分光光度法血糖實(shí)習(xí)ppt課件

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p31實(shí)驗(yàn)四 分光光度技術(shù)與 葡萄糖氧化酶法測(cè)定血糖,1,一、分光光度法,分光光度法是根據(jù)不同物質(zhì)對(duì)于不同 波長(zhǎng)的光波具有選擇性吸收的光學(xué)特性，建立起來(lái)的分析方法。,（一）分光光度法的依據(jù),2,,,,I0,It,溶液,當(dāng)一定波長(zhǎng)的光線通過(guò)某種透明介質(zhì)時(shí)， 其中一部分光可透過(guò)，一部分光被吸收，這種某種溶液對(duì)一定波長(zhǎng)的光的吸收特性可用于該物質(zhì)的定性和定量分析。,3,分光光度計(jì)可獲得單色光,分光光度計(jì)利用棱鏡或光柵取得波長(zhǎng)范圍 為幾個(gè)nm甚至更窄的單色光。,4,測(cè)定的時(shí)候需選擇不同物質(zhì) 最大吸收峰所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng),,,波長(zhǎng)（nm ）,,光 吸 收 值,,最大吸收峰,5,分光光度計(jì)的優(yōu)點(diǎn),分光光度法的靈敏度、準(zhǔn)確度及選擇性 都很高，是一種最常用的靈敏、精確、 快速和簡(jiǎn)便的分析方法。,6,不同分光光度計(jì)的波長(zhǎng)范圍,紫外光(200-400nm) 可見(jiàn)光(400-760nm) 紅外光(760nm-30μm),7,（二）分光光度法原理,Lambert-beer定律，該定律闡明了溶液對(duì)單色光吸收的多少與溶液濃度及液層厚度的乘積成正比關(guān)系。,8,I0,It,lg,,：光密度（O.D.），或稱吸光度（A）,I0,：入射光強(qiáng)度,It,：透過(guò)光強(qiáng)度,K,：吸光系數(shù)，它與該物質(zhì)吸收光能力有關(guān),9,（三）分光光度法計(jì)算待測(cè)溶液濃度的方法,1、利用標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定溶液的濃度,10,2、利用標(biāo)準(zhǔn)曲線求得待測(cè)溶液的濃度,標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作： 先配制一系列已知不同濃度的測(cè)定物標(biāo)準(zhǔn)溶液，按測(cè)定管顯色，分別讀取各管光密度，以各管光密度為縱坐標(biāo)，各管濃度為橫坐標(biāo)，作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線。,11,,濃度,,吸 光 度,,以測(cè)定管的光密度從標(biāo)準(zhǔn) 曲線上可求得測(cè)定物濃度,12,（四）分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu),1、光源 2、單色光器 3、吸收杯（比色杯） 4、檢流計(jì)（測(cè)光系統(tǒng)）,13,752型分光光度計(jì),1）A/T/C/F切換鍵 2）SD鍵——具2個(gè)功能。傳輸數(shù)據(jù)；確認(rèn)當(dāng)前的F值。 3）▽/0%——調(diào)T為000.0。 4)△/100%——調(diào)T 為100.0。轉(zhuǎn)換至A時(shí)，按鍵后顯示0.000。,14,（五）操作規(guī)程,1. 插上電源，打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)預(yù)熱30min。 2. 將波長(zhǎng)旋鈕旋至所需波長(zhǎng)。 3. 將樣品倒入比色皿放入比色皿架，空白管進(jìn)入光路，按A/T/C/F鍵至光標(biāo)于T位，開(kāi)蓋按▽/0%鍵使讀數(shù)顯示000.0。關(guān)蓋，再按△/100%鍵使讀數(shù)顯示100.0。按A/T/C/F鍵至光標(biāo)于A位，再按△/100%顯示0.000。拉出樣品管進(jìn)入光路讀A。 4. 測(cè)定結(jié)束打開(kāi)樣品室蓋。 5. 取出比色皿清洗干凈后用蒸餾水沖洗并倒扣在粗濾紙上晾干。,15,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解葡萄糖氧化酶法測(cè)定血糖的基本原理。 掌握酶法測(cè)定血糖的實(shí)驗(yàn)方法 熟悉分光光度計(jì)的使用。,P57二、葡萄糖氧化酶法測(cè)定血糖,16,實(shí)驗(yàn)原理：,,葡萄糖＋O2+H2O GOD 葡萄糖酸內(nèi)酯＋Ｈ2O2 2Ｈ2O2 + 4-氨基安替比林+酚 POD 紅色醌類化合物 + Ｈ2O +O2,,用分光光度法將待測(cè)溶液與同樣處理的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液比色，求待測(cè)血糖濃度。,17,儀器和藥品：,血清、血糖試劑盒 752可見(jiàn)紫外分光光度計(jì)。,18,基本操作,取三支試管，編號(hào)，下表加樣計(jì)算血糖濃度,19,吸量管的使用,拿吸量管正確姿勢(shì) 取液姿勢(shì) 卸放姿勢(shì),,20,微量取樣器的操作,調(diào)至所需體積值； 吸：垂直持取樣器用大拇指按至第一檔；將吸頭插入溶液松開(kāi)大拇指，液面上升； 放：移出液面，按至第一檔繼續(xù)按至第二檔以排空液體。 注意：移取另一樣品時(shí)， 更換新吸頭。,21,計(jì)算公式,測(cè)定管吸光度值,標(biāo)準(zhǔn)管吸光度值,葡萄糖含量(mg/dL)=,,×100,參考數(shù)據(jù)： A測(cè)=0.217，A標(biāo)=0.258， 葡萄糖含量=84mg/dl,22,思考題,試分析影響本試驗(yàn)的因素有哪些？ 操作分光光度計(jì)時(shí)要注意哪些關(guān)鍵點(diǎn)？,23,