2、養(yǎng)微生物。,無菌技術(shù)的操作。,二、課題重點和難點：,三、技能目標：,（2）按培養(yǎng)基的物理形態(tài)分： 液體培養(yǎng)基 半固體培養(yǎng)基 固體培養(yǎng)基,一 基礎(chǔ)知識:,,（3）按培養(yǎng)基的功能分： 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 選擇培養(yǎng)基 鑒別培養(yǎng)基,（1）按培養(yǎng)基的化學成分分： 天然培養(yǎng)基 合成培養(yǎng)基 半合成培養(yǎng)基 閱讀課本分別說出它們的優(yōu)點、缺點。,培養(yǎng)基的種類,常用于工業(yè)生產(chǎn),常用于觀察微生物的運動、鑒定菌種,用于微生物的分離、計數(shù),常用于工業(yè)生產(chǎn),常用于分類、鑒定,在培養(yǎng)基中加入某種化學物質(zhì)，以抑制不需要的微生物的生長，促進所需要的微生物的生長。例如，在培養(yǎng)基中加入青霉素，以抑制細菌、放線菌的生長，從而分離到酵母菌和霉菌
3、。又如，在培養(yǎng)基中加入高濃度的食鹽可以抑制多種細菌的生長，但不影響金黃色葡萄球菌的生長。,根據(jù)微生物的代謝特點，在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學藥品配制而成，用以鑒別不同種類的微生物。例如，在培養(yǎng)基中加入伊紅和美藍，可以用來鑒別飲用水和乳制品中是否存在大腸桿菌等細菌：如果有大腸桿菌，其代謝產(chǎn)物就與伊紅和美藍結(jié)合，使菌落呈深紫色，并帶有金屬光澤。,選擇培養(yǎng)基,加入青霉素的培養(yǎng)基: 分離酵母菌、霉菌等真菌 加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基: 分離金黃色葡萄球菌 不加氮源的無氮培養(yǎng)基: 分離固氮菌 不加含碳有機物的無碳培養(yǎng)基: 分離自養(yǎng)型微生物 加入青霉素等抗生素的培養(yǎng)基: 分離導入了目
4、的基因的受體細胞 加入氨基喋呤、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基: 分離雜交瘤細胞,根據(jù)細胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。 合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助物質(zhì)。 優(yōu)點：標準化生產(chǎn)，組分和含量相對固定;成本低 缺點： 缺少某些成分，不能完全滿足體外細胞生長需要。,合成培養(yǎng)基:,天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。 優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好 缺點：來源受限;成分復雜，影響對某些實驗產(chǎn)物的提取和實驗結(jié)果的分析;易發(fā)生支原體污染;,天然培養(yǎng)基：,固體培養(yǎng)基：菌落,液體培養(yǎng)基：,表面生長,均勻混濁生長,沉淀生長,
5、半固體培養(yǎng)基：,無動力 有動力(彌散),,,(是否運動),培養(yǎng)基的配制原則：,目的要明確：根據(jù)培養(yǎng)的微生物種類、培養(yǎng)的目的等確定培養(yǎng)基的類型和配制量。 營養(yǎng)要協(xié)調(diào)：培養(yǎng)基中各種營養(yǎng)物質(zhì)的濃度和比例要適宜。例如：碳氮比41時，谷氨酸棒狀桿菌大量繁殖而產(chǎn)生谷氨酸少；碳氮比為31時，菌體繁殖受抑制而谷氨酸合成量大增。 pH要適宜：細菌培養(yǎng)基pH中性或偏堿性，霉菌培養(yǎng)基呈酸性。 細菌pH為：6.5-7.5； 放線菌pH為：7.5-8.5； 真菌pH為：5.0-6.0,微生物的五種營養(yǎng)要素,碳源,氮源（nitrogen source）,生長因子 微生物生長不可缺少的微量有機物質(zhì)叫生長因子。維生素 氨
6、基酸 堿 基,無機鹽（mineral salts）,水（wahtor）,凡能為微生物提供生長繁殖所需碳元素的營養(yǎng)物質(zhì)都稱為碳源 。,凡是能為微生物提供所需氮元素的營養(yǎng)物質(zhì)都稱為氮源。,無機C源：CO2、碳酸鹽，只能被自養(yǎng)微生物利用 有機C源：各種糖類，其次是有機酸、醇類、 脂類和烴類化合物,碳源種類,分子態(tài)氮：固氮微生物以分子氮為唯一氮源 無機態(tài)氮：硝酸鹽、銨鹽幾乎所有微生物能利用 有機態(tài)氮：蛋白質(zhì)及其降解產(chǎn)物 a實驗室常用牛肉膏、蛋白胨、酵母膏做氮源 b生產(chǎn)用玉米漿、豆餅、葵花餅、花生餅等,氮源種類,構(gòu)成微生物細胞的組成成分 調(diào)解微生物細胞的滲透壓， PH值和
7、氧化還原電 位 有些無機鹽如S、Fe還可做為自養(yǎng)微生物的能源 構(gòu)成酶活性基的組成成分，維持酶活性。Mg、Ca、K是多種酶的激活劑,無機鹽（mineral salts）,無機鹽功能,構(gòu)成微生物細胞以C、H、O、N、P、S六種元素為主，約占細胞干重的95以上； Ca、K 、Mg、Fe為大量元素，以無機鹽陽離子形式被吸收，配培養(yǎng)基要加磷酸鹽、硫酸鹽。 Zn、Ca、Mn、Co、Mo等微量元素，在微生物培養(yǎng)中有0.1PPM就可以了，自來水原料中已夠用，不需另加。,無機鹽種類,碳源、氮源、生長因子的比較,各種培養(yǎng)基的具體配方不同，但一般都包括哪些成分？ 答：不管哪種培養(yǎng)基，一般都含有水、碳源、和氮
8、源、 無機鹽等營養(yǎng)物質(zhì)。 注： 另外還需要滿足微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì),例如:生長因子(即細菌生長必需，而自身不能合成的化合物,如維生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧氣、二氧化碳、滲透壓等的要求。,二 無菌技術(shù)：無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。,1、煮沸消毒法:100煮沸5-6min 2、巴氏消毒法：70-75 下煮30min或 80 下煮15min 3、化學藥劑消毒法:用75%酒精、新潔爾滅等進行皮膚消毒;氯氣消毒水源 4、紫外線消毒 ,(1)常用消毒的方法：,1、灼燒滅菌: 2、干熱滅菌：160-170 下加熱1-2h。 3、高壓蒸氣滅菌：100kPa、
9、121 下維持15-30min.,(2)常用滅菌的方法：,無菌技術(shù)：,常識,1 無菌技術(shù)包括： （1）對實驗操作空間、操作者的衣著和手進行 清潔和消毒 ； （2）將培養(yǎng)器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進行 滅菌 ； （3）為避免周圍微生物污染，實驗操作應在 酒精燈火焰附近 旁進行； （4）避免已滅菌處理的材料用具與 周圍物品 相接觸。 2 消毒方法： （1）日常生活經(jīng)常用到的是 煮沸 消毒法； （2）對一些不耐高溫的液體，則使用 巴氏 消毒法（作簡要介紹）； （3）對接種室、接種箱或超凈工作臺首先噴灑 石炭酸或煤酚皂 等溶液以增強消毒效果，然后使用 紫外線 進行物理消毒。 （4）實驗操作者的雙手使
10、用 酒精 進行消毒； （5）飲水水源用 氯氣 進行消毒。 3滅菌方法： （1）接種環(huán)、接種針、試管口等使用 灼燒 滅菌法； （2）玻璃器皿、金屬用具等使用 干熱 滅菌法，所用器械是 干熱滅菌箱 ； （3）培養(yǎng)基、無菌水等使用 高壓蒸汽 滅菌法，所用器械是 高壓蒸汽滅菌鍋 。 （4）表面滅菌和空氣滅菌等使用 紫外線 滅菌法，所用器械是 紫外燈 。,1.無菌技術(shù)除了用來防止實驗室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？,2.請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。 （1） 培養(yǎng)細菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿 （2） 玻棒、試管、燒瓶和吸管 （3） 實驗操作者的雙手,答：
11、無菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。,答：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。,旁欄思考,3.微生物實驗室培養(yǎng)的基本操作程序,1、器具的滅菌 2、培養(yǎng)基的配制 3、培養(yǎng)基的滅菌 4、倒平板 5、微生物接種 6、恒溫箱中培養(yǎng) 7、菌種的保存,,三、實驗操作,1.制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（用于培養(yǎng)細菌）,1)配制：計算、稱量、熔化 2)調(diào)節(jié)pH：用3%的HCI/NaOH調(diào)節(jié) pH 70--- 72 3)分裝：分裝過程中注意不要使培養(yǎng)基沾 在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分裝三角燒瓶的量以不超過三角燒瓶容積的一半為宜。 4)包扎：,操作步驟:,5)滅菌: 將50ml培養(yǎng)
12、基用玻棒轉(zhuǎn)移至三角錐瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮紙，再放入高壓蒸氣滅菌鍋，在壓力為100kPa、溫度為121，滅菌1530min。 將培養(yǎng)皿用舊報紙包裹，放入干熱滅菌箱內(nèi)，在160170 下滅菌2h。 6)倒平板: 待培養(yǎng)基冷卻到50 左右時，在酒精燈附近倒平板。2d后觀察平板，無雜菌污染才可用來接種. 7)無菌檢查： 將滅菌的培養(yǎng)基放入37的溫室中培養(yǎng)2448小時，以檢查滅菌是否徹底。,倒平板:,,,,,菌種的保存,1)、臨時保藏：接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長成后置于4冰箱保存。 2)、長期保存：甘油冷凍管藏法,1).培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50 左右時，才能用來倒平板。你用什么辦
13、法來估計培養(yǎng)基的溫度？,問題討論,答：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進行倒平板了。,2).為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？,答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。,注意:,3).平板冷凝后，為什么要將平板倒置？,4).在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？,答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。,答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不
14、要用這個平板培養(yǎng)微生物。,2、純化大腸桿菌:,接種方法有： 平板劃線法和稀釋涂布平板法,平板劃線法:通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)畫線的操作,將聚集的菌鐘逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面. 在數(shù)次畫線后,可以分離到由一個細胞繁殖而來的肉眼可見的子細胞群體,這就是菌落.,微生物的接種技術(shù),菌落：,單個或少數(shù)細菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時，就會形成一個肉眼可見的，具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細胞群體，叫做菌落。 菌落是鑒定菌種的重要依據(jù)。,菌落,細菌的菌落特征因種而異,霉菌的菌落特征 因種而異,菌落,,,,,,,,,,,,,,,,,,劃線后 培養(yǎng)一段時間后,微生物的恒溫培養(yǎng),微生物的恒溫培養(yǎng),問題討
15、論,1).為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？,答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者。,2).在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？,答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。,3).在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是
16、從上一次劃線的末端開始劃線？,答：劃線后，線條末端細菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。,四、課題成果評價,（一）培養(yǎng)基的制作是否合格 如果未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫12 d后無菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。 （二）接種操作是否符合無菌要求 如果培養(yǎng)基上生長的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合大腸桿菌菌落的特點，則說明接種操作是符合要求的；如果培養(yǎng)基上出現(xiàn)了其他菌落，則說明接種過程中，無菌操作還未達到要求，需要分析原因，再次練習。 （三）是否進行了及時細致的觀
17、察與記錄 培養(yǎng)12 h與24 h后的大腸桿菌菌落的大小會有明顯不同，及時觀察記錄的同學會發(fā)現(xiàn)這一點，并能觀察到其他一些細微的變化。這一步的要求主要是培養(yǎng)學生良好的科學態(tài)度與習慣。,本課題知識小結(jié):,【典例解析】,例1關(guān)微生物營養(yǎng)物質(zhì)的敘述中，正確的是: A.是碳源的物質(zhì)不可能同時是氮源 B.凡碳源都提供能量 C.除水以外的無機物只提供無機鹽 D.無機氮源也能提供能量,解析：不同的微生物，所需營養(yǎng)物質(zhì)有較大差別，要針對微生物的具體情況分析。對于A、B選項，它的表達是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同時是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同時是能源，如葡萄糖；有的碳源同時是氮源
18、，也是能源，如蛋白胨。對于C選項，除水以外的無機物種類繁多，功能也多樣。如二氧化碳，可作為自養(yǎng)型微生物的碳源；NaHCO3，可作為自養(yǎng)型微生物的碳源和無機鹽；而NaCl則只能提供無機鹽。對于D選項，無機氮源提供能量的情況還是存在的，如NH3可為硝化細菌提供能量和氮源。,答案：D,例2下面對發(fā)酵工程中滅菌的理解不正確的是: A.防止雜菌污染 B.消滅雜菌 C.培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備都必須滅菌 D.滅菌必須在接種前,答案：B,解析：滅菌是微生物發(fā)酵過程的一個重要環(huán)節(jié)。A說的是滅菌的目的，因為發(fā)酵所用的菌種大多是單一的純種，整個發(fā)酵過程不能混入其他微生物（雜菌），所以是正確的；B是錯誤的，因為滅菌的
19、目的是防止雜菌污染，但實際操作中不可能只消滅雜菌，而是消滅全部微生物。C是正確的，因為與發(fā)酵有關(guān)的所有設(shè)備和物質(zhì)都要滅菌；發(fā)酵所用的微生物是滅菌后專門接種的，滅菌必須在接種前，如果接種后再滅菌就會把所接菌種也殺死。,例3右表是某微生物培養(yǎng)基成分，請據(jù)此回答： （1）右表培養(yǎng)基可培養(yǎng)的微生物類型是 （2）若不慎將過量NaCl加入培養(yǎng)基中。 如不想浪費此培養(yǎng)基，可再加入 . 用于培養(yǎng) 金黃色葡萄球菌.,自養(yǎng)型微生物,含碳有機物,（3）若除去成分，加入（CH2O），該培養(yǎng)基可用于培養(yǎng) 。 （4）表中營養(yǎng)成分共有 類。 （5）不論何種培養(yǎng)基，
20、在各種成分都溶化后分裝前，要進行的是 。 （6）右表中各成分重量確定的原則是 。 （7）若右表培養(yǎng)基用于菌種鑒定，應該增加的成分是 。,固氮微生物,3,調(diào)整pH,依微生物的生長需要確定,瓊脂（或凝固劑）,解析： 對于一個培養(yǎng)基，它能培養(yǎng)何種微生物，要看它的化學成分。當然這只適用于合成培養(yǎng)基，如果是一個天然培養(yǎng)基就不能從培養(yǎng)基的成分上區(qū)分它是培養(yǎng)何種微生物的。分析化學成分要從營養(yǎng)物質(zhì)的類型出發(fā)。右表中的營養(yǎng)物質(zhì)有水、無機鹽、氮源三類，缺乏碳源和特殊營養(yǎng)物質(zhì)。對特殊營養(yǎng)物質(zhì)，有的微生物是不需要的，但沒有微生物是不需要碳源的。該培養(yǎng)基中沒有碳源，說明培養(yǎng)的微生物是從空氣中獲得碳源的，即可培養(yǎng)的微生物就是自養(yǎng)型微生物了。該培養(yǎng)基中加入了過量食鹽，就可以成為金黃色葡萄球菌鑒別培養(yǎng)基，但金黃色葡萄球菌是異養(yǎng)型微生物，這個培養(yǎng)基就還需要加入有機碳源。該培養(yǎng)基若加入（CH2O），培養(yǎng)基中就有了碳源，但除去成分，卻使培養(yǎng)基中沒有了氮源，這時就只能用于培養(yǎng)固氮微生物了。對于菌種鑒定，往往用的是固體培養(yǎng)基，而表中沒有凝固劑，需要加入常見的凝固劑瓊脂。,謝謝大家,
高中生物選修1微生物的培養(yǎng)與應用.ppt
