染色體DNA的復(fù)制,在G2期進(jìn)行必要的檢查及修復(fù)以保證DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性,然后在M期完成遺傳物質(zhì)到子細(xì)胞中的均等分配,并使細(xì)胞一分為二。,原核細(xì)胞DNA復(fù)制完成后即發(fā)生細(xì)胞分裂,而真核細(xì)胞中DNA復(fù)制只發(fā)生在細(xì)胞周期中特定時(shí)期,細(xì)胞周期合成期-S期。 通常在一個(gè)細(xì)胞周期中,DNA必須也只能復(fù)制一次。科學(xué)家發(fā)現(xiàn),細(xì)胞內(nèi)有一個(gè)調(diào)控機(jī)構(gòu),使細(xì)胞周期能有條不紊地依次進(jìn)行。細(xì)胞周期各期的轉(zhuǎn)變均受某些基因產(chǎn)物的調(diào)節(jié),其中有細(xì)胞周期蛋白家族(Cyclins)、細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶家族(Cycl
28、in Dependent protein Kinases,CDKs)和其它一些蛋白質(zhì)。,細(xì)胞能否分裂最主要決定因素是其能否進(jìn)入S期,即是否進(jìn)行DNA復(fù)制。 細(xì)胞周期調(diào)控主要發(fā)生在從G1S和從G2M這二個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)上,調(diào)節(jié)這二個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)的事件都涉及Cyclin和CDK的作用。通過(guò)蛋白激酶對(duì)多種蛋白質(zhì)特殊調(diào)節(jié)位點(diǎn)的磷酸化而激活或抑制它們的活性,以適應(yīng)其功能需要。 細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)的蛋白激酶都是由調(diào)節(jié)亞基和催化亞基組成的異源二聚體。調(diào)節(jié)亞基稱為細(xì)胞周期蛋白(Cyclin),其濃度隨細(xì)胞周期而變化;催化亞基又稱細(xì)胞周期蛋白依賴激酶(CDKs)。同一CDK可與不同的周期蛋白相連接以決定不同的蛋白質(zhì)被磷酸化。,
29、哺乳動(dòng)物中,調(diào)控DNA合成起始的周期蛋白和CDK通常為周期蛋白E或A及與之相關(guān)聯(lián)的CDK2,而調(diào)節(jié)有絲分裂起始的常是周期蛋白A和B及與之相關(guān)聯(lián)的激酶CDK2。 爪蛙卵提取物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),DNA起始復(fù)制必須有CDK2和周期蛋白E或A的存在。 在鼠成纖維細(xì)胞中,周期蛋白E的過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞很快從G1期進(jìn)入S期。 以上證實(shí)CDK2及周期蛋白E在調(diào)控DNA復(fù)制起始中的作用。,酵母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)一類S期啟動(dòng)蛋白(S-phase promoting factor,SPF),它由細(xì)胞周期蛋白依賴激酶CDK28和周期蛋白G1組成。 CDK28蛋白由CDK28基因編碼,在溫度敏感突變株中,CDK28失活,細(xì)胞不
30、能進(jìn)入S期,DNA不能合成。編碼G1蛋白的基因有三個(gè):cln1、cln2、cln3。 利用基因敲除技術(shù)(gene knockout)缺失三個(gè)cln基因中的任一個(gè),細(xì)胞仍能存活,而同時(shí)缺失三個(gè)cln基因,細(xì)胞只能停留在G1期,不能起始DNA合成。,最近發(fā)現(xiàn)有更多的周期蛋白和CDK參與細(xì)胞周期中DNA復(fù)制的調(diào)控。 如周期蛋白D及與之相關(guān)的CDk4在G1期結(jié)束時(shí)達(dá)到高峰,而在S期開始時(shí)即下降,提示它們?cè)贕1S期轉(zhuǎn)換中起作用(表3-3)。,表3-3 酵母細(xì)胞及哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的CDk和周期蛋白,2001年度諾貝爾生理學(xué)醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)獲得者美英科學(xué)家,因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)了細(xì)胞周期關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶(CD
31、K)和周期蛋白(cyclin)。,,,,,,,2001年諾貝爾生理學(xué)醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)得主(依次為利蘭哈特韋爾提莫西.亨特保羅.納斯),細(xì)胞周期的準(zhǔn)確調(diào)控對(duì)生物的生存、繁殖、發(fā)育和遺傳均是十分重要的。簡(jiǎn)單生物調(diào)控細(xì)胞周期主要是為適應(yīng)自然環(huán)境,以便根據(jù)環(huán)境狀況調(diào)節(jié)繁殖速度,以保證物種繁衍。復(fù)雜生物細(xì)胞則需面對(duì)來(lái)自自然環(huán)境和其他細(xì)胞、組織的信號(hào),并作出正確的應(yīng)答,以保證組織、器官和個(gè)體的形成、生長(zhǎng)以及創(chuàng)傷愈合等過(guò)程能正常進(jìn)行,因而需要更為精細(xì)的細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制。 早期研究集中在細(xì)胞周期的特性上,主要發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞周期有序性,并發(fā)現(xiàn)在G1晚期內(nèi)有一個(gè)關(guān)鍵的限制點(diǎn),也稱R點(diǎn):通過(guò)R點(diǎn)的細(xì)胞將不可逆地進(jìn)入S期直至完成細(xì)
32、胞分裂,否則則可因環(huán)境或內(nèi)部的不利變化而繼續(xù)留在G1期。,為認(rèn)識(shí)細(xì)胞周期調(diào)控分子機(jī)制,科學(xué)家研究了各種實(shí)驗(yàn)材料,包括微生物、軟體動(dòng)物、昆蟲、兩棲動(dòng)物和哺乳類動(dòng)物等。 哈特韋爾博士在1970年以單細(xì)胞生物面包酵母(也稱芽殖酵母)為材料,利用遺傳學(xué)方法,先后發(fā)現(xiàn)上百個(gè)突變后導(dǎo)致細(xì)胞周期異常的基因。其中一個(gè)被稱作CDC28基因,對(duì)細(xì)胞周期啟動(dòng),即細(xì)胞能否通過(guò)R點(diǎn)(在酵母中被稱為啟動(dòng)點(diǎn))很關(guān)鍵,因此也被稱作啟動(dòng)基因。,納斯博士則以裂殖酵母為實(shí)驗(yàn)材料,發(fā)現(xiàn)了功能及編碼蛋白均與CDC28非常相似的CDC2基因,并從高等生物中也克隆到了類似基因,從而說(shuō)明細(xì)胞周期調(diào)節(jié)機(jī)制在進(jìn)化過(guò)程中是保守的:從酵母到人,其細(xì)
33、胞周期進(jìn)行都由CDC2基因控制。 后來(lái)這類基因被統(tǒng)稱作CDK基因,為周期蛋白依賴性蛋白激酶的英文縮寫。有趣的是,盡管酵母細(xì)胞中只有一個(gè)CDK基因,高等生物中卻有多個(gè),體現(xiàn)了進(jìn)化程度不同的物種對(duì)調(diào)控系統(tǒng)復(fù)雜性和精確性的不同需求。,亨特從海膽中發(fā)現(xiàn)了CDK的“伴侶”--周期蛋白。這類蛋白因其含量在細(xì)胞周期中呈周期性變化而被發(fā)現(xiàn)并得名。周期蛋白與CDK蛋白形成復(fù)合物,使CDK發(fā)揮激酶活性。有活性的激酶把磷酸基聯(lián)到特定蛋白質(zhì)上,使后者性質(zhì)發(fā)生變化,從而又影響其下游蛋白,如此實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)功能。 酵母細(xì)胞只有一個(gè)CDK基因,但有若干種周期蛋白基因。不同周期蛋白在不同時(shí)期被合成出來(lái),然后又被適時(shí) 地降解。這樣,
34、CDK激酶活性就像引擎中汽缸一樣被依次點(diǎn)燃,從而驅(qū)動(dòng)細(xì)胞周期周而復(fù)始地“轉(zhuǎn)動(dòng)”,細(xì)胞不斷增殖。 高等生物含有多個(gè)CDK,每種CDK可與不同周期蛋白結(jié)合,反之亦然。如此復(fù)雜的搭配可能會(huì)增加在同種細(xì)胞內(nèi)的調(diào)節(jié)精度,也可能用于在不同組織的細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)不同的調(diào)節(jié),而有的CDK復(fù)合物則參與調(diào)節(jié)其他生命活動(dòng),如神經(jīng)細(xì)胞分化等。除周期蛋白外,CDK活性還受到磷酸化、去磷酸化、CDK抑制蛋白等的調(diào)節(jié)。細(xì)胞周期調(diào)控的復(fù)雜性,由此可見一斑。,細(xì)胞周期與多種人類疾病相關(guān),其中最重要的莫過(guò)于與腫瘤和癌癥的關(guān)系。腫瘤和癌癥的主要原因是細(xì)胞周期失調(diào)后導(dǎo)致的細(xì)胞無(wú)限制增殖。 從分子水平看,由于基因突變致使細(xì)胞周期促進(jìn)因子(或
35、稱“癌蛋白)不恰當(dāng)?shù)幕罨?,和或抑制因子(即“抑癌蛋白”)失活,造成?xì)胞周期調(diào)節(jié)失控。其中,破壞R點(diǎn)正常控制、由癌蛋白使細(xì)胞同期調(diào)控系統(tǒng)總得到“增殖”指令,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞大量增殖。所以,阻止癌細(xì)胞分裂即可達(dá)到抑制其惡性生長(zhǎng)甚至將其殺滅的目的。實(shí)際上多數(shù)腫瘤化療藥物均是細(xì)胞周期抑制劑,但缺點(diǎn)是它們“良莠不分”,也抑制正常細(xì)胞。 對(duì)細(xì)胞周期分子機(jī)制的研究,不僅使我們能深刻認(rèn)識(shí)這一重要生命活動(dòng)的本質(zhì),還可能通過(guò)針對(duì)性的設(shè)計(jì)和篩選,開發(fā)出更專一、更有效的治療藥物及治療方法。深入的研究也將使相關(guān)疾病病因的基因診斷和針對(duì)性基因治療成為可能。,一、復(fù)制起始位點(diǎn)的選擇 真核細(xì)胞基因組DNA有多個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn),是
36、否每次復(fù)制時(shí)都起用所有起始位點(diǎn),要視細(xì)胞分裂的快慢、細(xì)胞周期的長(zhǎng)短,特別是S期的長(zhǎng)短。 在動(dòng)物發(fā)育過(guò)程中,細(xì)胞周期中的S期可以短至幾分鐘,或長(zhǎng)至幾個(gè)小時(shí)。在胚胎期,細(xì)胞分裂很快,S期很短,基因組復(fù)制在幾分鐘內(nèi)完成,起用復(fù)制起始位點(diǎn)很多。 在成熟組織中,細(xì)胞分裂較慢,S期較長(zhǎng),基因組復(fù)制在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)完成,起用復(fù)制起始位點(diǎn)較少。在蟾蜍和果蠅的發(fā)育過(guò)程中,在中囊胚期轉(zhuǎn)變之前,DNA復(fù)制起始位點(diǎn)沒有特異性;在中囊胚期轉(zhuǎn)變之后,DNA復(fù)制有選擇地在某些DNA復(fù)制起始位點(diǎn)起始。,有研究表明,真核細(xì)胞Pre-RC在許多復(fù)制起始位點(diǎn)上組裝,但是有Pre-RC組裝的復(fù)制起始位點(diǎn)并不一定起始DNA復(fù)制。 也就
37、是說(shuō),有Pre-RC組裝的復(fù)制起始位點(diǎn)數(shù)目比實(shí)際上發(fā)揮起始DNA復(fù)制作用的復(fù)制起始位點(diǎn)數(shù)目大。這些現(xiàn)象表明真核生物體內(nèi)存在調(diào)控復(fù)制起始位點(diǎn)的機(jī)制。 復(fù)制起始位點(diǎn)的調(diào)控主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面: 1.調(diào)控啟動(dòng)DNA復(fù)制起點(diǎn)的多少。 2.調(diào)控在哪些復(fù)制起點(diǎn)上起始DNA的復(fù)制。,所謂DNA復(fù)制起點(diǎn)有兩個(gè)概念,即遺傳性(或結(jié)構(gòu)性)和功能性。遺傳性起點(diǎn)是一種DNA順式作用元件,可使環(huán)形DNA自主復(fù)制。功能性起點(diǎn)是染色體上確實(shí)起始DNA復(fù)制的位點(diǎn)。 在原核生物基因組中,只有一個(gè)DNA順式作用元件與復(fù)制起始蛋白相互作用,成為復(fù)制的功能性起點(diǎn)。 真核生物基因組比原核生物基因組大得多,具有很多遺傳性起點(diǎn),但并不
38、是每個(gè)遺傳性復(fù)制起點(diǎn)都作為功能性起點(diǎn)起始DNA復(fù)制。在真核生物中,有多種因素參與決定遺傳性復(fù)制起點(diǎn)起始DNA復(fù)制。,酵母復(fù)制起點(diǎn)叫自主復(fù)制序列(ARS)。有些可在體外使環(huán)狀DNA復(fù)制的ARS,在酵母染色體中并不起始DNA復(fù)制。如在酵母3號(hào)染色體中有14個(gè)ARS元件,但具有起始復(fù)制功能的只有6個(gè),其它ARS都不能起始DNA復(fù)制。功能性復(fù)制起點(diǎn)在染色體內(nèi)的位置改變,可使本身不能起始DNA復(fù)制。 科學(xué)家發(fā)現(xiàn),將裂殖酵母3號(hào)染色體中Ura4基因的強(qiáng)復(fù)制起點(diǎn)缺失后,其附近的弱復(fù)制起點(diǎn)可成為強(qiáng)復(fù)制起點(diǎn)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明ARS元件所處的環(huán)境可控制它們的狀態(tài)。,到目前為止,高等真核生物中還未確定是否存在遺傳
39、性DNA復(fù)制起點(diǎn)序列特征,但功能性復(fù)制起點(diǎn)的確存在。目前對(duì)高等真核生物中功能性復(fù)制起點(diǎn)的性質(zhì)了解也不多。為了解多細(xì)胞生物復(fù)制起點(diǎn)的特征。人們開始重視研究細(xì)胞核或染色體結(jié)構(gòu)對(duì)復(fù)制起始的調(diào)控。 近來(lái),人們發(fā)現(xiàn)將G1期完整的CHO細(xì)胞核和蟾蜍卵細(xì)胞提取物共同孵育后,起始DNA復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)不是隨機(jī)的,與正常培養(yǎng)的CHO細(xì)胞一樣。當(dāng)損壞的細(xì)胞核或裸DNA代替G1期完整的細(xì)胞核后,起始DNA復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)是隨機(jī)的。說(shuō)明在真核生物中細(xì)胞核和染色體結(jié)構(gòu)可以調(diào)節(jié)DNA復(fù)制的起始。 細(xì)胞核和染色體結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)DNA復(fù)制的機(jī)制,將成為研究的熱點(diǎn)。,二、DNA在一個(gè)細(xì)胞周期中只復(fù)制一次的調(diào)控 真核基因組中有很多復(fù)制
40、子,每個(gè)復(fù)制子的復(fù)制起點(diǎn)在一個(gè)細(xì)胞周期中僅被激活一次。這種調(diào)控機(jī)制的關(guān)鍵問題是機(jī)體是如何識(shí)別哪些復(fù)制起始位點(diǎn)在一個(gè)細(xì)胞周期中已起始復(fù)制過(guò)DNA,有哪些蛋白組分參與? 1.復(fù)制的允許機(jī)制 蟾蜍卵細(xì)胞復(fù)制系統(tǒng)是了解這些蛋白組分的很好系統(tǒng),該系統(tǒng)中的DNA只發(fā)生一次復(fù)制。 蟾蜍卵細(xì)胞包含DNA復(fù)制所需要的所有蛋白質(zhì)組分,在受精后的幾個(gè)小時(shí)里,它們可以進(jìn)行11次分裂,而沒有新基因的表達(dá)。 將外源性細(xì)胞核注射到蟾蜍卵細(xì)胞內(nèi)后,外源性細(xì)胞核內(nèi)DNA只發(fā)生一次DNA復(fù)制,圖3-6概括了該系統(tǒng)的特征。,圖 3-6 蟾蜍卵細(xì)胞復(fù)制系統(tǒng)證明,如果卵細(xì)胞內(nèi)的蛋白合成被阻斷,而且外源性細(xì)胞核膜完整,DNA不能再次
41、復(fù)制;如果卵細(xì)胞象正常細(xì)胞一樣分裂,蛋白質(zhì)合成正常進(jìn)行,外源性細(xì)胞核膜被降解,DNA可以再次復(fù)制。 這提示細(xì)胞核內(nèi)存在一種或多種DNA復(fù)制必需的蛋白質(zhì),它們?cè)谝粋€(gè)細(xì)胞周期中一次復(fù)制后被用完或被降解。這種(些)蛋白質(zhì)在細(xì)胞漿里還有很多,但它們不能進(jìn)入細(xì)胞核,只有當(dāng)細(xì)胞核膜降解時(shí)才能進(jìn)入細(xì)胞核,這些蛋白質(zhì)被稱為“允許因子”(licensing factor)。 這種機(jī)制可以防止復(fù)制在一個(gè)細(xì)胞周期里再次發(fā)生,圖7-7簡(jiǎn)單解釋了“允許因子”防止復(fù)制再次發(fā)生的機(jī)制。,,圖3-7“允許因子”防止復(fù)制再次發(fā)生的機(jī)制,在復(fù)制前,細(xì)胞核內(nèi)存在有活性的“允許因子”,基因組復(fù)制一次后可以使允許因子全部失活或降解
42、,細(xì)胞質(zhì)中的“允許因子”不能進(jìn)入細(xì)胞核。允許因子只有在細(xì)胞分裂期(核膜降解時(shí)),才能進(jìn)入細(xì)胞核。細(xì)胞核內(nèi)再出現(xiàn)允許因子后,才能進(jìn)行基因組復(fù)制。 啤酒酵母中的MCM2,3,5復(fù)合物是一種允許因子,該復(fù)合物是復(fù)制必需的,且只有在分裂期才能進(jìn)入細(xì)胞核。 動(dòng)物細(xì)胞在整個(gè)細(xì)胞周期中都有MCM2,3,5復(fù)合物,它可以與基因組DNA發(fā)生周期性結(jié)合,提示動(dòng)物細(xì)胞中的MCM2,3,5可能是允許因子的一種。 研究表明,將MCM2,3,5突變后,確實(shí)能夠阻止復(fù)制起始;而將“允許因子”抑制物突變后,可導(dǎo)致產(chǎn)生過(guò)量的DNA。,2.蛋白激酶的調(diào)控 兩種蛋白激酶,CDK(cyclin dependent kina
43、ses) 和Cdc7-Dbf4激酶,是真核生物DNA復(fù)制起始絕對(duì)必需的。這兩種激酶在起始反應(yīng)的不同階段發(fā)揮作用,并有不同的底物。 近來(lái)用有爪蟾蜍和芽殖酵母研究表明,還有蛋白激酶A和蛋白磷酸酶2A等也參與復(fù)制的起始。 在真核生物細(xì)胞每個(gè)細(xì)胞周期中,基因組復(fù)制且僅復(fù)制一次,這是在精確調(diào)控機(jī)制下完成。 該機(jī)制使細(xì)胞有兩種狀態(tài):一種是多種參與DNA復(fù)制的蛋白組裝成復(fù)制起始復(fù)合物,但不啟動(dòng)復(fù)制起始;二是CDK激活復(fù)制起始復(fù)合物,使細(xì)胞進(jìn)入復(fù)制起始狀態(tài)。,CDK在細(xì)胞從G1期向S期過(guò)渡期間,具有很高活性。該活性不僅可以啟動(dòng)復(fù)制起始,還可以防止同一細(xì)胞周期中已復(fù)制基因組DNA再次發(fā)生復(fù)制。 這都是C
44、DK對(duì)參與DNA復(fù)制起始的蛋白進(jìn)行磷酸化的結(jié)果。這種由CDK驅(qū)動(dòng)的“復(fù)制開關(guān)”為基因組DNA在同一細(xì)胞周期復(fù)制且僅復(fù)制一次提供了一種完美的機(jī)制。,首先證明CDK能夠防止DNA復(fù)制在同一細(xì)胞周期再次發(fā)生的證據(jù)來(lái)自對(duì)裂殖酵母遺傳學(xué)的實(shí)驗(yàn)研究。 基因敲除Cdc13(一種M期細(xì)胞周期性蛋白)的基因后,細(xì)胞可以連續(xù)發(fā)生多次DNA復(fù)制,但不能進(jìn)行細(xì)胞分裂。 在裂殖酵母中表達(dá)CDK的抑制物,可以獲得同樣的結(jié)果。M期細(xì)胞周期性蛋白缺陷型的果蠅,在同一細(xì)胞周期中,也能夠發(fā)生多次DNA的復(fù)制。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果都提示,CDK可以抑制DNA復(fù)制在G2和M期的發(fā)生。,在啤酒酵母中,CDK可通過(guò)抑制復(fù)制起始復(fù)合物的組裝抑
45、制 復(fù)制重復(fù)發(fā)生。 在G2/M期抑制CDK活性,發(fā)現(xiàn)DNaseI足跡具有DNA復(fù)制起始前狀態(tài)的特征。相反,如果在G1期表達(dá)B型細(xì)胞周期性蛋白Clb2,DNA復(fù)制起始被抑制,DNaseI足跡不具有DNA復(fù)制起始前狀態(tài)。 染色體交聯(lián)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),G2/M期高CDK活性可阻止MCMp與DNA復(fù)制起始位點(diǎn)相互作用。與這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,蟾蜍Cdk2-cyclinE可以抑制Mcm3與染色體復(fù)制起始位點(diǎn)相結(jié)合。 這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明CDK可抑制復(fù)制起始復(fù)合物在復(fù)制起始位點(diǎn)上組裝。,為了認(rèn)識(shí)CDK防止復(fù)制重復(fù)發(fā)生機(jī)制,尋找CDK關(guān)鍵底物很 有必要。CDK可抑制MCMp蛋白組裝,這提示CDK參與MCMp組裝的蛋白
46、,包括ORC、Cdc6/Cdc18以及MCMp本身都可能是CDK的潛在底物。到目前為止,有直接證據(jù)表明Cdc6和Cdc18是CDK底物。 Cdc6/Cdc18在復(fù)制起始復(fù)合物組裝過(guò)程中起重要作用。它們可與復(fù)制起始位點(diǎn)相互作用,并且是MCMp結(jié)合到復(fù)制起始位點(diǎn)必需的。 在裂殖酵母中高水平表達(dá)Cdc18可引起DNA復(fù)制的重復(fù)發(fā)生。CDK對(duì)Cdc6/Cdc18磷酸化后,可負(fù)調(diào)節(jié)它們的功能,防止在同一細(xì)胞周期中復(fù)制的再次發(fā)生。,這種作用首先在裂殖酵母實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)。Cdc18N末端含有CDK的磷酸化位點(diǎn),將它們?nèi)笔蛔兒?,可發(fā)現(xiàn): 1.在體內(nèi)Cdc18突變體比野生型Cdc18穩(wěn)定得多 在裂殖酵母體內(nèi)
47、,Cdc18很不穩(wěn)定,細(xì)胞進(jìn)入S期后,被很快降解。CDK磷酸化位點(diǎn)缺失突變后,Cdc18半衰期可從大約5min延長(zhǎng)至60min。 后來(lái)研究發(fā)現(xiàn),CDK將Cdc18磷酸化后,可使其在蛋白酶體中被遍在蛋白化作用,并降解。 2.細(xì)胞基因組復(fù)制可以多次發(fā)生 這與高表達(dá)Cdc18的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致;在碑酒酵母中,用Cdc6進(jìn)行實(shí)驗(yàn),可取得同樣結(jié)果。 由此可見,CDK對(duì)Cdc6/Cdc18的磷酸化可防止細(xì)胞染色體復(fù)制重復(fù)發(fā)生。,在人體中,CDK對(duì)Cdc6磷酸化也可抑制Cdc6的功能, 但機(jī)制與酵母中不同。在人體細(xì)胞,整個(gè)細(xì)胞周期中Cdc6都存在,但Cdc6在細(xì)胞內(nèi)的分布隨著細(xì)胞周期發(fā)生變化。 Cdc6
48、在G1期,位于細(xì)胞核內(nèi),在S期開始后,它通過(guò)Crm1依賴的機(jī)制轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞漿中。該過(guò)程和Cdc6磷酸化有關(guān),因?yàn)槿笔端磷酸化位點(diǎn)的突變體在整個(gè)細(xì)胞周期中都在細(xì)胞核中。 在體外,Cdc6可以被Cdk2-cyclinA和Cdk2-cyclinE磷酸化,但在體內(nèi)Cdc6可能更偏向于結(jié)合cyclinA。因?yàn)樵谌思?xì)胞核糖體表達(dá)cyclinA可以引起Cdc6快速?gòu)募?xì)胞核進(jìn)入細(xì)胞漿。 CDK依賴的Cdc6重新分布是防止人基因組復(fù)制重復(fù)發(fā)生的機(jī)制之一。,CDK磷酸化MCMp,防止復(fù)制重復(fù)起始。CDK磷酸化Cdc6/ Cdc18對(duì)防止復(fù)制重復(fù)起始很重要,但不是唯一機(jī)制。CDK使MCMp磷酸化后,可抑制MCMp
49、再組裝到復(fù)制起點(diǎn)。 研究在MCMp缺失磷酸化位點(diǎn)后,細(xì)胞是否出現(xiàn)基因組重復(fù)復(fù)制的現(xiàn)象具有重要意義。,三、DNA復(fù)制的檢查機(jī)制 檢查點(diǎn)機(jī)制(checkpoint mechanism)也是調(diào)控DNA復(fù)制的重要機(jī)制之一。當(dāng)基因組損傷或DNA合成受阻,干擾基因組正常復(fù)制過(guò)程時(shí),檢查點(diǎn)機(jī)制被激活。 起初,檢查點(diǎn)是用來(lái)描述細(xì)胞監(jiān)控的機(jī)制,這種機(jī)制可以延遲細(xì)胞分裂過(guò)程,直至DNA復(fù)制完成或損傷DNA被修復(fù),從而協(xié)調(diào)細(xì)胞周期與DNA復(fù)制的正常完成。,隨著對(duì)檢查點(diǎn)機(jī)制的深入了解,發(fā)現(xiàn)檢查點(diǎn)機(jī)制在 基因組受損時(shí),不僅僅是引起細(xì)胞周期的延遲。 比如,在啤酒酵母中,檢查點(diǎn)機(jī)制可引起許多基因轉(zhuǎn)錄,基因產(chǎn)物在DN
50、A損傷修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮作用。 因此可給檢查點(diǎn)一個(gè)比較廣泛的定義:檢查點(diǎn)機(jī)制可以識(shí)別DNA損傷或DNA復(fù)制的阻斷,通過(guò)復(fù)雜的多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑維持基因組的完整性。,2000年7月 Cell 報(bào)道,發(fā)現(xiàn)G1期的檢查點(diǎn)是一個(gè)復(fù)雜過(guò)程。正在分裂的細(xì)胞存在多個(gè)檢查點(diǎn),用來(lái)不讓受損DNA進(jìn)行復(fù)制及確保受損的染色體不發(fā)生凝集。G1期細(xì)胞 對(duì)DNA損傷有兩步反應(yīng),首先是G1期快速停止,此過(guò)程不需p53; 然后是依賴于p53對(duì)細(xì)胞周期停止的維持。 原來(lái)一直認(rèn)為當(dāng)細(xì)胞受損傷時(shí),首先是p53被ATM激酶磷酸化,再促進(jìn)多個(gè)基因轉(zhuǎn)錄激活,如p21cip1, p21抑制cyclin E/CDK2復(fù)合物,進(jìn)行G1期的抑制,但
51、此過(guò)程通常要8個(gè)小時(shí)才能發(fā)生,而離子射線誘導(dǎo)的G1期停止幾乎是立即完成的。 為了解開這個(gè)謎團(tuán),Agami,R等人構(gòu)建了一個(gè)p53失活的細(xì)胞系,進(jìn)行離子輻射刺激后,發(fā)現(xiàn)cyclinD1下調(diào),這種下調(diào)是由cyclinD1本身的RXXL引起。在受到刺激后,cyclinD1被APC降解,釋放出p21, p21即對(duì)cyclinE/CDK2復(fù)合物產(chǎn)生抑制,完成了早期快速抑制過(guò)程,而p53介導(dǎo)的p21上升看來(lái)是起后期維持作用。這個(gè)問題得到解決,但在檢測(cè)DNA損傷的反應(yīng)中,可能還有許多不為人知的事。,,下面主要對(duì)兩方面的檢查點(diǎn)機(jī)制進(jìn)行探討: 1.DNA合成抑制所激活的檢查點(diǎn)機(jī)制。 2.細(xì)胞S期輻射或化學(xué)物質(zhì)所
52、致DNA損傷激活的檢查點(diǎn)機(jī)制。 人們對(duì)檢查點(diǎn)機(jī)制的了解主要是來(lái)自酵母的遺傳學(xué)和生物化學(xué)試驗(yàn)。隨著研究逐步深入,人們發(fā)現(xiàn)許多參與檢查點(diǎn)機(jī)制的蛋白在高等真核生物中是保守的。 在哺乳動(dòng)物體內(nèi),如果檢查機(jī)制不發(fā)揮作用,基因組會(huì)變得不穩(wěn)定,而且增加癌的易感性。 先介紹兩種酵母系統(tǒng)檢查點(diǎn)機(jī)制的功能,然后再簡(jiǎn)單介紹一下哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的相關(guān)內(nèi)容。,1.DNA合成被抑制所激活的檢查點(diǎn)機(jī)制 羥基脲存在條件下,細(xì)胞進(jìn)入S期后,在大多數(shù)復(fù)制起始位點(diǎn)上都可發(fā)生DNA復(fù)制起始,但由于核苷酸前體缺乏,復(fù)制叉在模板鏈停止移動(dòng)。這種情況可激活S期的檢查點(diǎn)機(jī)制。 檢查點(diǎn)機(jī)制激活后,可對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生多種效應(yīng):a.延遲分裂期染
53、色體的分離;b.穩(wěn)定復(fù)制出不完整的染色體,以保證核苷酸前體不缺乏時(shí),能夠使染色體復(fù)制正常完成;c.引起多種基因(例如核糖核苷酸還原酶基因)的表達(dá),基因產(chǎn)物有助于恢復(fù)復(fù)制叉正常運(yùn)動(dòng)。,在裂殖酵母體內(nèi),rad1、rad3、rad9、rad17、rad26和hus1等6種基因的編碼產(chǎn)物可能參與上述多種效應(yīng)的產(chǎn)生。 在這6種基因中,不管哪種基因突變后,細(xì)胞對(duì)羥基脲高度敏感,DNA復(fù)制沒完成就進(jìn)入細(xì)胞分裂期。 在這些Rad蛋白中,SpRad3/ScMec1是PI3k激酶超家族的成員,該家族中還有DNA-PK(DNA-dependent protein kinase)、ATM(ataxia telang
54、ectasia mutated:共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張誘導(dǎo))蛋白和ATR(ataxia telangectasia-and Rad3-related)蛋白等。,在這個(gè)蛋白激酶家族中,人們對(duì)DNA-PK了解得最清楚。DNA-PK是一種三亞基的絲/蘇氨酸蛋白酶,是雙鏈DNA斷裂修復(fù)所必需。將DNA-PK與DNA斷裂處結(jié)合后,DNA-PK激酶的活性可明顯提高。 以此類推,SpRad3/ScMec1可能在酵母中直接參與停止復(fù)制叉的運(yùn)動(dòng)和DNA損傷的識(shí)別。 在哺乳動(dòng)物中,ATM和ATR參與對(duì)DNA損傷的反應(yīng),但它們的酶學(xué)性質(zhì)還不是很清楚。,缺失DNA聚合酶的裂殖酵母細(xì)胞,在羥基脲存在條件下, 發(fā)生細(xì)胞分
55、裂,但染色體DNA復(fù)制不完整。 Cut5基因突變的細(xì)胞,也呈現(xiàn)同樣表型,Cut5基因的編碼產(chǎn)物參與DNA復(fù)制,但具體功能不清楚。 遺傳實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)4個(gè)編碼產(chǎn)物參與復(fù)制的基因POL2、DPB11、ORC1、RFC5,是檢查點(diǎn)機(jī)制所必需。,POL2基因編碼的DNA聚合酶,它可結(jié)合在復(fù)制叉處,監(jiān)視復(fù)制是否中斷。DNA聚合酶有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域,具有不同的功能;其N端具有聚合酶和核酸外切酶活性,該結(jié)構(gòu)域不是酵母生存所必需的。 研究發(fā)現(xiàn),其C端是細(xì)胞生存所必需的。C端結(jié)構(gòu)域突變不僅降低DNA復(fù)制效率,而且使檢查點(diǎn)機(jī)制的功能不能正常發(fā)揮。 在此情況下,羥基脲抑制DNA復(fù)制,引起核糖核苷酸還原酶基因不能表達(dá)以及細(xì)
56、胞周期的延遲。將DPB11、ORC1和RFC5基因突變后,啤酒酵母也呈現(xiàn)出同樣的表型。 這三個(gè)基因的編碼產(chǎn)物都是啤酒酵母DNA復(fù)制需要的。前兩者編碼產(chǎn)物的功能還不清楚,RFC的基因編碼產(chǎn)物是鎖狀輸入器復(fù)合體的亞基之一。,裂殖酵母Cds1(SpCds1)和啤酒酵母中的同源物Rad53都是絲/蘇氨酸激酶,可將某些參與檢查點(diǎn)機(jī)制的蛋白特異磷酸化。 在體內(nèi)有羥基脲的情況下,SpCds1和Rad53可被磷酸化和激活,這種激活需要SpRad53和和啤酒酵母Mec1(ScMec1)以及其它參與檢查點(diǎn)機(jī)制的蛋白。 雖然遺傳學(xué)和生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持SpRad3/ScMec1在體內(nèi)通過(guò)磷酸化作用直接激活SpC
57、ds1/ScRad53,但還有待于進(jìn)一步確證。,為了更清楚地在分子水平了解S期檢查點(diǎn)機(jī)制,需要尋找SpCds1/ScRad53激酶的關(guān)鍵底物。 近幾年來(lái)人們已在這方面取得了較大的進(jìn)展,在裂殖酵母中,檢查點(diǎn)機(jī)制通過(guò)調(diào)節(jié)SpCdc2-cyclinB的磷酸化來(lái)阻止細(xì)胞的分裂。 SpWee1和SpMik1兩種激酶將SpCdc2的15位酪氨酸磷酸化后,可恢復(fù)SpCdc2-cyclinB的活性。,Cds1可能可對(duì)這些Cdc2調(diào)節(jié)物的活性進(jìn)行調(diào)節(jié)。 在體外,SpCds1確實(shí)可以將SpWee1和SpCdc25磷酸化。將SpCds1對(duì)SpCdc25的磷酸化位點(diǎn)突變后,可以引起S期檢查點(diǎn)機(jī)制不能完全發(fā)揮作用。
58、這提示在體內(nèi)SpCdc25可能是SpCds1主要底物之一。 目前,SpCds1與SpCdc25相互作用的精確機(jī)制還不清楚。有研究表明,在體外,SpCds1對(duì)SpCdc25磷酸化后,可以直接抑制SpCdc25磷酸酶活性。也有研究表明,磷酸化的SpCdc25具有SpRad24的結(jié)合位點(diǎn)。在結(jié)合SpRad24后,SpCdc25可以被從細(xì)胞核中清除。 有趣的是,在裂殖酵母中,同一SpCdc25磷酸化位點(diǎn)也可以被蛋白激酶SpChk1磷酸化。在缺乏SpCds1的細(xì)胞中SpChk1可以被激活,并阻止細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞分裂。在正常細(xì)胞中,SpChk1的激酶活性在檢查點(diǎn)機(jī)制中起的作用很小。,SpCds1除了可以延長(zhǎng)
59、細(xì)胞周期的進(jìn)行,在使細(xì)胞再?gòu)腟期進(jìn)行正常細(xì)胞分裂的過(guò)程中也是必需。 在正常細(xì)胞中,羥基脲的作用是可逆的,在去除羥基脲后,細(xì)胞可以恢復(fù)正常細(xì)胞分裂活動(dòng)。羥基脲使缺失SpCds1和ScRad53的酵母細(xì)胞都失去生存能力。這可能和這些細(xì)胞不能完成DNA復(fù)制有關(guān)。 SpDfp1是Hsk1蛋白激酶的調(diào)節(jié)亞基。在HU處理的條件下,SpDfp1以SpCds1依賴的方式被磷酸化。而Hsk1-Dfp1是裂殖酵母DNA復(fù)制起始所必需的。,該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Hsk1在依賴Cds1的檢查點(diǎn)機(jī)制中也發(fā)揮了一定作用。 在裂殖酵母中使細(xì)胞能夠從S期阻斷中有效恢復(fù)正常的另一個(gè)基因是rqh+,它編碼一種與E.coli 的Re
60、cQ相似的解旋酶。 在DNA復(fù)制過(guò)程中,與DNA被UV射線損傷時(shí),rqh1對(duì)細(xì)胞的存活起重要作用。目前,rqh+發(fā)揮作用的機(jī)制還不清楚。,2.S期DNA損傷激活的檢查點(diǎn)機(jī)制 用放射線或DNA烷化劑對(duì)S期酵母細(xì)胞進(jìn)行處理后,DNA復(fù)制變慢,這并不是由于DNA損傷影響復(fù)制叉移動(dòng)那么簡(jiǎn)單。因?yàn)閷⑴c檢查點(diǎn)機(jī)制的基因突變后,DNA復(fù)制可以恢復(fù)正常。 因此,DNA損傷延長(zhǎng)細(xì)胞周期S期是一個(gè)主動(dòng)的過(guò)程,使細(xì)胞更好地耐受或修復(fù)DNA的損傷。,裂殖酵母S期DNA損傷激活的檢查點(diǎn)機(jī)制關(guān)鍵步驟之一,也是SpCds1蛋白激酶的激活。 參與的基因包括rad1、rad3、rad9、rad17、rad26和hus1
61、。 S期DNA損傷可以特異地激活SpCds1,發(fā)生在細(xì)胞周期其它檢查點(diǎn)的DNA損傷,則激活SpChk1蛋白激酶。激活的SpCds1可以抑制SpChk1蛋白激酶。 在啤酒酵母,S期DNA損傷激活Rad53蛋白激酶依賴于POL2、DPB11、ORC1和RFC5基因。,S期DNA損傷激活的檢查點(diǎn)機(jī)制可以通過(guò)抑制復(fù)制起始 或(和)復(fù)制延伸,使DNA復(fù)制變慢。DNA聚合酶/引物酶參與DNA復(fù)制延伸,并且可能參與S期DNA損傷所激活的檢查機(jī)制。 已有報(bào)道,將啤酒酵母引物酶基因PR11突變后,發(fā)現(xiàn)酵母表現(xiàn)出對(duì)DNA損傷物質(zhì)的高度敏感性,并不能延遲細(xì)胞S期的進(jìn)行。那么引物酶是ScRad53的上游分子還是下
62、游分子? 將PR11突變后,發(fā)現(xiàn)并不影響從DNA損傷到ScRad53磷酸化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。這提示引物酶在ScRad53的下游發(fā)揮作用。,DNA引物酶被ScRad53途徑修飾后,可使其在損傷DNA5端合成引物的能力降低,這是檢查點(diǎn)機(jī)制可以引起復(fù)制暫停的可能之一。有許多證據(jù)可以證明S期DNA損傷所激活的檢查點(diǎn)機(jī)制可使許多復(fù)制起點(diǎn)上的DNA復(fù)制起始。 用二維凝膠電泳對(duì)啤酒酵母的復(fù)制中間產(chǎn)物進(jìn)行分析后,發(fā)現(xiàn)S期DNA損傷可以選擇性抑制晚期復(fù)制起點(diǎn)的激活,且依賴于ScRad53。 有趣的是將正常細(xì)胞(不接觸DNA損傷物質(zhì))的ScRad53突變后,發(fā)現(xiàn)一些晚期復(fù)制起始位點(diǎn)上的復(fù)制起始可以被提前。,這提
63、示檢查點(diǎn)機(jī)制可能與正常細(xì)胞周期中復(fù)制的起始有關(guān)。比如,由于核苷酸的消耗,早期復(fù)制起始位點(diǎn)上的復(fù)制起始可能激活檢查點(diǎn)機(jī)制,并抑制晚期復(fù)制起始位點(diǎn)上DNA復(fù)制的起始。近來(lái)研究表明,檢查點(diǎn)機(jī)制激活的ScRad53可以抑制Cdc45組裝到晚期復(fù)制起始位點(diǎn)上。 Cdc7激酶也參與S期晚期復(fù)制起始復(fù)合物的激活,可能也是S期檢查點(diǎn)機(jī)制的作用點(diǎn)。因?yàn)镃dc7在裂殖酵母中的同源物Hsk1及其調(diào)節(jié)亞基Dfp1在體內(nèi)的磷酸化是依賴SpCds1。 在體外,純化的SpCds1可以直接磷酸化Dfp1。遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)和雙雜交試驗(yàn)也表明,在啤酒酵母中可以相互作用。,3.哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的檢查點(diǎn)機(jī)制 哺乳動(dòng)物細(xì)胞與酵母一樣,在
64、DNA損傷時(shí),可以激活檢查點(diǎn)機(jī)制,并抑制DNA的復(fù)制。在人體內(nèi),已發(fā)現(xiàn)了許多酵母檢查點(diǎn)蛋白的結(jié)構(gòu)同源物。 這提示檢查點(diǎn)途徑是比較保守的。 哺乳動(dòng)物細(xì)胞有幾種PI3k樣蛋白激酶與SpRad3/ScMec1同源,比如ATM、ATR、DNA-PK等。,2007年8月生物化學(xué)雜志報(bào)道科學(xué)家發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞蛋白質(zhì)調(diào)控新機(jī)制。干細(xì)胞中的Oct4蛋白質(zhì)起著調(diào)控作用,決定干細(xì)胞是繼續(xù)分化成其他特殊細(xì)胞,還是保持干細(xì)胞的多功能性。通過(guò)化學(xué)途徑可以改變Oct4蛋白質(zhì),從而決定干細(xì)胞的命運(yùn)。德國(guó)和美國(guó)科學(xué)家共同發(fā)現(xiàn)了一個(gè)Oct4蛋白新的調(diào)控機(jī)制,一種特殊的蛋白質(zhì)可以和干細(xì)胞標(biāo)記結(jié)合,從而延長(zhǎng)蛋白質(zhì)的生命和增強(qiáng)讀取基因
65、信息的功能。 他們認(rèn)為干細(xì)胞的多功能程度是有限的,它既可以發(fā)展成不同組織的細(xì)胞,也可以發(fā)展成腫瘤細(xì)胞,其發(fā)展方向在很大程度上受Oct4蛋白質(zhì)影響。在研究中發(fā)現(xiàn),Oct4能與基因中的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合,通過(guò)這種方式使干細(xì)胞保持其多能性,并使干細(xì)胞僅向一個(gè)方向發(fā)展??茖W(xué)家稱,Oct4可有不同的作用機(jī)制,在和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合期間,一些小分子的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的化學(xué)變化。研究表明,所謂的SUMO蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄因子有很強(qiáng)的結(jié)合傾向,并以此改變其功能。,他們的實(shí)驗(yàn)顯示,SUMO-1(4種SUMO蛋白的一種)可結(jié)合到Oct4蛋白上,從而延長(zhǎng)了Oct4的生命。他們把SUMO1和Oct4蛋白注入活性干細(xì)胞中,用顯微鏡觀察
66、熒光抗體來(lái)檢測(cè),發(fā)現(xiàn)這兩種蛋白質(zhì)分子互相結(jié)合在一起。研究人員分析了SUMO-1蛋白質(zhì)結(jié)合點(diǎn)的位置,有目的地使Oct4可能的結(jié)合點(diǎn)失效,人為地使118號(hào)賴氨酸作為結(jié)合點(diǎn)。由于這個(gè)點(diǎn)在DNA結(jié)合點(diǎn)附近,結(jié)果發(fā)現(xiàn),SUMO-1和Oct4的結(jié)合體能更加有效地結(jié)合到DNA上。 研究人員還發(fā)現(xiàn),Oct4和SUMO-1蛋白質(zhì)的結(jié)合體可以更好地操縱轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)因子,SUMO-1不僅改善Oct4蛋白質(zhì)功能,并且延長(zhǎng)Oct4的壽命。在兩種蛋白質(zhì)注入活細(xì)胞16小時(shí)后,結(jié)合蛋白質(zhì)形態(tài)比未結(jié)合形態(tài)多4倍。換言之,通過(guò)結(jié)合到Oct4上,SUMO-1調(diào)控干細(xì)胞內(nèi)Oct4的含量,并由此決定干細(xì)胞是向正常方向還是向腫瘤方向分化,這個(gè)發(fā)現(xiàn)很可能對(duì)腫瘤治療有所幫助,特別是對(duì)于高Oct4蛋白質(zhì)濃度造成的腫瘤。,第三節(jié) 基因突變和DNA損傷修復(fù) 遺傳和變異都是生物界普遍存在的自然現(xiàn)象。遺傳和變異的基礎(chǔ)都是DNA的堿基排列序列, 遺傳是DNA的堿基排列順序忠實(shí)地傳給下一代, 變異是DNA的堿基序列發(fā)生改變,且可以遺傳。 DNA損傷是某些因素作用下, DNA的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變, 阻礙DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄, DNA的這種變化稱DN
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