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1、Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,*,*,*,實(shí)驗(yàn)四,蔗糖酶活力測定,3.5二硝基水楊酸法,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?1、掌握酶活力測定的基本原理和方法；,2、學(xué)習(xí)酶的比活力的計算。,二、實(shí)驗(yàn)基本原理,蔗糖酶（-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC 3.2.1.26），是一種水解酶。它能催化非還原性雙糖（蔗糖）的1,2
2、糖苷鍵裂解，將,蔗糖,水解為等量的,葡萄糖,和,果糖,（還原糖）。因此，,每水解1mol蔗糖，就能生成2mol還原糖,。還原糖的測定有多種方法，例如：納爾遜索模吉（Nelson-Smogyi）試劑比色法，斐林試劑法等。,本實(shí)驗(yàn)采用3.5二硝基水楊酸法測定還原糖的含量，由此可得出蔗糖酶水解速度。其原理是3.5二硝基水楊酸與還原糖共熱被還原成棕紅色的氨基化合物，在一定范圍內(nèi)還原糖的量和反應(yīng)液的顏色深度成正比。因此可利用分光光度計在,500nm,進(jìn)行比色測定，求得樣品中的含糖量。此法操作簡便、迅速、雜質(zhì)干擾較小。,蔗糖酶活力單位(u)：,蔗糖酶在室溫(,50,）,pH4.5的條件下，,每分鐘,水解產(chǎn)
3、生,1mol葡萄糖,所需的,酶量(ml),。,蔗糖酶比活力的計算：,酶的比活力為每毫克蛋白質(zhì)所具有的酶活力單位數(shù)，一般用酶活力單位/mg蛋白質(zhì)表示。酶的比活力在酶學(xué)研究中用來衡量酶的純度，對于同一種酶來說，比活力越大，酶的純度越高。利用比活力的大小可以用來比較酶制劑中單位質(zhì)量蛋白質(zhì)的催化能力，是表示酶的純度高低的一個重要指標(biāo)。比活力,酶的總活力單位數(shù)除以總蛋白mg數(shù),，即每mg蛋白所含有的酶活力單位數(shù)。,比活力活力單位/mg蛋白,三、實(shí)驗(yàn)材料與試劑,1、實(shí)驗(yàn)材料,蔗糖酶樣品、,2、實(shí)驗(yàn)試劑,3,5二硝基水楊酸試劑；,甲液：溶解6.9g 結(jié)晶酚于15.2ml 10NaOH溶液中，并用水稀釋至69
4、ml,在此溶液中加6.9g亞硫酸氫鈉。,乙液：稱取255克酒石酸鉀鈉加到300ml 10%NaOH溶液中，再加入800ml 1%3,5-二硝基水楊酸溶液.,甲,乙二溶液相混合即得黃色試劑,貯于棕色瓶中備用,在室溫放置7-10天以后使用。,1g/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液,(葡萄糖相對分子量198.17）,；,5蔗糖溶液；,0.2mol/L乙酸緩沖液，pH4.5；,四、實(shí)驗(yàn)器材與儀器,1、恒溫水浴（25,、,100）；,2、可見光分光光度計、1cm玻璃比色皿；,3、試管、試管架；,4、移液管；,5、微量移液器：200,l,、1000,l；,五、實(shí)驗(yàn)操作方法和步驟,(一)蔗糖酶活力的測定,1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作,按下表加操作：,以還原糖（mg數(shù)）為橫坐標(biāo)，A,520,值為縱坐標(biāo)，制作葡萄糖濃度吸光值標(biāo)準(zhǔn)曲線。,2、蔗糖酶的酶活力測定,按下表加樣：,（二）實(shí)驗(yàn)結(jié)果,1、蔗糖酶活力和比活力的計算：,2、蔗糖酶各步純化樣品的純度比較,六、結(jié)果分析討論,七、注意事項(xiàng),1、酶活力測定時，要控制好反應(yīng)時間，各管的酶反應(yīng)時間一定要一致，否則會影響整體結(jié)果。,2、加各反應(yīng)試劑的體積一定要準(zhǔn)確，否則也會影響最終結(jié)果。,下 次 實(shí) 驗(yàn),蔗糖酶分離純化產(chǎn)物的SDSPAGE檢測,分析,及蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量測定,預(yù)習(xí)參考資料,郭堯君 蛋白質(zhì)電泳實(shí)驗(yàn)技術(shù) 科學(xué)出版社,實(shí)驗(yàn)五,
蔗糖酶活力測定－二硝基水楊酸法
