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1、免疫共沉淀?yè)P(yáng)州大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。 其原理是：當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來(lái)。如果用蛋白質(zhì)x的抗體免疫沉淀x，那么與x在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)y也能沉淀下來(lái)。這種方法常用于測(cè)定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合；也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。原理 優(yōu)點(diǎn)1.相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)；2.蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的，可以避免人
2、為的影響；3.可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。 缺點(diǎn)1.可能檢測(cè)不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用2.兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用； 3.如用western blot檢驗(yàn)，必須在實(shí)驗(yàn)前預(yù)測(cè)目的蛋白是什么，以選擇最后檢測(cè)的抗體，若預(yù)測(cè)不正確，實(shí)驗(yàn)就得不到結(jié)果。 實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵1.實(shí)驗(yàn)最需要注意點(diǎn)就是抗體的性質(zhì)?？贵w不同和抗原結(jié)合能力也不同，免染能結(jié)合未必能用在IP反應(yīng)。建議仔細(xì)檢查抗體的說(shuō)明書(shū)。特別是多抗的特異性是問(wèn)題。2.為防止蛋白的分解，修飾，溶解抗原的緩沖液必須加蛋白酶抑制劑，低溫下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。3.考慮抗體/緩沖液的比例?？贵w過(guò)少就不能檢出抗原
3、，過(guò)多則就不能沉降在beads上，殘存在上清。緩沖劑太少則不能溶解抗原，過(guò)多則抗原被稀釋。 Co-IP工作示意圖Co-immunoprecipitation binding wash elutionY Y Y Y Y 利用western blot 確定捕獲蛋白 通過(guò)質(zhì)譜確定捕獲的蛋白 1.收獲細(xì)胞，加入適量細(xì)胞裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30min, 細(xì)胞裂解液于4c， 最大轉(zhuǎn)速離心30 min后取上清；2.取少量裂解液以備western blot分析，剩余裂解液加1g相應(yīng)的抗體加入到細(xì)胞裂解液，4c緩慢搖晃孵育過(guò)夜；3.取10l protein a 瓊脂糖珠，用適量裂解緩沖液洗3
4、次，每次3,000 rpm離心3 min；4.將預(yù)處理過(guò)的10l protein a 瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過(guò)夜的細(xì)胞裂解液中4c緩慢搖晃孵育2-4h，使抗體與protein a瓊脂糖珠偶連；5.免疫沉淀反應(yīng)后，在4c 以3,000 rpm 速度離心3 min，將瓊脂糖珠離心至管底；將上清小心吸去，瓊脂糖珠用1ml裂解緩沖液洗34次；最后加入15l的2sds 上樣緩沖液，沸水煮5分鐘；6. sds-page, western blotting或質(zhì)譜儀分析。實(shí)驗(yàn)步驟 實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng) （1）細(xì)胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破壞細(xì)胞內(nèi)存在的所有蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用，多采用非離子變性劑（np40或tr
5、iton x-100)。每種細(xì)胞的裂解條件是不一樣的，通過(guò)經(jīng)驗(yàn)確定。不能用高濃度的變性劑（0.2 sds)，細(xì)胞裂解液中要加各種酶抑制劑，如商品化的cocktailer。 （2）使用明確的抗體，可以將幾種抗體共同使用 （3）使用對(duì)照抗體： 單克隆抗體：正常小鼠的igg或另一類(lèi)單抗 兔多克隆抗體：正常兔igg (4) 確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的，而并非外源非特異蛋白，單克隆抗體的使用有助于避免污染的發(fā)生； (5) 要確?？贵w的特異性，即在不表達(dá)抗原的細(xì)胞溶解物中添加抗體后不會(huì)引起共沉淀； (6) 確定蛋白間的相互作用是發(fā)生在細(xì)胞中，而不是由于細(xì)胞的溶 解才發(fā)生的，這需要進(jìn)行蛋白質(zhì)的定位來(lái)確定。
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