《6月11日 免疫共沉淀》由會(huì)員分享,可在線閱讀,更多相關(guān)《6月11日 免疫共沉淀(12頁(yè)珍藏版)》請(qǐng)?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。
1、免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。 其原理是:當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí),完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來(lái)。如果用蛋白質(zhì)x的抗體免疫沉淀x,那么與x在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)y也能沉淀下來(lái)。這種方法常用于測(cè)定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合;也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。原理原理優(yōu)點(diǎn)相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的,處于天然狀態(tài);蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的,可以避免人為的影響;可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白
2、復(fù)合物。缺點(diǎn)可能檢測(cè)不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合,而可能有第三者在中間起橋梁作用; 如用western blot檢驗(yàn),必須在實(shí)驗(yàn)前預(yù)測(cè)目的蛋白是什么,以選擇最后檢測(cè)的抗體,若預(yù)測(cè)不正確,實(shí)驗(yàn)就得不到結(jié)果。實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵 實(shí)驗(yàn)最需要注意點(diǎn)就是抗體的性質(zhì)??贵w不同和抗原結(jié)合能力也不同,免染能結(jié)合未必能用在IP反應(yīng)。建議仔細(xì)檢查抗體的說(shuō)明書。特別是多抗的特異性是問(wèn)題。 為防止蛋白的分解,修飾,溶解抗原的緩沖液必須加蛋白酶抑制劑,低溫下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 考慮抗體/緩沖液的比例。抗體過(guò)少就不能檢出抗原,過(guò)多則就不能沉降在beads上,殘存在上清。緩沖劑太少則不
3、能溶解抗原,過(guò)多則抗原被稀釋。Co-IP工作示意圖工作示意圖Co-immunoprecipitationbindingwashelutionYYYYY利用western blot 確定捕獲蛋白通過(guò)質(zhì)譜確定捕獲的蛋白通過(guò)質(zhì)譜確定捕獲的蛋白收獲細(xì)胞,加入適量細(xì)胞裂解緩沖液(含蛋白酶抑制劑),冰上裂解30min, 細(xì)胞裂解液于4c, 最大轉(zhuǎn)速離心30 min后取上清;取少量裂解液以備western blot分析,剩余裂解液加1g相應(yīng)的抗體加入到細(xì)胞裂解液,4c緩慢搖晃孵育過(guò)夜;取10l protein a 瓊脂糖珠,用適量裂解緩沖液洗3 次,每次3,000 rpm離心3 min;將預(yù)處理過(guò)的10l
4、protein a 瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過(guò)夜的細(xì)胞裂解液中4c緩慢搖晃孵育2-4h,使抗體與protein a瓊脂糖珠偶連;免疫沉淀反應(yīng)后,在4c 以3,000 rpm 速度離心3 min,將瓊脂糖珠離心至管底;將上清小心吸去,瓊脂糖珠用1ml裂解緩沖液洗34次;最后加入15l的2sds 上樣緩沖液,沸水煮5分鐘;sds-page, western blotting或質(zhì)譜儀分析。實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟揚(yáng)州大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生物化學(xué)精品課程實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng) (1)細(xì)胞裂解采用溫和的裂解條件,不能破壞細(xì)胞內(nèi)存在的所有蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用,多采用非離子變性劑(np40或triton x-100)。每種
5、細(xì)胞的裂解條件是不一樣的,通過(guò)經(jīng)驗(yàn)確定。不能用高濃度的變性劑(0.2 sds),細(xì)胞裂解液中要加各種酶抑制劑,如商品化的cocktailer。 (2)使用明確的抗體,可以將幾種抗體共同使用 (3)使用對(duì)照抗體: 單克隆抗體:正常小鼠的igg或另一類單抗 兔多克隆抗體:正常兔igg (4) 確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的,而并非外源非特異蛋白,單克隆抗體的使用有助于避免污染的發(fā)生; (5) 要確??贵w的特異性,即在不表達(dá)抗原的細(xì)胞溶解物中添加抗體后不會(huì)引起共沉淀; (6) 確定蛋白間的相互作用是發(fā)生在細(xì)胞中,而不是由于細(xì)胞的溶解才發(fā)生的,這需要進(jìn)行蛋白質(zhì)的定位來(lái)確定。12結(jié)束語(yǔ)結(jié)束語(yǔ)