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1、會計學(xué)1基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序 公開課公開課1 1、目的基因的獲取、目的基因的獲取2 2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3 3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4 4、目的基因的檢測與鑒定、目的基因的檢測與鑒定第1頁/共44頁一、目的基因的獲取一、目的基因的獲取1.1.目的基因目的基因符合人們需要，能編碼蛋白質(zhì)的基因符合人們需要，能編碼蛋白質(zhì)的基因2.2.基因文庫基因文庫 P9P9 將含有某種生物將含有某種生物不同基因不同基因的許多的許多DNA片斷片斷，導(dǎo)入到，導(dǎo)入到受體菌受體菌的群體中，的群體中，各個受體菌分別各個受體菌分別含有這種生物的不同基因含
2、有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。，稱為基因文庫。第2頁/共44頁第3頁/共44頁種種類類基因組文庫基因組文庫：含有一種生物的含有一種生物的全部基因全部基因部分基因文庫部分基因文庫：只包含了一種生物的只包含了一種生物的部分基因部分基因， 如：如：cDNA文庫文庫第4頁/共44頁某種生物的某種生物的全部全部DNADNA限制酶限制酶DNADNA片段片段DNADNA片段與載體連接片段與載體連接重組重組DNADNA基因組文庫基因組文庫導(dǎo)入受體菌中儲存導(dǎo)入受體菌中儲存基因組文庫的構(gòu)建基因組文庫的構(gòu)建第5頁/共44頁生物生物某個發(fā)育時期某個發(fā)育時期的的mRNAmRNA單鏈單鏈DNADNA雙鏈雙鏈cDNA
3、cDNA片段片段重組重組DNADNA與載體連接與載體連接cDNAcDNA文庫文庫反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶DNADNA聚合酶聚合酶導(dǎo)入受體菌中儲存導(dǎo)入受體菌中儲存 cDNA文庫的構(gòu)建文庫的構(gòu)建-逆轉(zhuǎn)錄法逆轉(zhuǎn)錄法： 第6頁/共44頁基因組基因組DNADNA文庫與文庫與cDNAcDNA文庫的比較文庫的比較第7頁/共44頁3.3.獲取目的基因的方法獲取目的基因的方法（1 1）從基因文庫中獲?。幕蛭膸熘蝎@?。? 2）利用）利用PCRPCR技術(shù)擴增技術(shù)擴增（3 3）人工合成）人工合成第8頁/共44頁依據(jù)：依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。目的基因的有關(guān)信息。如：如：根據(jù)基因的核苷酸序列根據(jù)基因的核苷酸序列 基因的功能
4、基因的功能 基因在染色體上的位置基因在染色體上的位置 基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNAmRNA 基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性（1）從基因文庫中獲取目的基因）從基因文庫中獲取目的基因第9頁/共44頁（2 2）利用）利用PCRPCR技術(shù)擴增目的基因技術(shù)擴增目的基因 概念：概念：PCRPCR全稱為全稱為_，是一項，是一項 在生物在生物_復(fù)制復(fù)制_的核酸合成技術(shù)的核酸合成技術(shù)。 原理：原理：_多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外體外特定特定DNADNA片段片段DNADNA復(fù)制復(fù)制第10頁/共44頁模板DNA第11頁/共44頁50引物1引物2DNA引物95第12頁/共44頁引物1引物
5、2DNA引物72Taq酶Taq酶第13頁/共44頁72第1輪結(jié)束第2輪開始第14頁/共44頁955072TaqTaqTaqTaq第15頁/共44頁72第2輪結(jié)束第16頁/共44頁過程：過程：a a、變性變性（90-9590-95）：雙）：雙鏈鏈DNADNA在受熱下，在受熱下，_斷裂斷裂，形成，形成_b b、復(fù)性復(fù)性（55-6555-65）：溫）：溫度降低，度降低，引物引物與單鏈與單鏈DNADNA結(jié)結(jié)合，形成局部合，形成局部_。 c c、延伸延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶酶的作用下，合成與模的作用下，合成與模板互補的板互補的_。 氫鍵氫鍵單鏈單鏈DNADNA雙鏈雙鏈DNAD
6、NA鏈鏈第17頁/共44頁方式：以方式：以_方式擴增，即方式擴增，即_條件：前提條件條件：前提條件:_:_ 結(jié)果：結(jié)果：指數(shù)指數(shù)2 2n n短時間內(nèi)大量擴增目的基因短時間內(nèi)大量擴增目的基因已知基因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列第18頁/共44頁DNA復(fù)制復(fù)制PCR技術(shù)技術(shù)場所場所解旋方式解旋方式酶酶PCR技術(shù)擴增與技術(shù)擴增與DNA復(fù)制的比較復(fù)制的比較高溫高溫解旋酶解旋酶體外復(fù)制體外復(fù)制主要在細(xì)胞核內(nèi)主要在細(xì)胞核內(nèi)熱穩(wěn)定的熱穩(wěn)定的DNA聚合酶聚合酶細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合酶聚合酶第19頁/共44頁（3）人工合成法：）人工合成法： 在在基因較小，核苷酸序列已基因較小，核苷酸序列已知知的情況下，
7、的情況下，可以利用可以利用DNA合成合成儀儀人工合成人工合成化學(xué)合成法化學(xué)合成法 、 反轉(zhuǎn)錄法反轉(zhuǎn)錄法第20頁/共44頁蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)mRNADNA推測推測推測推測DNADNA合成儀合成合成儀合成第21頁/共44頁A. 使目的基因在受體細(xì)胞中使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在穩(wěn)定存在 并并遺傳遺傳給子代給子代B.同時使目的基因能同時使目的基因能表達(dá)和發(fā)揮作用表達(dá)和發(fā)揮作用第22頁/共44頁2.2.基因表達(dá)載體的基因表達(dá)載體的組成組成：a、目的基因、目的基因b、啟動子、啟動子c、終止子、終止子d、標(biāo)記基因、標(biāo)記基因第23頁/共44頁質(zhì)粒質(zhì)粒目的基因目的基因限制酶限制酶DNA連接酶連接酶重組重組DNA3
8、.基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程第24頁/共44頁（1 1）用）用_切割質(zhì)粒切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)切口露出，使其出現(xiàn)切口露出_。（2 2）用）用_切割目切割目 的基因，使其產(chǎn)生的基因，使其產(chǎn)生_ _ _。（3 3）將目的基因插入質(zhì)粒的）將目的基因插入質(zhì)粒的_處，加入處，加入_，形成了一個重組，形成了一個重組DNADNA分子分子限制酶限制酶黏性末端黏性末端同種限制酶同種限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA連接酶連接酶相同相同第25頁/共44頁目的基因進(jìn)入目的基因進(jìn)入_內(nèi)，并且在內(nèi)，并且在 受體細(xì)胞內(nèi)維持受體細(xì)胞內(nèi)維持_和和_的過程的過程穩(wěn)定穩(wěn)定表達(dá)表達(dá)第26頁/共44頁1、將
9、目的基因?qū)?、將目的基因?qū)胫参镏参锛?xì)胞細(xì)胞（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法特點特點:a.能感染能感染雙子葉雙子葉植物和植物和祼子祼子植物植物,對單子葉植物無感染能力對單子葉植物無感染能力質(zhì)粒的質(zhì)粒的TDNA可轉(zhuǎn)移至受體可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞并細(xì)胞并整合到其染色體上整合到其染色體上第27頁/共44頁Ti質(zhì)粒質(zhì)粒目的基因目的基因構(gòu)建構(gòu)建表表達(dá)達(dá)載載體體導(dǎo)入導(dǎo)入植植物物細(xì)細(xì)胞胞整合整合 植物細(xì)胞植物細(xì)胞染色體染色體DNA表達(dá)表達(dá)新新性性狀狀轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)入農(nóng)農(nóng)桿桿菌菌第28頁/共44頁（2）基因槍法基因槍法-單子葉植物單子葉植物第29頁/共44頁（3）花粉通道法）花粉通道法第30頁/共44頁目的基因表達(dá)載體提純目
10、的基因表達(dá)載體提純 取卵（受精卵）取卵（受精卵） 顯微注射顯微注射 受精卵受精卵 新性狀動新性狀動物物第31頁/共44頁3、將目的基因?qū)А⒛康幕驅(qū)胛⑸锛?xì)胞入微生物細(xì)胞（1）方法：）方法：Ca2+處理法（處理法（增加細(xì)胞壁通透性增加細(xì)胞壁通透性）（2）微生物作受體細(xì)胞原因：）微生物作受體細(xì)胞原因：繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對少繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對少（3）過程：）過程：Ca2+處理處理大腸桿菌大腸桿菌感受態(tài)感受態(tài)細(xì)胞細(xì)胞表達(dá)載體表達(dá)載體與感受態(tài)與感受態(tài)細(xì)胞混合細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)感受態(tài)細(xì)胞吸收胞吸收DNA第32頁/共44頁第33頁/共44頁（1 1）檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的）檢測
11、轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNADNA上上是否插是否插入了目的基因入了目的基因 首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNADNA； A A 方法方法: :DNADNA分子雜交分子雜交 B B 過程過程: : 將含目的基因的將含目的基因的DNADNA片段用片段用放射性同位素放射性同位素等等作標(biāo)記作標(biāo)記, ,以此做以此做探針探針； 使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交, ,若顯示若顯示出出雜交帶雜交帶, ,表明目的基因已插入染色體表明目的基因已插入染色體DNADNA中。中。1.檢測檢測第34頁/共44頁第35頁/共44頁方法方法: :分子雜交法分子雜交法過程過程:
12、:用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNAmRNA雜交雜交, ,若出現(xiàn)若出現(xiàn)雜交帶雜交帶, ,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNAmRNA。第36頁/共44頁方法方法: : 抗原抗原- -抗體雜交抗體雜交第37頁/共44頁提取提取蘇云金桿菌蘇云金桿菌Bt毒素蛋白毒素蛋白將將Bt毒蛋白注毒蛋白注射小鼠體內(nèi)射小鼠體內(nèi)從小鼠血管抽出血液分離出抗從小鼠血管抽出血液分離出抗Bt毒素的抗體毒素的抗體抗體抗體蛋白蛋白質(zhì)質(zhì) 出現(xiàn)出現(xiàn)雜交帶雜交帶脫分脫分化化組織培養(yǎng)組織培養(yǎng)第38頁/共44頁2.2.鑒定（個體生物學(xué)水平鑒定（個體生物學(xué)水平）抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等抗蟲鑒定、抗病
13、鑒定、活性鑒定等第39頁/共44頁抗蟲鑒定抗蟲鑒定 抗病鑒定抗病鑒定活性鑒定等活性鑒定等第40頁/共44頁非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)外顯子外顯子內(nèi)含子內(nèi)含子終止子終止子基因的結(jié)構(gòu)基因的結(jié)構(gòu)啟動子啟動子原核原核真核真核第41頁/共44頁原核細(xì)胞原核細(xì)胞真核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點不同點編碼區(qū)是編碼區(qū)是_的的編碼區(qū)是間隔的、編碼區(qū)是間隔的、_的的相同點相同點都由能夠編碼蛋白質(zhì)的都由能夠編碼蛋白質(zhì)的_和具和具有調(diào)控作用的有調(diào)控作用的_區(qū)組成的區(qū)組成的原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較思思考考編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核細(xì)胞與真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)一樣長嗎？細(xì)胞與真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)一樣長嗎？連續(xù)連續(xù)不連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼非編碼第42頁/共44頁mRNA前前體體mRNA單鏈單鏈DNAcDNA轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄剪接剪接逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)制終止子終止子基基因因不含不含非編非編碼系列碼系列。即不含即不含非非編碼區(qū)編碼區(qū)和和內(nèi)含子內(nèi)含子第43頁/共44頁
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