高中生物《細(xì)胞凋亡》課件4（61張PPT）（中圖版必修1）

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歡迎進(jìn)入生物課堂 細(xì)胞凋亡 APOPTOSIS 一 細(xì)胞凋亡的研究歷史 1 凋亡概念的形成和形態(tài)學(xué)的研究 1972 1972年Kerr等在英國(guó)癌癥雜志發(fā)表論文 首次提出細(xì)胞凋亡 apotosis 的概念 宣告了對(duì)細(xì)胞凋亡的真正探索的開(kāi)始 2 DNA的降解和內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的參與 1987 3 蛋白質(zhì)水解酶活化的研究 1995 4 細(xì)胞膜的變化 1997 5 線粒體的變化和分子生物學(xué)的研究 1998 1 相關(guān)基因及調(diào)控2 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)3 各種分子及其相互作用及相互關(guān)系4 疾病機(jī)制的闡明 以及新療法的探索及問(wèn)世 二 概念細(xì)胞凋亡是能量依賴(lài)的細(xì)胞內(nèi)死亡程序活化而致的細(xì)胞自殺 由基因控制的細(xì)胞自主有序的主動(dòng)死亡過(guò)程 細(xì)胞程序性死亡 programmedcelldeath PCD PCD最初是1956年發(fā)育生物學(xué)中提出的概念 是個(gè)功能性概念 強(qiáng)調(diào)的是其分子生物學(xué)和生理功能 一般指生理性細(xì)胞死亡 描述在一個(gè)多細(xì)胞生物體中某些細(xì)胞死亡是個(gè)體發(fā)育中的一個(gè)預(yù)定的 并受到嚴(yán)格程序控制的正常組成部分 細(xì)胞凋亡與壞死的區(qū)別 細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死的區(qū)別特征細(xì)胞凋亡細(xì)胞壞死誘導(dǎo)因素生理及弱刺激強(qiáng)烈刺激受累范圍單個(gè)細(xì)胞丟失成群細(xì)胞死亡膜完整性保持到晚期早期即喪失細(xì)胞體積減少 固縮增大腫脹染色質(zhì)凝聚成半月形稀疏成網(wǎng)狀細(xì)胞器無(wú)明顯變化腫張破壞溶酶體保持完整破壞外溢細(xì)胞形狀形成凋亡小體破裂成碎片基因組DNA有控降解隨機(jī)降解大分子合成一般需要不需要基因調(diào)控有無(wú)后果不引起炎癥反應(yīng)引起炎癥反應(yīng)意義生理死亡方式病理死亡方式 三 細(xì)胞凋亡的生物學(xué)特征 形態(tài)學(xué)變化生物化學(xué)變化DNA片段化大分子的合成tTG 組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶 的積累并達(dá)到較高的水平 細(xì)胞凋亡的形態(tài)特征 1 凋亡的起始 微絨毛的消失 細(xì)胞間接觸的消失 與周?chē)募?xì)胞脫離 細(xì)胞質(zhì)中 線拉體大體完整 染色質(zhì)固縮 2 細(xì)胞質(zhì)密度增加 線粒體膜電位消失 通透性改變 釋放細(xì)胞色素C到胞漿 膜內(nèi)側(cè)磷脂酰絲氨酸外翻到膜表面 3 凋亡小體的形成 核膜核仁破碎 核染色質(zhì)斷裂為大小不等的片段 與某些細(xì)胞器如線粒體一起聚集 為反折的細(xì)胞膜所包圍 4 凋亡小體逐漸被周?chē)鷮?zhuān)職或非專(zhuān)職吞噬細(xì)胞吞噬 細(xì)胞凋亡DNA的片段化 四 細(xì)胞凋亡的過(guò)程及機(jī)理 接受凋亡信號(hào)凋亡調(diào)控分子間的相互作用蛋白水解酶 caspases 的活化凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng) 細(xì)胞凋亡的兩條通路 膜受體通路 線粒體通路 膜受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 參與死亡受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的接頭蛋白 死亡結(jié)構(gòu)域蛋白deathdomainprotein TRADD TNF受體相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白TNF TNFRI 死亡結(jié)構(gòu)域 TRADD 細(xì)胞凋亡FADD Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白FasL Fas 死亡結(jié)構(gòu)域 FADD 細(xì)胞凋亡RIP 受體相互作用蛋白CRADD 含有死亡結(jié)構(gòu)域的caspase和RIP接頭蛋白MADD 活化MAP激酶的死亡結(jié)構(gòu)域蛋白 一 細(xì)胞凋亡的膜受體通路 FASL FAS FADD凋亡誘導(dǎo)復(fù)合物 DISC 胞質(zhì)中游離的caspase8聚集到這個(gè)復(fù)合物上細(xì)胞有足夠caspase8細(xì)胞caspase8濃度不夠死亡受體活化 切割BidtBid從胞質(zhì)到線粒體細(xì)胞凋亡CtyC釋放 線粒體與細(xì)胞凋亡 線粒體參與細(xì)胞凋亡或壞死的途徑釋放caspase活化因子細(xì)胞色素C 細(xì)胞色素C Apaf 1 caspase9 凋亡體AIF 凋亡誘導(dǎo)因子 Caspase3Apaf 1 凋亡蛋白酶活化因子 二 線粒體通路 五 凋亡的效應(yīng)分子 細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制雖然還不十分清楚 但Caspase即半胱天冬蛋白酶在凋亡過(guò)程中是起著必不可少的作用 細(xì)胞凋亡的過(guò)程實(shí)際上是Caspase不可逆有限水解底物的級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)過(guò)程 半胱氨酸蛋白酶 水解底物天冬氨酸C端肽鍵 因此又稱(chēng)之為Caspases 取英文CysteineC asparticacid Asp proteases的詞頭 Caspase家族的結(jié)構(gòu)與分類(lèi)ICE亞類(lèi)Caspase蛋白酶 ICE是單核細(xì)胞來(lái)源的參與成熟的一種蛋白酶 參與凋亡但不起主要作用 Caspase1 Caspase4 Caspase5 Caspase11Caspase12 Caspase13 Caspase14 凋亡啟動(dòng)亞類(lèi)Caspase蛋白酶 Caspase8 Caspase2 Caspase9 Caspase10 凋亡效應(yīng)亞類(lèi)Caspase蛋白酶 Caspase3 Caspase6 Caspase7 Caspase家族的特點(diǎn)以酶原的形式存在 需要活化 同源活化和異源活化 活化后形成四聚體的蛋白水解酶 發(fā)揮生物學(xué)作用C端同源區(qū)存在半光氨酸激活位點(diǎn)Caspase分 啟動(dòng)酶和效應(yīng)酶 Caspase活化機(jī)制 Caspase的活化是有順序的多步水解的過(guò)程 雖然分子各異 但是它們活化的過(guò)程相似 首先在caspase前體的N 端前肽和大亞基之間的特定位點(diǎn)被水解去除N 端前肽 然后再在大小亞基之間切割釋放大小亞基 并進(jìn)而形成兩兩組成的有活性的四聚體 Caspase的效應(yīng)機(jī)制 凋亡細(xì)胞的特征性表現(xiàn) 包括DNA裂解為200bp左右的片段 染色質(zhì)濃縮 細(xì)胞膜活化 細(xì)胞皺縮 最后形成由細(xì)胞膜包裹的凋亡小體 然后 這些凋亡小體被其他細(xì)胞所吞噬 破壞細(xì)胞抗凋亡因素破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)影響核酸的結(jié)構(gòu)與功能 破壞細(xì)胞抗凋亡因素正?；罴?xì)胞因核酸酶處于無(wú)活性狀態(tài) 這是由于核酸酶和抑制物結(jié)合在一起 如抑制物被破壞 核酸酶即可激活 引起DNA片段化 現(xiàn)知caspase可以裂解這種抑制物而激活核酸酶 因而把這種酶稱(chēng)為Caspase激活的脫氧核糖核酸酶 caspase activateddeoxyribonuleaseCAD 而把它的抑制物稱(chēng)為ICAD 有意義的是CAD只在ICAD存在時(shí)才能合成并顯示活性 因而ICAD對(duì)CAD的活化與抑制是必需要的 破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)Caspase可直接破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu) 如裂解核纖層 核纖層 Lamin 是由核纖層蛋白通過(guò)聚合作用而連成頭尾相接的多聚體 由此形成核膜的骨架結(jié)構(gòu) 使染色質(zhì) chromatin 得以形成并進(jìn)行正常的排列 在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí) 核纖層蛋白作為底物被Caspase裂解 從而使核纖層蛋白崩解 導(dǎo)致細(xì)胞染色質(zhì)的固縮 6影響核酸的結(jié)構(gòu)與功能Caspase可作用于多種與DNA RNA功能有關(guān)的蛋白如滅活或下調(diào)與DNA修復(fù)有關(guān)的酶 mRNA剪切蛋白和DNA交聯(lián)蛋白 由于DNA的作用 這些蛋白功能被抑制 使細(xì)胞的增殖與復(fù)制受阻并發(fā)生凋亡 六 細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié) 1 Bcl 2家族 Bcelllymphoma leukemia 2 B細(xì)胞淋巴瘤 白血病 2 Bc1 2是一種原癌基因 是ced 9在哺乳類(lèi)中的同源物 和一般的癌基因不同 Bc1 2延長(zhǎng)細(xì)胞的生存 能抑制細(xì)胞凋亡 而不是促進(jìn)細(xì)胞的增殖 Bcl 2家族已發(fā)現(xiàn)15個(gè)成員 所有Bcl 2家族成員均含有1個(gè)或多個(gè)BH結(jié)構(gòu)域 蛋白含有4個(gè)Bcl 2同源結(jié)構(gòu)域 依次命名為BHl BH2 BH3和BH4 可分為3個(gè)亞族 Bcl 2亞家族 Bcl 2Bcl xlBcl w Mcl 1 A1 Bcl 2亞家族成員對(duì)細(xì)胞凋亡起抑制作用Bax亞家族 Bax Bak Bok 它們的作用與Bcl 2亞家族的作用相反 可促進(jìn)細(xì)胞凋亡 BH3亞家族 Bik Blk Hrk BNIP3 Biml Bad Bid 僅有BH3結(jié)構(gòu)域 它們的作用也與Bcl 2亞家族的作用相反 可促進(jìn)細(xì)胞凋亡 作用機(jī)制 影響APAF1的功能影響線粒體的結(jié)構(gòu)與功能 2 VDAC和ANT是線粒體外膜上最為豐富的兩種蛋白 最近有一些研究工作表明 WDAC和ANT可與Bc1 2家族蛋白相互作用 在細(xì)胞凋亡過(guò)程中介導(dǎo)對(duì)線粒體的損傷 VDAC本身是一種通道蛋白 它與Bax的結(jié)合可使共通道性能發(fā)生某種變化 這樣一些凋亡蛋白如cytC就可通過(guò) 因?yàn)檫@兩種蛋白在跨越線粒體膜的核苷酸和小分子轉(zhuǎn)運(yùn)中起作用 所以它們與Bax的結(jié)合可能與細(xì)胞凋亡過(guò)程中線粒體ATP ADP轉(zhuǎn)化和磷酸肌酸外運(yùn)的抑制有關(guān) 3 P53與細(xì)胞凋亡P53是腫瘤抑制基因 其產(chǎn)物主要存在于細(xì)胞核內(nèi) P53基因是人類(lèi)腫瘤有關(guān)基因中突變頻率最高的基因 在依賴(lài)P53蛋白的細(xì)胞凋亡中 P53基因是通過(guò)調(diào)節(jié)Bc1 2和Bax基因的表達(dá)來(lái)影響細(xì)胞凋亡的 P53蛋白能特異地抑制Bc1 2的表達(dá) 相反對(duì)Bax的表達(dá)則有明顯的促進(jìn)作用 研究表明 P53蛋白是Bax基因的直接的轉(zhuǎn)錄活化因子 在這些細(xì)胞中 P53蛋白的積累和活動(dòng)引起了細(xì)胞凋亡 4 IAP inhibitorofapoptosis 細(xì)胞凋亡抑制因子 IAP超家族的成員較多 如c IAP1 c IAP2 XIAP NIAP和Survivin 新的成員在不斷的被發(fā)現(xiàn) IAP家族成員有一個(gè)共同的特征 含有一個(gè)或多個(gè) 個(gè)氨基酸的重復(fù)序列 BIR 類(lèi)似于zinc指狀的結(jié)構(gòu) c IAP1 c IAP2和XIAP含有環(huán)指裝結(jié)構(gòu) BIR功能域和之間的連接區(qū)域介導(dǎo)對(duì)caspase的抑制作用 而環(huán)指狀結(jié)構(gòu)則具有泛素化蛋白連接酶的作用 介導(dǎo)caspase 和 的泛素化降解作用 5 Smac Dablo在細(xì)胞凋亡過(guò)程中它可以從線粒體釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì) 成熟的Smac蛋白產(chǎn)生一個(gè)新的N基端 這個(gè)N基端的前面4個(gè)氨基酸可以與lAP的BIR結(jié)構(gòu)域結(jié)合 Smac的功能就是拮抗活化胱解酶9與lAP的結(jié)合 Smac與BIR2的結(jié)合可以中和XlAP對(duì)胱解酶9的抑制 促進(jìn)凋亡 七 細(xì)胞凋亡的生物學(xué)意義 細(xì)胞凋亡與個(gè)體發(fā)育細(xì)胞凋亡與免疫細(xì)胞凋亡與人類(lèi)疾病 免疫細(xì)胞凋亡 胸腺細(xì)胞成熟過(guò)程中的凋亡陽(yáng)性選擇陰性選擇激活誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡 activation inducedcelldeath AICD CTL誘導(dǎo)靶細(xì)胞的凋亡 穿孔素介導(dǎo)的靶細(xì)胞死亡Fas介導(dǎo)的靶細(xì)胞凋亡B細(xì)胞凋亡 經(jīng)過(guò)基因重排 92 的細(xì)胞凋亡 細(xì)胞凋亡與人類(lèi)疾病 細(xì)胞凋亡受抑制有關(guān)的疾病惡性腫瘤 濾泡性淋巴瘤 乳腺癌 等白血病自身免疫性疾病 系統(tǒng)性紅斑狼瘡 腎炎病毒感染性疾病 腺病毒病 庖疹病毒病細(xì)胞凋亡增多有關(guān)的疾病艾滋病 神經(jīng)變性性疾病 早老性遲呆 帕金森病 小腦退化病骨髓發(fā)育不全性疾病缺血性疾病酒精中毒性肝炎 八 細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法 一 細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測(cè) 二 磷脂酰絲氨酸外翻分析 AnnexinV法 三 線粒體膜勢(shì)能 mt 的檢測(cè)四 DNA片斷化檢測(cè)五 TUNEL法六 Caspase 3活性的檢測(cè)七 WB檢測(cè)八 凋亡相關(guān)蛋白TFAR19的表達(dá)和細(xì)胞定位分析 細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測(cè) 1光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡未染色細(xì)胞 凋亡細(xì)胞的體積變小 變形 細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象 細(xì)胞凋亡晚期可見(jiàn)凋亡小體 染色細(xì)胞 常用姬姆薩染色 瑞氏染色 蘇木精染色等 凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)濃縮 邊緣化 呈新月?tīng)罡皆诤四ぶ車(chē)?2熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡一般以細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變來(lái)評(píng)判細(xì)胞凋亡的進(jìn)展情況 常用的DNA特異性染料有 HO Hoechst33342 HO Hoechst33258 DAPI 3電子顯微鏡觀察 NuclearmorphologicalchangesofHeLacellsinapoptosisprocess 488nm 400 電鏡觀察凋亡細(xì)胞體積變小 細(xì)胞質(zhì)濃縮 凋亡 期的細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤(pán)繞 出現(xiàn)許多稱(chēng)為氣穴現(xiàn)象的空泡結(jié)構(gòu) 細(xì)胞凋亡的晚期 細(xì)胞核裂解為碎塊 產(chǎn)生凋亡小體 磷脂酰絲氨酸 PS 外翻分析 AnnexinV法 磷脂酰絲氨酸 Phosphatidylserine PS 正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè) 在凋亡早期 PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面 暴露在細(xì)胞外環(huán)境中 Annexin V是一種分子量為35 36KD的Ca2 依賴(lài)性磷脂結(jié)合蛋白 能與PS高親和力特異性結(jié)合 將Annexin V進(jìn)行熒光素 FITC R PE 或biotin標(biāo)記 以標(biāo)記了的Annexin V作為熒光探針 利用流式細(xì)胞儀 熒光顯微鏡以及共聚焦激光掃描顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生 AnnexinV FITCFluorescence PIFluorescence TimecourseofapoptosisinTF 1cellsculturedinGM CSF freemedium ApoptoticHeLacellswerestainedwithFITC AnnexinV PI 線粒體膜勢(shì)能 mt 的檢測(cè) 線粒體熒光染料 Rhodamine123 DiOC6 3 JC 1 TMRM等對(duì)線粒體膜電位非常敏感 其熒光的增強(qiáng)或減弱說(shuō)明線粒體內(nèi)膜電負(fù)性的增高或降低 DNA片段化分析 細(xì)胞凋亡時(shí)主要生物化學(xué)特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮 染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂 形成180 200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段 在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜 DNAladder 凋亡相關(guān)蛋白TFAR19蛋白的表達(dá)和細(xì)胞定位分析TFAR19 PDCD5 是由本研究室在國(guó)際上首先報(bào)導(dǎo)的一個(gè)擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的人類(lèi)新基因 前期的功能研究表明 它是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的增強(qiáng)劑 利用熒光素 FITC 標(biāo)記的TFAR19單克隆抗體為探針 對(duì)細(xì)胞凋亡過(guò)程中TFAR19蛋白的表達(dá)水平及定位研究發(fā)現(xiàn) 凋亡早期TFAR19表達(dá)水平增高并出現(xiàn)快速核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象 伴隨著細(xì)胞核形態(tài)學(xué)的變化 持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間 在凋亡小體中仍然可見(jiàn) 方法 ELISA Westernblot分析a TFAR19蛋白的細(xì)胞定位分析b TFAR19蛋白的表達(dá)與臨床疾病c 原發(fā)性腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的TFAR19蛋白的表達(dá)水平 DoublestaininganalysisofnuclearlocalizationofTFAR19inK562andHeLacellstreatedwithVP16 170 m 思考題 免疫細(xì)胞凋亡的生理意義簡(jiǎn)述細(xì)胞凋亡常用的檢測(cè)方法及原理簡(jiǎn)述細(xì)胞凋亡的膜受體和線粒體途逕參考文獻(xiàn) 同學(xué)們 來(lái)學(xué)校和回家的路上要注意安全 同學(xué)們 來(lái)學(xué)校和回家的路上要注意安全