年《基因工程技術(shù)》課程復(fù)習(xí)題解答版

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1、2016年《基因工程技術(shù)》課程復(fù)習(xí)題 1. 名詞解釋（占25%， 10個(gè)名稱解釋，從12個(gè)名詞中選10個(gè)） 基因工程：按照人們的愿望，依據(jù)嚴(yán)密的設(shè)計(jì)，通過體外DNA重組、轉(zhuǎn)基因、基因編輯（CRISPR／Cas9）等技術(shù)，有目的地改造生物物種特性，創(chuàng)造出更符合人類需求的新的生物類型的研究領(lǐng)域。 DNA復(fù)性與變性：變性是指核酸雙螺旋堿基對(duì)的氫鍵斷裂，雙鏈變成單鏈，從而使核酸的天然構(gòu)象和性質(zhì)發(fā)生改變。變性時(shí)維持雙螺旋穩(wěn)定性的氫鍵斷裂，堿基間的堆積力遭到破壞，但不涉及到其一級(jí)結(jié)構(gòu)的改變。 復(fù)性指變性DNA 在適當(dāng)條件下，二條互補(bǔ)鏈全部或部分恢復(fù)到天然雙螺旋結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象，它是變性的一種逆轉(zhuǎn)過程。

2、 PCR：在模板、引物、4種dNTP和耐熱DNA聚合酶存在的條件下，通過酶促合成反應(yīng)特異擴(kuò)增位于兩端已知序列之間的DNA區(qū)段。 Tm值：DNA熔解溫度，指把DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)熱變性過程中紫外吸收值達(dá)到最大值的1/2時(shí)的溫度。不同序列的DNA，Tm值不同。DNA中G－C含量越高，Tm值越高，成正比關(guān)系。 限制性內(nèi)切核酸酶：指能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中特定核苷酸序列，并在每條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵進(jìn)行切割的一類酶，簡稱限制酶。 粘性末端：被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個(gè)伸出的核苷酸，它們之間正好互補(bǔ)配對(duì)，這樣的切口叫黏性末端。 同裂酶：指一些來源不同的能識(shí)別同樣

3、的核苷酸靶子序列的限制性內(nèi)切酶。同裂酶的切割位點(diǎn)可能不同，識(shí)別序列和切割位點(diǎn)都相同的叫同序同切酶，識(shí)別序列相同但切割位點(diǎn)不同的叫同序異切酶。 同尾酶：指來源不同且識(shí)別靶子序列也不同但能產(chǎn)生出相同的黏性末端的限制性內(nèi)切酶。 末端酶或Ter體系：在病毒DNA包裝過程中，催化特異性地切割病毒DNA連環(huán)體，產(chǎn)生單位長度的基因組，并參與基因組包裝的酶類。 DNA連接酶：也稱DNA黏合酶，催化相鄰核苷酸的游離5’-磷酸基團(tuán)和3’-羥基之間形成磷酸二酯鍵的核酸酶。連接酶的催化作用需要消耗ATP。 DNA修飾酶：泛指能夠參與改變DNA組成和結(jié)構(gòu)的一類酶。 DNA聚合酶：是指催化以DNA單鏈為模板，

4、以4種脫氧核糖核苷酸為底物，合成一條與模板鏈序列互補(bǔ)的DNA新鏈的酶。以DNA為復(fù)制模板，從將DNA由5'端點(diǎn)開始復(fù)制到3'端的酶，是細(xì)胞復(fù)制DNA的重要作用酶。 載體：是一種具有特定功能能自我復(fù)制的DNA分子，能將外源DNA片段攜帶進(jìn)入受體細(xì)胞，并在受體細(xì)胞中穩(wěn)定維持和表達(dá)。 質(zhì)粒載體：一種裸露的、比病毒更簡單的，有自主復(fù)制能力的雙鏈超螺旋共價(jià)閉環(huán)DNA分子（簡稱cccDNA）。 在由限制性核酸內(nèi)切酶修飾過的質(zhì)粒DNA序列中插入外源的目的基因，以質(zhì)粒為載體，將目的基因通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法導(dǎo)進(jìn)宿主細(xì)胞，進(jìn)行重組、篩選、擴(kuò)增的過程。 柯斯質(zhì)粒載體：是一類人工構(gòu)建的含有λDNA的cos序列和

5、質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的質(zhì)粒載體。由三個(gè)部分組成：含有一個(gè)pBR322的完整復(fù)制子，兩個(gè)抗性基因AmpR和TetR及一個(gè)帶有λ噬菌體cos序列。 噬菌體載體：噬菌體是一類感染細(xì)菌病毒的總稱 ，在噬菌體DNA分子中，除具有復(fù)制起點(diǎn)外，還有編碼外殼蛋白質(zhì)的基因。噬菌體主主要有雙鏈?zhǔn)删w和單鏈絲狀噬菌體兩大類。雙鏈?zhǔn)删w為λ類噬菌體，單鏈絲狀噬菌體有M13、f1、fd噬菌體。 重組DNA技術(shù)中常用的噬菌體克隆載體主要有λ類噬菌體和M13噬菌體。 溫和噬菌體：具有溶原周期的噬菌體。在短時(shí)間內(nèi)不能連續(xù)完成吸附、侵入、增值、成熟和裂解這五個(gè)階段而實(shí)現(xiàn)繁殖的噬菌體為溫和噬菌體。 烈性噬菌體：只有溶菌周期

6、的噬菌體。烈性噬菌體也稱為毒性噬菌體，噬菌體的繁殖一般分為5個(gè)階段，即吸附、侵入、增殖、成和裂解。凡在短時(shí)間內(nèi)能連續(xù)完成以上5個(gè)階段而實(shí)現(xiàn)其增殖的噬菌體，稱為烈性噬菌體。 溶原周期：指在感染過程中沒有產(chǎn)生出子代噬菌體顆粒，但是噬菌體DNA整合到寄主細(xì)胞的染色體DNA上，成為染色體DNA的一個(gè)組成部分。 溶菌周期：噬菌體吸附到寄主細(xì)胞表面之后，注入DNA，噬菌體的DNA進(jìn)行復(fù)制及蛋白質(zhì)的合成，并組裝成噬菌體顆粒，最后使寄主細(xì)胞裂解，釋放出子代噬菌體顆粒的過程。 體外包裝：在離體條件下，用噬菌體或病毒的蛋白質(zhì)包裹噬菌體或病毒的裸核酸，組裝成有感染性的噬菌體或病毒顆粒的過程。 Ti質(zhì)粒：在根

7、瘤土壤桿菌細(xì)胞中存在的一種染色體外自主復(fù)制的環(huán)形雙鏈DNA分子。它控制根瘤的形成，可作為基因工程的載體。是致癌農(nóng)桿菌的一種內(nèi)源質(zhì)粒，當(dāng)農(nóng)桿菌接觸感染植物時(shí)，能引發(fā)植物產(chǎn)生腫瘤即冠癭瘤。根據(jù)合成不同的冠癭堿類型， Ti質(zhì)?？梢苑譃檎卖~堿型、胭脂堿型、農(nóng)桿堿型和琥珀堿型等。是一種雙鏈環(huán)狀DNA分子，200-250kb，可分為4個(gè)功能區(qū)：T-DNA區(qū)、Vir毒性區(qū)（調(diào)控T-DNA 轉(zhuǎn)移區(qū)）、Con區(qū)（接合轉(zhuǎn)移編碼區(qū)）和Ori區(qū)。 SV40：是猴空泡病毒40，猿猴病毒40或猴病毒40的縮寫，多瘤病毒科，這是在人類和猴子都發(fā)現(xiàn)的致瘤病毒。SV40的基因組是一種環(huán)形雙鏈的DNA，很適于基因操作。SV40

8、病毒有三種外殼蛋白質(zhì)VP1、VP2和VP3，包裝著一條5.2kb的環(huán)狀基因組DNA。根據(jù)其基因組的表達(dá)時(shí)間不同，把基因組分為早期表達(dá)區(qū)和晚期表達(dá)區(qū)。早期表達(dá)區(qū)編碼T-抗原和t-抗原，當(dāng)T-抗原達(dá)到一定濃度時(shí)，開始啟動(dòng)病毒DNA復(fù)制；晚期表達(dá)區(qū)編碼三種外殼蛋白質(zhì)，外殼蛋白質(zhì)在復(fù)制后一段時(shí)間內(nèi)表達(dá)。 穿梭載體：含有病毒完整早期區(qū)段和復(fù)制起點(diǎn)同大腸桿菌的質(zhì)粒分子重組而構(gòu)建的，既能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞復(fù)制增殖，也可以在大腸桿菌中復(fù)制增殖。指含有兩個(gè)親緣關(guān)系不同的復(fù)制子，能在兩種不同的生物中復(fù)制的。這類載體不僅具有細(xì)菌質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)及選擇標(biāo)記基因，還有真核生物的自主復(fù)制序列以及選擇標(biāo)記性狀，具有多克隆位點(diǎn)。

9、 cDNA文庫：以mRNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶催化，在體外反轉(zhuǎn)錄成cDNA，與適當(dāng)?shù)妮d體連接后轉(zhuǎn)化受體菌，則每個(gè)細(xì)菌含有一段cDNA，并能繁殖擴(kuò)增，這樣包含著細(xì)胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合稱為該組織細(xì)胞的cDNA文庫。 基因組文庫：把某種生物基因組的全部遺傳信息通過克隆載體貯存在一個(gè)受體菌克隆子群體中，這個(gè)群體即為這種生物的基因組文庫。 感受態(tài)細(xì)胞：理化方法誘導(dǎo)細(xì)胞，使其處于最適攝取和容納外來DNA的生理狀態(tài)。 Southern印跡雜交：利用瓊脂糖凝膠電泳分離經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化的DNA片段，將膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移至尼龍膜或其他固相支持物上，經(jīng)干烤或者紫外線

10、照射固定，再與相對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)的標(biāo)記探針進(jìn)行雜交，用放射自顯影或酶反應(yīng)顯色，從而檢測(cè)特定DNA分子的含量的技術(shù)。 轉(zhuǎn)染作用：將純化的含有靶基因的質(zhì)粒DNA送入細(xì)胞內(nèi)，并在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。 轉(zhuǎn)化作用：將攜帶某種遺傳信息的DNA分子引入宿主細(xì)胞，通過DNA之間同源重組的作用，獲得具有新遺傳性狀生物細(xì)胞的過程謂之轉(zhuǎn)化作用。 轉(zhuǎn)導(dǎo)作用:當(dāng)病毒從被感染的細(xì)胞釋放出來，再次感染另一細(xì)胞時(shí)，發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組即為轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。 操縱子：指包含結(jié)構(gòu)基因、操縱基因以及啟動(dòng)基因的一些相鄰基因組成的DNA片段，其中結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)受到操縱基因的調(diào)控。主要見于原核生物，但在真核生物中也存在。

11、 啟動(dòng)子：位于結(jié)構(gòu)基因5'端上游的DNA序列※，是指位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游的特異序列（通常位于基因轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游的100bp范圍內(nèi)，長約20-200bp），是轉(zhuǎn)錄起始時(shí)RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，與轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)有關(guān)，但本身并不轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)可以影響它與聚合酶的親和力，從而影響表達(dá)水平。 多順反子：多順反子見于原核生物意指一個(gè)mRNA分子編碼多個(gè)多肽鏈。這些多肽鏈對(duì)應(yīng)的DNA片段則位于同一轉(zhuǎn)錄單位內(nèi)，享用同一對(duì)起點(diǎn)和終點(diǎn)。 增強(qiáng)子：是一段能增強(qiáng)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄效率的特定序列，從而明顯地提高基因轉(zhuǎn)錄的效率。特點(diǎn)：①遠(yuǎn)距離調(diào)控②無方向性 信號(hào)肽：在起始密碼子后，有一段編碼疏水性氨基酸序列的RNA區(qū)域，

12、該氨基酸序列就被稱為信號(hào)肽序列，它負(fù)責(zé)把蛋白質(zhì)引導(dǎo)到細(xì)胞含不同膜結(jié)構(gòu)的亞細(xì)胞器內(nèi)。 密碼子偏好：是指各種生物體偏愛使用三聯(lián)密碼子（即編碼相同氨基酸的密碼子）的現(xiàn)象。 基因表達(dá)：細(xì)胞在生命過程中，把儲(chǔ)存在DNA順序中遺傳信息經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和翻譯，轉(zhuǎn)變成具有生物活性的蛋白質(zhì)分子。此處指外源基因在受體細(xì)胞中從mRNA轉(zhuǎn)錄到功能蛋白質(zhì)翻譯的過程。 Pribnow框：原核生物中，在啟動(dòng)子上游有一個(gè)由5-6個(gè)核苷酸組成的共有序列，以其發(fā)現(xiàn)者的名字命名為Pribnow框。 SD序列：原核生物mRNA起始密碼AUG（相應(yīng)DNA上的起始密碼ATG上游約-10處）的上游約4-7個(gè)核苷酸之前有一富含嘌呤的5 ′

13、 - AGGAGGU-3 ′的短小序列，稱為SD序列（Shine Dalgarno sequence），能與細(xì)菌16SrRNA3’端識(shí)別，幫助從起始AUG處開始翻譯。 2. 判斷題（占5%，5個(gè)判斷題） 3. 選擇題（占10%，5個(gè)選擇題） 4. 問答題（占60%，6個(gè)選擇，從8個(gè)選擇中選6個(gè)） 簡述基因工程的基本技術(shù)路線？ 分離目的基因：從生物有機(jī)體的基因組中分離出帶有目的基因的DNA片段； 體外目的基因和載體重組：在體外，將帶有目的基因的DNA片段連接到能自我復(fù)制并具有選擇標(biāo)記的載體分子上，形成重組DNA分子； 轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞：將重組DNA分子轉(zhuǎn)化到寄主細(xì)胞中； 擴(kuò)大培養(yǎng)（按

14、需）：重組體在細(xì)胞中擴(kuò)增繁殖，獲得大量的細(xì)胞繁殖菌落； 檢測(cè)篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞：從菌落中，篩選出重組DNA分子克隆菌落； 研究與鑒定：將選出的克隆菌落進(jìn)一步研究分析，使目的基因的功能在細(xì)胞水平上表達(dá)。 生產(chǎn)應(yīng)用 簡述基因工程有哪些主要研究內(nèi)容與應(yīng)用領(lǐng)域? 研究內(nèi)容： 基礎(chǔ)研究：克隆載體系統(tǒng)研究 、工具酶系統(tǒng)研究 、受體系統(tǒng)（即表達(dá)系統(tǒng)）研究、目的基因功能及其調(diào)控機(jī)制研究、基因重組及修飾技術(shù)研究、基因組學(xué)研究等 應(yīng)用研究：基因工程藥物研究（醫(yī)學(xué)領(lǐng)域）、轉(zhuǎn)基因植物研究（種植業(yè)領(lǐng)域）、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究（畜牧業(yè)領(lǐng)域）、其他方面研究（食品、化工、能源、環(huán)境等） 應(yīng)用領(lǐng)域： 醫(yī)學(xué)領(lǐng)域：基因工程

15、藥物、基因治療、基因芯片 農(nóng)業(yè)領(lǐng)域：轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 能源環(huán)境領(lǐng)域：轉(zhuǎn)基因能源植物（玉米、木薯、紅薯等）、轉(zhuǎn)基因超級(jí)細(xì)菌和制劑（糞便污染、油污、重金屬、塑料） 軍事領(lǐng)域：基因武器 簡述提取天然DNA的基本步驟及其主要方法？ 生物材料的準(zhǔn)備： 動(dòng)物和人DNA樣品的采集與保存：主要是血樣和組織樣，冷凍保存、甲醛乙醇等防腐保存； 植物DNA樣品的采集與保存：主要有根、莖、葉、花果等組織器官，采集時(shí)避免有病蟲害、損傷的組織器官，將材料清洗用無菌吸水紙吸干保存或冷凍保存； 細(xì)菌DNA樣品的制備：通過合適的培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌增殖，獲得菌液或菌落，離心收集菌體，冷凍保存； 病毒或噬菌體D

16、NA樣品的制備：由于病毒或噬菌體寄生于細(xì)胞內(nèi)，必須從宿主細(xì)胞中分離，過程相當(dāng)復(fù)雜。 細(xì)胞裂解： CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）裂解法、SDS裂解法（十二烷基磺酸鈉）、蛋白酶K裂解法、液氮凍融 DNA的分離和抽提： 酚-氯仿抽提法、鹽析法、氯化銫密度梯度離心法、固相萃取法 純化和濃縮： 在抽提DNA溶液中往往含有少量的RNA、蛋白質(zhì)及實(shí)驗(yàn)試劑殘留物，必須去除進(jìn)一步純化DNA： RNase處理：加入適量的RNase在常溫條件下放置幾分鐘就可以降解DNA溶液中的RNA。 瓊脂糖凝膠電泳洗脫法：用于少量的DNA純化。 氯化銫-溴化乙錠連續(xù)梯度離心法：大量的DNA純化。 離子交換層

17、析法：由于DNA磷酸基團(tuán)與固相陰性交換離子相互作用，DNA能結(jié)合在層析柱固體介質(zhì)（羥基磷灰石、層析樹脂）上，然后再用一定濃度梯度鹽溶液洗脫。 基因組 DNA 的沉淀：用 0.1 倍體積的 3 M NaAc（乙酸鈉） 或 2.5 倍體積的 100% 乙醇沉淀 DNA, 用 70% 乙醇除去 DNA 沉淀中的鹽離子。 基因組 DNA 的溶解與保存：將基因組 DNA 溶解在 TE 緩沖液中，置 4°C 保存。 制備基因組 DNA 時(shí)應(yīng)注意： 防止內(nèi)源性 DNase 保證得到高分子量的基因組 DNA 保證基因組 DNA 不被蛋白質(zhì)和實(shí)驗(yàn)殘留物所污染 闡述PCR引物設(shè)計(jì)原則有哪些？

18、 引物長度適中，一般為18~30個(gè)核苷酸：引物過短會(huì)使PCR的特異性降低，過長會(huì)提高相應(yīng)的退火溫度，并使延伸溫度超過TaqDNA聚合酶的最適溫度72℃，亦會(huì)影響產(chǎn)物的生成，且合成引物的成本增加。 引物中的堿基盡可能隨機(jī)分布：避免出現(xiàn)嘌呤，嘧啶的堆積現(xiàn)象。尤其是引物的3′端不應(yīng)有連續(xù)3個(gè)G和C。否則會(huì)使引物在模板的G+C富集序列區(qū)錯(cuò)誤配對(duì)。 引物中G+C的含量在45~55%左右。設(shè)計(jì)引物時(shí)要考慮3′端和5′端引物具有相似的Tm值。Tm=4（G+C）+2（A+T）。引物長度要確保解鏈溫度不低于54℃。 引物自身內(nèi)部不應(yīng)存在互補(bǔ)序列以避免折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)：按經(jīng)驗(yàn)，引物自身存在的連續(xù)互補(bǔ)序列，

19、一般不超過3bp。 兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，尤其應(yīng)避免3′端的互補(bǔ)形成二聚體。 引物的堿基序列不應(yīng)與非擴(kuò)增區(qū)域有同源性，尤其是引物3′末端連續(xù)8個(gè)堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補(bǔ)序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。 引物3′端堿基是引發(fā)延伸的起點(diǎn)，因此一定要與模板DNA配對(duì)。引物3′端的最佳堿基選擇是G和C。因?yàn)樗鼈冃纬傻膲A基配對(duì)比較穩(wěn)定。 引物的5′端可以修飾，如附加限制酶位點(diǎn)，引入突變位點(diǎn)，用生物素，熒光物質(zhì)，地高辛標(biāo)記，加入其它短序列包括起始密碼子，終止密碼子等。 簡述熒光定量PCR化學(xué)原理 ？※ 實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測(cè)每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

20、（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。 檢測(cè)方法： SYBRGreenⅠ法： 在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。SYBR僅與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合，因此可以通過溶解曲線，確定PCR反應(yīng)是否特異。 TaqMan探針法： PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一

21、個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP）。 簡述構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體的基本策略？ 必須含有在受體細(xì)胞內(nèi)有效的復(fù)制起始位點(diǎn)Ori，最好是松弛型質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)； 必須含有允許外源DNA片段克隆的位點(diǎn)，這樣的位點(diǎn)（限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)）盡可能多，但是最好

22、一種限制性內(nèi)切酶只有唯一的識(shí)別位點(diǎn)； 必須含有供選擇克隆子的標(biāo)記基因，如抗藥性標(biāo)記Tetr、Ampr等，最好有兩種選擇標(biāo)記基因，并且在選擇標(biāo)記基因內(nèi)含有合適的克隆位點(diǎn)，以便外源DNA片段插入克隆位點(diǎn)后，標(biāo)記基因失活，成為選擇克隆子的依據(jù)。 構(gòu)建的質(zhì)?？寺≥d體DNA分子應(yīng)盡可能??； 由于特殊需要，在構(gòu)建的質(zhì)?？寺≥d體時(shí)需要組裝各種“元件”。 例如在克隆位點(diǎn)的上游組裝強(qiáng)啟動(dòng)子，下游組裝相應(yīng)的終止子，成為強(qiáng)表達(dá)質(zhì)粒克隆載體。 在克隆載體的合適位置組入受體細(xì)胞染色體DNA的同源序列，成為基因整合平臺(tái)系統(tǒng)的供體質(zhì)?？寺≥d體。 如何利用農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒構(gòu)建植物克隆載體？ 刪除T-DNA上的

23、tms和tmr的基因（卸甲載體或Onc-Ti載體），恢復(fù)植物細(xì)胞再生能力； 刪除與T-DNA轉(zhuǎn)化無關(guān)的冠癭堿合成酶基因，進(jìn)一步減少重復(fù)的酶切位點(diǎn)； 引入大腸桿菌復(fù)制子和選擇標(biāo)記，構(gòu)建成穿梭載體便于重組子在大腸桿菌中的克隆與擴(kuò)增； 引入植物啟動(dòng)子和Poly（A）信號(hào)序列，便于外源基因在植物細(xì)胞中高效表達(dá)； 加入多克隆位點(diǎn)連桿（MCS）。 簡述構(gòu)建基因組文庫的基本步驟和流程？ 載體的選擇和制備； 高純度、大分子量基因組 DNA 的提取； 基因組 DNA 的部分酶切與分級(jí)分離； 載體與DNA片段的連接； 轉(zhuǎn)化或侵染宿主細(xì)胞； 篩選與保存。 簡單歸納從基因文庫中克隆目的基因有哪

24、些方法？※ 通過對(duì)基因文庫的篩選將目的基因分離出來，一般有兩種方法： 核酸雜交法，原理是分子雜交：首先把屬于一個(gè)文庫的細(xì)菌或噬菌體以較低密度接種在培養(yǎng)皿上以取得相當(dāng)分散的菌落或噬菌斑，然后用硝酸纖維濾膜吸印，使培養(yǎng)皿和濾膜的相對(duì)應(yīng)的位置上具有相同的克隆。同時(shí)另行制備供分子雜交用的探針。為了篩選真核生物的某種基因，常從它的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA經(jīng)反向轉(zhuǎn)錄（見中心法則）合成相應(yīng)的互補(bǔ)DNA(cDNA)，再加入用32P標(biāo)記的核苷三磷酸，用DNA多聚酶切口移位方法制成有同位素標(biāo)記的探針。把探針DNA和硝酸纖維濾膜上的菌落或噬菌體分別進(jìn)行變性處理，然后進(jìn)行分子雜交。再將X光底片覆蓋在經(jīng)過處理的濾膜上以進(jìn)行

25、放射自顯影。在培養(yǎng)皿上找出和X光底片上的黑點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的菌落或噬菌斑。這些菌落或噬菌體中便包含著所需要的基因，經(jīng)過擴(kuò)增便能得到大量的細(xì)菌或噬菌體，從中可以分離出所需基因的DNA片段。 PCR篩選法，通過ＰＣＲ方法將目的基因分離出來（使用的引物是目的基因特異引物）：對(duì)于以混合形式保存的文庫，先將文庫分成幾份，每份為一個(gè)“反應(yīng)池”進(jìn)行PCR反應(yīng)，待選出陽性池后，將陽性池的混合克隆稀釋，然后等量分置?96孔板中，進(jìn)行橫向池及縱向池的ＰＣＲ反應(yīng)，然后將陽性菌落群進(jìn)行稀釋，重復(fù)上述工作，直到篩出陽性單克隆。 簡述（或圖解）抑制消減雜交（SHH）技術(shù)的基本原理？ 是以抑制性PCR反應(yīng)為基礎(chǔ)的cDNA 消

26、減雜交技術(shù)。 通過合成兩個(gè)不同的接頭，連接于測(cè)試cDNA 片段的5’末端，達(dá)到選擇性擴(kuò)增差異性表達(dá)的cDNA 片段，抑制非目的cDNA的擴(kuò)增。 利用抑制性PCR能選擇性擴(kuò)增不同豐度差異基因和cDNA 消減雜交特點(diǎn),運(yùn)用雜交二級(jí)動(dòng)力學(xué)原理（即高豐度序列退火時(shí)產(chǎn)生同源雜交的速度大于低豐度序列）,使原本不同豐度的DNA序列相對(duì)含量趨于一致。然后利用抑制性PCR特點(diǎn),兩端接上同一接頭的非目的基因片段由于具有反向重復(fù)序列,在退火時(shí)容易形成發(fā)夾互補(bǔ)結(jié)構(gòu),在PCR中不能作為模板與引物配對(duì)擴(kuò)增,從而選擇性擴(kuò)增目的基因而抑制非目的基因片段擴(kuò)增。消減雜交扣除了實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間同源序列,再結(jié)合抑制性PCR的動(dòng)力

27、學(xué)富集,實(shí)現(xiàn)高效分離低豐度特異性非同源片段。 簡述（或圖解）菌落（或噬菌體）原位雜交的基本步驟？ ※ 原位雜交就是將細(xì)菌菌落影印到濾膜上，或?qū)⒕N點(diǎn)種在濾膜上然后再生長出可見的菌落，對(duì)濾膜上的菌體進(jìn)行原位裂解使 DNA 釋放出來，并使之固定在濾膜上。然后通過分子雜交，判斷哪個(gè)或哪些菌落含有與探針同源的DNA 。 簡述受體細(xì)胞的選擇應(yīng)符合哪些基本原則？ 便于重組DNA分子的導(dǎo)入，例如細(xì)菌，容易誘導(dǎo)形成感受態(tài)的細(xì)菌細(xì)胞。 能使重組DNA分子穩(wěn)定存在于細(xì)胞中，通常的做法通過修飾改造，選擇某些限制性核酸內(nèi)切酶缺陷型細(xì)胞，即限制與修飾體系缺陷型細(xì)胞。 便于重組體的篩選，選擇與載體所含的選擇標(biāo)

28、記互補(bǔ)匹配的受體細(xì)胞，例如重組子含有TetR基因，而受體細(xì)胞沒有TetR基因。 遺傳穩(wěn)定性高，容易擴(kuò)大培養(yǎng)或發(fā)酵生長。 安全性高，無致病性，不會(huì)對(duì)外界環(huán)境造成污染。 選用內(nèi)源蛋白水解酶基因缺失的或含量低的細(xì)胞，利于外源基因表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的積累。 受體細(xì)胞不能干擾重組子遺傳密碼的正確閱讀與翻譯。 具有較好的轉(zhuǎn)譯后的加工機(jī)制，便于真核目的基因的高效表達(dá)。 在理論研究和生產(chǎn)實(shí)踐上有較高的應(yīng)用價(jià)值。 簡述真核生物前體mRNA轉(zhuǎn)錄加工過程的4種方式？ 5‘末端“戴帽”： 轉(zhuǎn)錄開始后，在先導(dǎo)片段的5‘末端加上7-甲基鳥苷酸，這個(gè)“戴帽”可以保護(hù)5‘末端不受堿性磷酸酶和核酸酶的消化，使mR

29、NA保持穩(wěn)定作用，此外，它還有利于mRNA與rRNA的結(jié)合。如果阻礙了mRNA戴帽，則mRNA的翻譯能力大大降低。線粒體和葉綠體中的mRNA轉(zhuǎn)錄物不發(fā)生戴帽。 3‘末端加尾：通過多聚腺苷合成酶（末端轉(zhuǎn)移酶）的催化作用，在mRNA 3‘末端加接上一串腺苷酸（100-200個(gè)）尾巴即Poly（A）。Poly（A）是mRNA由細(xì)胞核進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)所必須的，同時(shí)，大大提高了mRNA在細(xì)胞質(zhì)中的穩(wěn)定性。 切除內(nèi)含子：真核生物前體mRNA的內(nèi)含子5‘端和3‘端的剪接點(diǎn)各有一個(gè)共有序列，是剪接的識(shí)別位點(diǎn)（5′GT、3′AG）。只有剪接后的mRNA才能從細(xì)胞核進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，否則不能穿過核孔。 甲基化：前體mR

30、NA上有的核苷酸出現(xiàn)甲基化修飾。這也是保持mRNA分子穩(wěn)定所需要的。 簡述在大腸桿菌中高效表達(dá)目的基因的策略？ 優(yōu)化表達(dá)載體的設(shè)計(jì)：組合強(qiáng)啟動(dòng)子和強(qiáng)終止子，增加SD序列中與核糖體16SrRNA互補(bǔ)配對(duì)的堿基序列，調(diào)整SD序列與起始密碼ATG之間的距離及堿基種類。 提高稀有密碼子tRNA的表達(dá)作用：采用點(diǎn)突變等方法將外源基因中的稀有密碼子轉(zhuǎn)換成受體細(xì)胞高頻出現(xiàn)的同義密碼子。 提高外源基因mRNA的穩(wěn)定性：對(duì)于原核細(xì)胞，最好選擇一個(gè)RNase缺失的突變受體細(xì)胞或受體菌。對(duì)于真核細(xì)胞，要考慮增加mRNA的正確加工。此外，還可以通過改變mRNA的結(jié)構(gòu)，使其不容易被核酸酶識(shí)別，從而達(dá)到不被降解的目的。 提高表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性 優(yōu)化發(fā)酵過程：由于大腸桿菌在實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵罐的新陳代謝過程與大規(guī)模工業(yè)化發(fā)酵罐的新陳代謝是有差別的，在進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)，工程菌株大規(guī)模培養(yǎng)的優(yōu)化設(shè)計(jì)和控制對(duì)外源基因的高效表達(dá)至關(guān)重要。