2017-2018年高中生物 第一單元 生物技術(shù)與生物工程 第一章 基因工程和蛋白質(zhì)工程 第1節(jié) 基因工程的原理學(xué)案 中圖版選修3

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1、 第一章　基因工程和蛋白質(zhì)工程 第一節(jié)　基因工程的原理 1．簡(jiǎn)述基因工程的誕生。 2．簡(jiǎn)述基因工程的原理及技術(shù)。(重點(diǎn)) 3．嘗試DNA的提取與鑒定。(難點(diǎn)) 基 因 工 程 的 誕 生 與 操 作 工 具 1．誕生歷程 時(shí)間 科學(xué)家 事件 1967年 發(fā)現(xiàn)了DNA連接酶 1970年 史密斯等 首次提取出核酸限制性內(nèi)切酶 提取了T4DNA連接酶 1972年 伯格等 構(gòu)建了世界首例體外重組的雜合DNA分子 1973年 科恩等 成功培育出雙重抗性大腸桿菌 2.操作工具 (1)核酸限制性內(nèi)切酶——“基因手術(shù)刀” (2)DN

2、A連接酶——“基因縫紉針” ①作用：將兩個(gè)DNA片段連接起來，修復(fù)被限制性內(nèi)切酶切開的切口，拼接成新的DNA分子。 ②種類：T4DNA連接酶(把限制性內(nèi)切酶切開的黏性末端的縫隙“縫合”起來)。 (3)載體——“分子運(yùn)輸車” ①載體的特點(diǎn) ⅰ.外源DNA的插入不影響載體在宿主細(xì)胞內(nèi)的自我復(fù)制。 ⅱ.有適宜的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，最好是對(duì)多種限制性內(nèi)切酶有單一切點(diǎn)。 ⅲ.具有某些標(biāo)記基因。 ⅳ.載體應(yīng)對(duì)受體細(xì)胞無害。 ②載體的種類： ⅰ.質(zhì)粒：它是細(xì)菌中獨(dú)立于細(xì)菌DNA之外的小型環(huán)狀DNA分子。 ⅱ.噬菌體或其他一些病毒。 探討：下圖表示限制性內(nèi)切酶切割某DNA分子

3、的過程，從下圖中可知，該限制性內(nèi)切酶能識(shí)別的堿基序列及其切割位點(diǎn)是什么？ 提示：GAATTC，切點(diǎn)在G和A之間。 探討：結(jié)合DNA復(fù)制的過程分析，限制性內(nèi)切酶和DNA解旋酶的作用部位有何不同？ 提示：限制性內(nèi)切酶作用于磷酸和脫氧核糖之間的磷酸二酯鍵，DNA解旋酶作用于兩個(gè)堿基之間的氫鍵。 探討：如圖，兩個(gè)核酸片段在適宜條件下，經(jīng)X酶的催化作用，發(fā)生了下述變化，則X酶是什么？ 提示：DNA連接酶。 1．核酸限制性內(nèi)切酶 (1)來源和種類 切割DNA的工具是核酸限制性內(nèi)切酶，又叫限制酶，這類酶主要是從原核生物中分離純化出來的。迄今已分離出的約有4 000種。 (2)作

4、用 限制酶能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。 (3)識(shí)別序列的組成 一般由6個(gè)核苷酸組成，少數(shù)由4、5或8個(gè)核苷酸組成。 (4)作用結(jié)果 當(dāng)限制酶在它識(shí)別序列的中心軸線兩側(cè)將DNA的兩條鏈分別切開時(shí)，產(chǎn)生的是黏性末端；而當(dāng)限制酶在它識(shí)別序列的中心軸線處切開時(shí)，產(chǎn)生的則是平末端。 【特別提示】?、傧拗泼缸饔玫慕Y(jié)果通常有兩種形式——黏性末端或平末端； ②限制酶的作用特點(diǎn)體現(xiàn)了酶的專一性。 2．DNA連接酶 (1)分類 根據(jù)DNA連接酶的來源不同，可以將這些酶分為兩類： ①?gòu)拇竽c桿菌中分離得到的DNA連接酶

5、，稱為E·coli DNA連接酶； ②從T4噬菌體中分離出來的DNA連接酶，稱為T4DNA連接酶。 (2)作用 這兩類酶都是將雙鏈DNA片段“縫合”起來，恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵。 【特別提示】　E·coli DNA連接酶只能將雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端之間連接起來，不能將雙鏈DNA片段平末端之間進(jìn)行連接。而T4DNA連接酶既可以“縫合”雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端，又可以“縫合”雙鏈DNA片段的平末端，但連接平末端之間的效率比較低。 3．載體 (1)常用載體——質(zhì)粒 質(zhì)粒是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、獨(dú)立于細(xì)菌擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的小型環(huán)狀DNA分

6、子。 (2)載體的條件 ①能夠在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定地保存，并能夠復(fù)制，以便提供大量的目的基因； ②具有多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)，便于與外源基因結(jié)合； ③具有標(biāo)記基因，便于進(jìn)行檢測(cè)和篩選。 (3)其他載體 在基因工程中使用的載體除質(zhì)粒外，還有λ噬菌體的衍生物、動(dòng)植物病毒等。 1．下列關(guān)于限制酶和DNA連接酶的理解正確的是(　　) A．其化學(xué)本質(zhì)都是蛋白質(zhì) B．DNA連接酶可以恢復(fù)DNA分子中的氫鍵 C．在基因工程操作中可以用DNA聚合酶代替DNA連接酶 D．它們不能被反復(fù)使用 【解析】　限制酶和DNA連接酶的化學(xué)本質(zhì)均為蛋白質(zhì)，DNA連接酶的作用是將兩個(gè)DNA片段連接起來，D

7、NA聚合酶的作用是把單個(gè)脫氧核苷酸連成脫氧核苷酸鏈。 【答案】　A 2．核酸限制性內(nèi)切酶 Ⅰ 的識(shí)別序列和切點(diǎn)是—G↓GATCC—，核酸限制性內(nèi)切酶 Ⅱ 的識(shí)別序列和切點(diǎn)是—↓GATC—。在質(zhì)粒上有酶 Ⅰ 的一個(gè)切點(diǎn)，在目的基因的兩側(cè)各有一個(gè)酶 Ⅱ 的切點(diǎn)。 (1)請(qǐng)畫出質(zhì)粒被限制酶 Ⅰ 切割后所形成的黏性末端。 (2)請(qǐng)畫出目的基因兩側(cè)被限制酶 Ⅱ 切割后所形成的黏性末端。 (3)在DNA連接酶的作用下，上述兩種不同限制酶切割后的片段是否可以連接？為什么？ 【解析】　本題考查核酸限制性內(nèi)切酶切割DNA的方式，將限制酶能識(shí)別的序列寫出，再將限制酶切點(diǎn)處標(biāo)出，可用虛線畫出，然后可沿著

8、虛線將片段一分為二，這樣便能正確畫出核酸限制性內(nèi)切酶將DNA切出的黏性末端了。若限制酶切割后產(chǎn)生的黏性末端能互補(bǔ)配對(duì)，形成的黏性末端便能連接，否則不能。 【答案】　(1) 　　　　目的基因 (2) 　　　目的基因 (3)可以連接；因?yàn)橛蓛煞N不同限制酶切割后形成的黏性末端是相同的(或是可以互補(bǔ)的)。 　基 因 工 程 的 概 念 與 一 般 程 序 1．概念 基因工程是指按照人們的意愿，將一種生物的基因在體外剪切，并與特殊的運(yùn)載工具進(jìn)行重新組合，然后轉(zhuǎn)入另一種生物的體內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增，并使之表達(dá)產(chǎn)生所需蛋白質(zhì)的技術(shù)。它可以在分子水平上定向改造生物的遺傳性狀。 2．一般

9、程序 (1)目的基因的獲得 ①目的基因：在基因操作中使用的外源基因。 ②獲取方法 ⅰ.直接分離法：直接從基因組中獲取目的基因，最常用的方法是“鳥槍法”，又稱“霰彈法”。 ⅱ.人工合成法：主要包括反轉(zhuǎn)錄法和化學(xué)合成法兩種。 (2)重組載體的構(gòu)建 ①方法：用同一種限制性內(nèi)切酶分別切割質(zhì)粒和目的基因，再用DNA連接酶將它們連接起來。 ②重組載體的作用：攜帶外源DNA分子片段進(jìn)入受體細(xì)胞。 (3)重組載體的導(dǎo)入和篩選 ①轉(zhuǎn)化：將帶有目的基因的重組載體與相應(yīng)的受體細(xì)胞放在一起培養(yǎng)，通過一定的方式進(jìn)行誘導(dǎo)，使之進(jìn)入受體細(xì)胞的過程。 ②轉(zhuǎn)化方法 ⅰ.運(yùn)用載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。 ⅱ.基因

10、槍法。 ⅲ.顯微注射法。 ⅳ.花粉管通道法。 ③篩選方法：利用選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的受體細(xì)胞。 (4)目的基因的表達(dá)和鑒定 通過檢測(cè)轉(zhuǎn)化的生物有沒有顯示出目的基因控制的性狀來進(jìn)行鑒定。 探討：依據(jù)某一蛋白質(zhì)的氨基酸序列合成的目的基因，其脫氧核苷酸序列是否是唯一的？ 提示：不是。因?yàn)橐环N氨基酸可能有多種密碼子來決定。 探討：采用基因工程的方法培育抗蟲棉，下列導(dǎo)入目的基因的做法正確的有哪些？ ①將毒蛋白注射到棉受精卵中?、趯⒕幋a毒蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中　③將編碼毒蛋白的DNA序列與質(zhì)粒重組，導(dǎo)入細(xì)菌，用該細(xì)菌感染棉的體細(xì)胞，再進(jìn)行組織培養(yǎng)　④將編碼毒蛋白的DNA

11、序列與細(xì)菌質(zhì)粒重組，注射到棉的子房并進(jìn)入受精卵 提示：③④。 探討：如何檢測(cè)抗蟲棉中的毒蛋白基因是否表達(dá)？ 提示：讓棉鈴蟲取食抗蟲棉，若棉鈴蟲食后死亡，說明毒蛋白基因表達(dá)。 1．目的基因的獲取 (1)從基因文庫(kù)中獲取目的基因 ①基因組文庫(kù)：如果一個(gè)基因文庫(kù)中包含了一種生物所有的基因，這種基因文庫(kù)就叫做基因組文庫(kù)。 ②部分基因文庫(kù)：如果一個(gè)基因文庫(kù)中只包含了一種生物的一部分基因，這種基因文庫(kù)就叫做部分基因文庫(kù)，如cDNA文庫(kù)。 (2)人工合成目的基因有兩個(gè)途徑： ①反轉(zhuǎn)錄法：就是以目的基因轉(zhuǎn)錄成的mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成單鏈DNA，再合成雙鏈DNA。 ②直接合成法：就

12、是以已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列為基礎(chǔ)，推出mRNA的核苷酸序列，再推出目的基因序列，然后進(jìn)行人工合成。 (3)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因 PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因與DNA復(fù)制的比較 PCR技術(shù) DNA復(fù)制 相同點(diǎn) 原理 堿基互補(bǔ)配對(duì) 原料 四種脫氧核苷酸 條件 模板、ATP、酶 不同點(diǎn) 解旋方式 DNA在高溫下變性解旋 解旋酶催化 場(chǎng)所 體外復(fù)制 細(xì)胞核內(nèi) 酶 熱穩(wěn)定的DNA聚合酶(Taq酶) 細(xì)胞內(nèi)含有的DNA聚合酶 結(jié)果 在短時(shí)間內(nèi)形成大量的DNA片段 形成整個(gè)DNA分子 【特別提示】　從基因文庫(kù)中獲取目的基因和利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時(shí)，

13、目的基因已存在。人工合成目的基因時(shí)，目的基因從無到有。 2．重組載體的構(gòu)建 (1)構(gòu)建目的 其目的是使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。 (2)構(gòu)建零件及其作用 ①目的基因 ②啟動(dòng)子：一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得所需要的蛋白質(zhì)。 ③終止子：相當(dāng)于一盞紅色信號(hào)燈，使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停止下來。終止子位于基因的尾端，也是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA短片段。 ④標(biāo)記基因：其作用是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來，

14、如抗生素抗性基因就可以作為這種基因。 【特別提示】　由于受體細(xì)胞有植物、動(dòng)物、微生物之分，以及目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法不同，因此，基因表達(dá)載體的構(gòu)建也會(huì)有所差別，不可能是千篇一律的。 3．重組載體的導(dǎo)入與篩選 (1)轉(zhuǎn)化：將帶有目的基因的重組載體導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程。 ①過程圖解 【特別提示】　上圖中b與a相比，b會(huì)使目的基因的遺傳特性得以穩(wěn)定維持和表達(dá)，原因是：在進(jìn)行細(xì)胞分裂時(shí)，細(xì)胞核上的DNA經(jīng)復(fù)制后平均分配到兩個(gè)子細(xì)胞中，保證了親子代遺傳性狀的穩(wěn)定性；而a細(xì)胞分裂時(shí)，細(xì)胞質(zhì)是不均分的，子細(xì)胞不一定含有目的基因，其優(yōu)越性在于能有效預(yù)防基因污染。 ②不同細(xì)胞轉(zhuǎn)化的比較 生物

15、種類 植物細(xì)胞 動(dòng)物細(xì)胞 微生物細(xì)胞 常用方法 花粉管通道法 顯微注射法 Ca2＋處理法 受體細(xì)胞 體細(xì)胞 受精卵 原核細(xì)胞 轉(zhuǎn)化 過程 a.用目的基因轉(zhuǎn)化花粉→受精→獲得轉(zhuǎn)化植株 b.將目的基因滴在剪開的柱頭上，使其沿花粉管進(jìn)入胚囊，完成轉(zhuǎn)化 將重組DNA分子提純→取卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動(dòng)物　 Ca2＋處理細(xì)胞→感受態(tài)細(xì)胞→重組DNA分子與感受態(tài)細(xì)胞混合→感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子　　 (2)篩選含有目的基因的受體細(xì)胞 ①原理：質(zhì)粒上有抗生素的抗性基因。 ②方法：利用選擇培養(yǎng)基篩選。 4．目的基因的表達(dá)和鑒定 目的基因

16、導(dǎo)入受體細(xì)胞是否能夠表達(dá)要通過檢測(cè)來確認(rèn)，檢測(cè)的方法有： (1)分子水平檢測(cè)： ①導(dǎo)入檢測(cè)：DNA分子雜交技術(shù)，即使用放射性同位素標(biāo)記的含目的基因的DNA片段作為探針檢測(cè)。 ②表達(dá)檢測(cè) (2)個(gè)體生物學(xué)水平鑒定：對(duì)轉(zhuǎn)基因生物進(jìn)行抗蟲或抗病的接種實(shí)驗(yàn)。 1．下列不屬于獲取目的基因方法的是(　　) A．從基因文庫(kù)中獲取目的基因 B．轉(zhuǎn)錄法 C．反轉(zhuǎn)錄法 D．根據(jù)已知氨基酸序列合成法 【解析】　解答此題從如下兩個(gè)方面入手分析：①獲取目的基因的途徑有兩條：一條是直接分離基因，另一條是人工合成基因。直接分離基因也就是“鳥槍法”，人工合成基因又有兩條途徑，一條是“逆轉(zhuǎn)錄法”，另一條

17、是根據(jù)已知氨基酸序列合成基因。②所謂轉(zhuǎn)錄是指以DNA的一條鏈為模板，遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，合成mRNA的過程。此過程不能獲得DNA(基因)。 【答案】　B 2．下圖是將人的生長(zhǎng)激素基因?qū)爰?xì)菌B細(xì)胞內(nèi)制造“工程菌”的示意圖，所用載體為質(zhì)粒A。已知細(xì)菌B細(xì)胞內(nèi)不含質(zhì)粒A，也不含質(zhì)粒A上的基因，質(zhì)粒A導(dǎo)入細(xì)菌B后，其上的基因能得到表達(dá)。請(qǐng)回答下列問題。 (1)如何將目的基因和質(zhì)粒A相結(jié)合形成重組質(zhì)粒(重組DNA分子)? ________________________________________________________________ _________________

18、_______________________________________________ (2)目前把重組質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞時(shí)效率還不高，導(dǎo)入完成后得到的細(xì)菌，實(shí)際上有的根本沒有導(dǎo)入質(zhì)粒，有的導(dǎo)入的是普通質(zhì)粒A，只有少數(shù)導(dǎo)入的是重組質(zhì)粒?？梢酝ㄟ^如下步驟來鑒別得到的細(xì)菌是否導(dǎo)入了質(zhì)粒A或重組質(zhì)粒：將得到的細(xì)菌涂抹在一個(gè)含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上，能夠生長(zhǎng)的就說明導(dǎo)入了質(zhì)粒A或重組質(zhì)粒，反之則沒有。使用這種方法鑒別的原因是 _______________________________________________________________。 (3)若把通過鑒定證明導(dǎo)入了普通質(zhì)粒

19、A或重組質(zhì)粒的細(xì)菌放在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，會(huì)發(fā)生的現(xiàn)象是__________________________；原因是______ _______________________________________________________________。 (4)導(dǎo)入細(xì)菌B細(xì)胞中的目的基因成功表達(dá)的標(biāo)志是什么？ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ 【解析】

20、　(1)將目的基因和質(zhì)粒A相結(jié)合形成重組質(zhì)粒的過程是：①用一定的限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒A，使其出現(xiàn)一個(gè)有黏性末端的切口；②用同種限制性內(nèi)切酶切割目的基因，產(chǎn)生相同的黏性末端；③將切下的目的基因片段插入到質(zhì)粒A的切口處，再加入適量的DNA連接酶，使質(zhì)粒A與目的基因結(jié)合成重組質(zhì)粒。 (2)檢測(cè)質(zhì)?；蛑亟M質(zhì)粒是否導(dǎo)入受體細(xì)胞，均需利用質(zhì)粒上某些標(biāo)記基因的特性，即對(duì)已經(jīng)導(dǎo)入質(zhì)?；蛑亟M質(zhì)粒的、本身無相應(yīng)特性的受體細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)受體細(xì)胞是否具有標(biāo)記基因的相應(yīng)特性來確定。抗氨芐青霉素基因在質(zhì)粒A上，而且它與目的基因是否插入無關(guān)，所以，用含氨芐青霉素的選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)經(jīng)過導(dǎo)入質(zhì)粒A處理的受體細(xì)胞，凡能生長(zhǎng)的

21、則表明質(zhì)粒A或重組質(zhì)粒導(dǎo)入成功，不能生長(zhǎng)的則無質(zhì)粒A或重組質(zhì)粒導(dǎo)入。 (3)抗四環(huán)素基因不僅在質(zhì)粒A上，而且它的位置正是目的基因插入之處，因此當(dāng)目的基因插入質(zhì)粒A形成重組質(zhì)粒時(shí)，此處的抗四環(huán)素基因的結(jié)構(gòu)和功能就會(huì)被破壞，當(dāng)然含重組質(zhì)粒的細(xì)菌就不能在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)；而質(zhì)粒A上無目的基因插入，抗四環(huán)素基因的結(jié)構(gòu)是完整的，含質(zhì)粒A的細(xì)菌就能在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。 (4)基因成功表達(dá)的標(biāo)志是受體細(xì)胞通過轉(zhuǎn)錄、翻譯過程合成出相應(yīng)的蛋白質(zhì)，即人的生長(zhǎng)激素。 【答案】　(1)用一定的限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒A，使其出現(xiàn)一個(gè)有黏性末端的切口；用同種限制性內(nèi)切酶切割目的基因，產(chǎn)生相同的黏性末端；將

22、切下的目的基因片段插入到質(zhì)粒A的切口處，再加入適量的DNA連接酶，使質(zhì)粒與目的基因結(jié)合成重組質(zhì)粒。 (2)普通質(zhì)粒A和重組質(zhì)粒都含有抗氨芐青霉素基因 (3)有的能生長(zhǎng)，有的不能生長(zhǎng)　導(dǎo)入普通質(zhì)粒A的細(xì)菌能生長(zhǎng)，因?yàn)槠胀ㄙ|(zhì)粒A上有抗四環(huán)素基因；導(dǎo)入重組質(zhì)粒的細(xì)菌不能生長(zhǎng)，因?yàn)槟康幕虿逶诳顾沫h(huán)素基因中，抗四環(huán)素基因的結(jié)構(gòu)被破壞 (4)細(xì)菌細(xì)胞通過轉(zhuǎn)錄、翻譯合成相應(yīng)的蛋白質(zhì)，即人的生長(zhǎng)激素。 探 究 活 動(dòng) : 嘗 試 DNA 的 提 取 與 鑒 定 1．實(shí)驗(yàn)原理 (1)十二烷基磺酸鈉(SDS)能夠使蛋白質(zhì)變性，在研磨液中加入SDS可以使蛋白質(zhì)與DNA分離。乙二胺四乙酸二鈉(E

23、DTA)為DNA酶的抑制劑，可以防止細(xì)胞破碎后DNA分子被降解。 (2)DNA不溶于酒精溶液，但細(xì)胞中的許多其他物質(zhì)可以溶于酒精溶液。利用這一原理，我們可以提取出含雜質(zhì)較少的DNA。 (3)DNA遇二苯胺(沸水浴)會(huì)染成藍(lán)色，因此，二苯胺可以作為鑒定DNA的試劑。 2．活動(dòng)程序 (1)DNA的粗提取 ①材料準(zhǔn)備 將新鮮菠菜和體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精溶液放入冰箱冷凍室，冷凍至少24 h。 ②研磨 稱取30 g新鮮菠菜葉片，切碎。將菠菜碎片置于研缽(在冰上操作)中，加入10_mL研磨液，迅速研磨成糊狀。 ③過濾 在漏斗中墊上尼龍紗布，將菠菜研磨液濾入塑料燒杯中。 ④離心 將濾

24、液倒入5_mL塑料離心管中，以1 000 r/min的速度離心10 min。 ⑤加冷酒精 從離心管中取出上清液，倒入50 mL塑料燒杯中，同時(shí)加入兩倍體積的體積分?jǐn)?shù)為95%的冷酒精。用玻璃棒沿一個(gè)方向緩緩地?cái)嚢枞芤?，溶液中?huì)出現(xiàn)白色絲狀物。用玻璃棒將絲狀物卷起，并用濾紙吸去上面的水分。這種絲狀物的主要成分就是DNA。 (2)DNA的鑒定 取一支20 mL的試管，加入物質(zhì)的量濃度為0.015 mol/L的NaCl溶液5 mL。將得到的絲狀物放入試管中，用玻璃棒攪拌，使絲狀物溶解。然后，向試管中加入4 mL二苯胺試劑，混勻后用沸水浴(100 ℃)加熱10 min。在加熱過程中，隨時(shí)注意試管

25、中溶液顏色的變化。 探討：如果實(shí)驗(yàn)材料改為雞的血細(xì)胞，還需研磨嗎？為什么？ 提示：不需要，因?yàn)閯?dòng)物細(xì)胞無細(xì)胞壁。 探討：在準(zhǔn)備材料時(shí)，為什么要將菠菜葉片和酒精溶液進(jìn)行預(yù)冷處理？ 提示：菠菜葉片預(yù)冷處理有利于破碎細(xì)胞；酒精溶液預(yù)冷處理有利于溶解DNA之外的其他物質(zhì)從而提取含雜質(zhì)較少的DNA。 探討：在DNA提取過程中所用的容器為什么必須是塑料的而不是玻璃的？ 提示：由于玻璃表面帶電荷，DNA中的磷酸基也帶電荷而容易被吸附于玻璃表面，故實(shí)驗(yàn)中用塑料杯和試管可減少DNA損失。 1．DNA提取過程中需要的物質(zhì)及作用 SDS 使蛋白質(zhì)變性，從而使蛋白質(zhì)與DNA分離 EDT

26、A 防止細(xì)胞破碎后DNA分子被DNA酶降解 冷酒精 溶解DNA分子以外的其他物質(zhì)，提取出含雜質(zhì)較少的DNA 0.015 mol/L 的NaCl溶液 溶解DNA 2.DNA粗提取實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵及注意事項(xiàng) (1)在破碎細(xì)胞釋放DNA的過程中，若是血細(xì)胞，加水后必須充分?jǐn)嚢?，?yīng)不少于5 min；若是菜花，則應(yīng)與研磨液混合，研磨時(shí)間不少于10 min。 (2)用冷酒精濃縮和沉淀DNA時(shí)，所用的是95%的酒精，且必須經(jīng)過充分預(yù)冷后才能使用。 (3)在用玻璃棒攪拌時(shí)，玻璃棒不能直接插入燒杯底部，并且攪拌要輕緩，以便獲得較完整的DNA分子。 1．下列關(guān)于“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)

27、敘述，錯(cuò)誤的是(　　) A．酵母和菜花均可作為提取DNA的材料 B．DNA既溶于2 mol/L NaCl溶液也溶于蒸餾水 C．向雞血細(xì)胞液中加蒸餾水?dāng)嚢?，可見玻棒上有白色絮狀? D．DNA溶液加入二苯胺試劑沸水浴加熱，冷卻后變藍(lán) 【解析】　酵母菌和菜花細(xì)胞的細(xì)胞核都含有DNA，可作為提取DNA的材料，A項(xiàng)正確；DNA能溶解在不同濃度的NaCl溶液中，且溶解度隨著NaCl濃度的變化而改變，在利用滲透作用原理向生物材料中加入蒸餾水時(shí)，一方面促使細(xì)胞吸水漲破，另一方面釋放出的DNA也溶解在蒸餾水中，B項(xiàng)正確；向雞血細(xì)胞液中加蒸餾水?dāng)嚢?，目的是加快?xì)胞吸水漲破，釋放其中的DNA，而DNA則溶

28、解在蒸餾水中，因此玻棒上不可能有白色絮狀物，C項(xiàng)錯(cuò)誤；DNA溶液與二苯胺試劑經(jīng)沸水浴加熱會(huì)變藍(lán)，D項(xiàng)正確。 【答案】　C 2．某生物興趣小組開展DNA粗提取的相關(guān)探究活動(dòng)，具體步驟如下。 材料處理：稱取新鮮的花菜、辣椒和蒜黃各2份，每份10 g。剪碎后分成兩組，一組置于20 °C、另一組置于－20 °C條件下保存24 h。 DNA粗提取： 第一步：將上述材料分別放入研缽中，各加入15 mL研磨液，充分研磨，用兩層紗布過濾，取濾液備用。 第二步：先向6只小燒杯中分別注入10 mL濾液，再加入20 mL體積分?jǐn)?shù)為95%的冷酒精溶液，然后用玻璃棒緩緩地沿一個(gè)方向攪拌，使絮狀物纏繞在玻璃棒

29、上。 第三步：取6支試管，分別加入等量的0.015 mol/L NaCl溶液溶解上述絮狀物。 DNA檢測(cè)：在上述試管中各加入4 mL二苯胺試劑，混合均勻后，置于沸水中加熱10 min，待試管冷卻后比較溶液的顏色深淺，結(jié)果如下表。 材料保存溫度 花菜 辣椒 蒜黃 20 °C ＋＋ ＋ ＋＋＋ －20 °C ＋＋＋ ＋＋ ＋＋＋＋ (注：“＋”越多表示藍(lán)色越深) 分析上述實(shí)驗(yàn)過程，回答下列問題。 (1)該探究性實(shí)驗(yàn)課題名稱是________________________________________ _____________________________

30、__________________________________。 (2)第二步中“緩緩地”攪拌，這是為了減少__________________________。 (3)根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得出結(jié)論并分析。 ①結(jié)論1：與20 °C相比，相同實(shí)驗(yàn)材料在－20 °C條件下保存，DNA的提取量較多。 結(jié)論2：_________________________________________________________ _______________________________________________________________。 ②針對(duì)結(jié)論1，請(qǐng)?zhí)岢龊侠淼慕忉專篲__

31、________________________________ _______________________________________________________________。 (4)氯仿密度大于水，能使蛋白質(zhì)變性沉淀，與水和DNA均不相溶，且對(duì)DNA影響極小。為了進(jìn)一步提高DNA純度，依據(jù)氯仿的特性，在DNA粗提取第三步的基礎(chǔ)上繼續(xù)操作的步驟是______________________________________ _______________________________________________________________， 然后用體積分?jǐn)?shù)為9

32、5%的冷酒精溶液使DNA析出。 【解析】　(1)分析表格可知，實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谔骄坎煌牧虾筒煌４鏈囟葘?duì)DNA提取量的影響。 (2)DNA分子為鏈狀，很容易斷裂，所以應(yīng)緩緩地沿一個(gè)方向攪拌。 (3)分析表格可看出，同種材料在－20 ℃時(shí)DNA提取量較多，不同材料在同種溫度下保存時(shí)，蒜黃的DNA提取量最多。低溫下酶活性較低，DNA降解慢。 (4)根據(jù)題意，可用氯仿將DNA溶液中的蛋白質(zhì)析出，進(jìn)一步提高DNA的純度。 【答案】　(1)探究不同材料和不同保存溫度對(duì)DNA提取量的影響 (2)DNA斷裂 (3)①等質(zhì)量的不同實(shí)驗(yàn)材料，在相同的保存溫度下，從蒜黃中提取的DNA量最多?、诘蜏匾种?/p>

33、了相關(guān)酶的活性，DNA降解速度慢 (4)將第三步獲得的溶液與等量的氯仿充分混合，靜置一段時(shí)間，吸取上清液 1.在基因工程中用來修飾、改造生物基因的工具是(　　) A．限制酶和水解酶 B．限制酶和DNA連接酶 C．限制酶和載體 D．DNA連接酶和載體 【解析】　在基因工程中常用限制酶對(duì)DNA分子進(jìn)行切割，用DNA連接酶把不同的DNA片段連接起來，以達(dá)到改造DNA的目的。 【答案】　B 2．下列操作中不屬于重組載體構(gòu)建過程的是(　　) A．用一定的限制酶切割質(zhì)粒露出黏性末端 B．用同一種限制酶切割目的基因露出黏性末端 C．將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒切口處 D．將

34、重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞中 【解析】　重組載體的構(gòu)建過程是指把目的基因和可以用作載體的質(zhì)粒等，利用限制酶和DNA連接酶進(jìn)行重組的過程。 【答案】　D 3．下列是四種限制酶切割形成的8個(gè)末端，你是否能用DNA連接酶將它們連接起來？ (1)　　 (2)　　　(3) (4) (5) (6) (7) (8) 【解析】　(1)、(4)、(5)、(8)都是錯(cuò)位切形成的黏性末端，根據(jù)堿基排列順序可確定(4)和(8)、(1)和(5)具有相同的黏性末端，能連接成功；(2)、(3)、(6)、(7)都是平切形成的平末端，根據(jù)堿基排列順序可確定(2)和(7)、(3)和(6)分別為

35、相同限制酶切割，可連接成功。 【答案】　(2)和(7)能連接形成 (4)和(8)能連接形成 (3)和(6)能連接形成 (1)和(5)能連接形成 4．1979年，科學(xué)家將鼠體內(nèi)能夠產(chǎn)生胰島素的基因與大腸桿菌的DNA分子重組，并且在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了胰島素。如下圖所示，請(qǐng)據(jù)圖回答： (1)圖中[2][5][3][7]表示獲得____________的過程。 (2)圖中[3]代表________，在它的作用下將________和________切成________末端。 (3)經(jīng)[9]________的作用，將[7][6]“縫合”形成[8]________DNA分子。[8]往往含

36、有________基因，以便將來檢測(cè)。 (4)圖中[10]表示將_________________________________________的過程， 為使此過程順利進(jìn)行，一般需將[11]用________處理，以增大[11]細(xì)胞壁的________。 (5)[11]表示[8]隨大腸桿菌的繁殖而進(jìn)行________。 (6)如在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)了胰島素，說明__________________________ _______________________________________________________________。 【答案】　(1)目的基因　(2)限制性

37、內(nèi)切酶　質(zhì)?！∧康幕颉】苫パa(bǔ)配對(duì)的黏性　(3)DNA連接酶　重組　標(biāo)記　(4)重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞　CaCl2　通透性　(5)復(fù)制　(6)目的基因完成了表達(dá)的過程課堂小結(jié)： 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 核心回扣 1.限制性內(nèi)切酶能識(shí)別特定的脫氧核苷酸序列，并于特定位點(diǎn)上準(zhǔn)確切割雙鏈DNA。 2.DNA連接酶是連接雙鏈DNA的專用工具酶。 3.目的基因的獲取方法主要有直接分離法和人工合成法。前者最常用的方法是“鳥槍法”，后者主要包括反轉(zhuǎn)錄法和化學(xué)合成法兩種。 4.載體一般具有的特點(diǎn)：①能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)自我復(fù)制；②含有多種限制酶切點(diǎn)；③具有標(biāo)記基因；④對(duì)受體細(xì)胞無害等。 5.轉(zhuǎn)化是指將帶有目的基因的重組載體與相應(yīng)的受體細(xì)胞放在一起培養(yǎng)，通過一定的方式進(jìn)行誘導(dǎo)，使之進(jìn)入受體細(xì)胞。 6.為檢測(cè)目的基因在受體細(xì)胞中是否表達(dá)，可進(jìn)行生物學(xué)功能鑒定，即檢測(cè)轉(zhuǎn)化的生物有沒有顯示出目的基因控制的性狀。 15