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1、會計學(xué)1第1頁/共48頁一、研究背景 動物體內(nèi)，脂肪組織不僅是重要的能量貯存庫和賦形組織，還是保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定及具有分泌激素和細胞因子的重要部位。脂肪細胞增殖與分化失常是導(dǎo)致肥胖及型糖尿病的重要因素。因此，脂肪細胞分化的研究一直是國內(nèi)外醫(yī)學(xué)及生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點之一。 第2頁/共48頁背景知識第3頁/共48頁第4頁/共48頁點，其將成為具有廣闊治療應(yīng)用點，其將成為具有廣闊治療應(yīng)用前景的一類成體干細胞。前景的一類成體干細胞。第5頁/共48頁細胞，下層細胞中成纖維細胞集落細胞，下層細胞中成纖維細胞集落形成單位的頻率為形成單位的頻率為1/1001/100，說明脂，說明脂肪組織中肪組織中干細胞數(shù)目至少是
2、骨髓的干細胞數(shù)目至少是骨髓的500500多倍多倍 。脂肪間充質(zhì)干細胞優(yōu)點第6頁/共48頁變?yōu)楦杉毎麕斓闹匾獊碓?，具有變?yōu)楦杉毎麕斓闹匾獊碓?，具有極大的經(jīng)濟與社會效益。極大的經(jīng)濟與社會效益。脂肪間充質(zhì)干細胞優(yōu)點第7頁/共48頁在全能或多能干細胞中表達，包在全能或多能干細胞中表達，包括胚胎干細胞。括胚胎干細胞。表面標(biāo)記第8頁/共48頁白中起重要作用）等。白中起重要作用）等。表面標(biāo)記第9頁/共48頁結(jié)果可能與細胞所處狀態(tài)及純度結(jié)果可能與細胞所處狀態(tài)及純度有關(guān)。有關(guān)。表面標(biāo)記第10頁/共48頁報道文獻報道文獻AMSCs表面標(biāo)記表面標(biāo)記陽性陽性陰性陰性Gronthos，2001CD44、CD49d、CD
3、49e、CD54、CD55、CD59、CD105、CD106和和HLA-ABCCD14、CD45、CD50、CD56、HLA-DR和骨髓和骨髓基質(zhì)細胞表面分子基質(zhì)細胞表面分子STRO-1Zuk，2002CD13、CD29、CD44、CD105、CD71、STRO-1CD14、CD16、CD31、CD34、CD45、CD106、CD56De Ugarte，2003CD13、CD29、CD44、CD105、CD90、STRO-1CD49d、CD54、CD34、CD106Aust，2004CD10、CD13、CD29、CD44、CD90、和、和HLA-ABCCD11b、CD45和和HLA-DR表面標(biāo)
4、記第11頁/共48頁多向分化潛能第12頁/共48頁Strem BM, 2005多向分化潛能第13頁/共48頁分化分化方向方向相關(guān)文獻相關(guān)文獻骨骼肌骨骼肌Mizuno, 2002；Bacou, 2004；陳希平陳希平, 2004心肌心肌Rangappa, 2003；Planat-Benard, 2004；Yamada, 2006(棕棕色脂肪組織色脂肪組織)；張端珍張端珍, 2005；王燕王燕, 2005成骨成骨Zuk, 2001, 2002；Halvorsen, 2000；Hattori, 2004；陳希哲陳希哲, 2004軟骨軟骨Huang, 2004；Winter, 2003；嚴(yán)笠嚴(yán)笠, 2
5、005脂肪脂肪Zuk, 2001, 2002；Sen, 2001；Von Heimburg D, 2001神經(jīng)神經(jīng)Safford, 2004；Ashjian, 2003；Rchman, 2004；楊立業(yè)楊立業(yè), 2003, 2004第14頁/共48頁多向分化潛能第15頁/共48頁 細胞類型細胞類型 誘導(dǎo)物誘導(dǎo)物 細胞特性細胞特性 脂肪細胞脂肪細胞 地塞米松,異丁基甲基黃嘌，胰島素等 細胞中充滿脂滴，油紅o染色陽性成骨細胞成骨細胞 2-磷酸抗壞血酸, -甘油磷酸 ，地塞米松等鈣化性基質(zhì)產(chǎn)物 ，茜素紅染色陽性骨骼肌細胞骨骼肌細胞 地塞米松，氫化可的松，或5-氮雜胞苷 多核形態(tài)，骨骼肌肌性素重鏈/M
6、yoD表達 心肌細胞心肌細胞 5-氮雜胞苷 細胞圓形，-肌動蛋白和肌鈣蛋白-I表達 神經(jīng)元細胞神經(jīng)元細胞 -巰基乙醇或者異丁基甲基黃嘌, 消炎痛等細胞縮小、周圍有多個神經(jīng)突起 內(nèi)皮內(nèi)皮細胞細胞 血管內(nèi)皮細胞生長因子，堿性成纖維細胞生長因子 細胞之間形成網(wǎng)格樣結(jié)構(gòu) ，表達內(nèi)皮細胞特異性抗原 肝肝( (實質(zhì)實質(zhì)) )細細胞胞肝細胞生長因子， 抑瘤素M表達白蛋白和 -胎蛋白 第16頁/共48頁第17頁/共48頁第18頁/共48頁 脂肪源性干細胞的分離因物種不同消化方法不同。本實驗室采用型膠原酶消化法分離獲得豬脂肪源干細胞，表達脂肪干細胞表面標(biāo)記，在合適誘導(dǎo)劑下，這些細胞分化成了成骨細胞、成肌細胞和脂
7、肪細胞，在此作一簡單介紹。四、豬AMSCs的培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化第19頁/共48頁 細胞培養(yǎng)7-8 天后，細胞生長即可達80 %-90 %融合，貼壁細胞緊密排列成漩渦狀、網(wǎng)狀、輻射狀，有一定的方向性，集落大小不一，含數(shù)個至數(shù)百個細胞不等；集落中細胞形態(tài)為典型梭形細胞(圖A)，這就是我們所要分離獲得的豬AMSCs。原代培養(yǎng)14 d 左右即可形成致密單層(圖B)。 BAAMSCs的培養(yǎng)特性第20頁/共48頁CD44+ (50) CD105+ (100) CD14 (50) CD34 (100) CD106 (100)HLA-DR (50) 利用免疫組織化學(xué)方法檢測豬AMSCs特異性表面標(biāo)記，結(jié)果：CD4
8、4和CD105呈陽性。CD14，CD34,CD106,HLA-DR均為陰性。AMSCs的表面標(biāo)記第21頁/共48頁 在地塞米松、抗壞血酸和磷酸甘油鈉的誘導(dǎo)作用下，豬脂肪間充質(zhì)干細胞逐漸由成纖維樣的長梭形（對照組，圖A）變?yōu)槌晒菢拥姆綁K形，細胞堆積呈卵圓形或方形（圖B） 。AB成骨誘導(dǎo)成骨誘導(dǎo)后的形態(tài)學(xué)觀察第22頁/共48頁B 茜素紅染色檢測誘導(dǎo)細胞的礦物質(zhì)沉積狀況，結(jié)果：豬脂肪間充質(zhì)干細胞在成骨誘導(dǎo)第7天開始出現(xiàn)小的點狀鈣化斑（A），誘導(dǎo)第14天形成廣泛的鈣化結(jié)節(jié)（B）。誘導(dǎo)21天鈣化結(jié)節(jié)更加明顯連接成片（C）。D為對照組。CB成骨誘導(dǎo)第23頁/共48頁 actinOCN 165bpCOL-1
9、 539bp actinRT-PCR檢測成骨標(biāo)志基因COL- 1 （型骨膠原）及OCN（骨鈣素）表達 M: marker; 1-4分別為第0天，7天，14天，21天OCN的表達; 5-8為COL- 1的表達。 結(jié)果：在成骨誘導(dǎo)分化的早期（第7天），可檢測到成骨特異性基因型骨膠原和骨鈣素的表達，隨著誘導(dǎo)時間的增加，2個基因的表達量呈上升趨勢。成骨誘導(dǎo)RT-PCR檢測標(biāo)志基因mRNA的表達第24頁/共48頁 上述結(jié)果說明：在合適誘導(dǎo)劑下，豬脂肪間充質(zhì)干細胞形態(tài)和排列均發(fā)生變化，成纖維樣的長梭形變?yōu)槌晒菢拥姆綁K形，細胞堆積呈卵圓形或方形，茜素紅染色和 RT-PCR均表明可以誘導(dǎo)分化成骨細胞。成骨誘導(dǎo)
10、第25頁/共48頁 成肌誘導(dǎo)第7天出現(xiàn)細胞球形變化(A)，誘導(dǎo)第14天開始出現(xiàn)接觸、融合。部分出現(xiàn)偽足，形態(tài)變長(B)，誘導(dǎo)第21天周圍梭形細胞明顯減少，形成巨大的球形細胞(C,D)。上圖為茜素紅染色。ABDC成肌誘導(dǎo)成肌誘導(dǎo)后的形態(tài)學(xué)觀察第26頁/共48頁成肌誘導(dǎo)后肌紅蛋白(myoglobin)免疫熒光染色 成肌誘導(dǎo)第14天，可檢測到肌紅蛋白(myoglobin)的表達(圖A)，第21天表達明顯增加（圖B)。成肌誘導(dǎo)免疫熒光染色第27頁/共48頁-actin 399 bpMyoD 243 bp Myf5 154bp 上圖是用5-氮雜胞苷誘導(dǎo)1周后的結(jié)果，由圖可以看出, 誘導(dǎo)一周后即可檢測到成
11、肌細胞分化早期表達基因Myf5和MyoD的表達。RT-PCR 檢測成肌標(biāo)志基因的表達1為對照，2為Myf5(成肌調(diào)節(jié)因子)，3為MyoD(生肌決定因子) 成肌誘導(dǎo)肌細胞標(biāo)志基因mRNA的表達第28頁/共48頁成脂誘導(dǎo)后的形態(tài)學(xué)觀察誘導(dǎo)48 h(100)誘導(dǎo)21 d(100)對照21 d(100)脂滴融合(200) 豬脂肪間充質(zhì)干細胞經(jīng)成脂誘導(dǎo)48h后，細胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)個別脂滴(圖A)，隨著誘導(dǎo)時間的延長,充脂細胞數(shù)量增加(圖B) ，且小脂滴逐漸融合成大脂滴(圖C)。對照組細胞無充脂細胞出現(xiàn)（圖C）。ACBD成脂誘導(dǎo)第29頁/共48頁油紅O染色B誘導(dǎo)后充脂細胞明顯增多（100） 脂滴融合, 胞核位
12、于細胞一側(cè)（200） 誘導(dǎo)后的脂肪細胞經(jīng)油紅O染色后,脂滴呈紅色成脂誘導(dǎo)第30頁/共48頁脂肪細胞標(biāo)志基因表達B0260.00.20.40.60.8abcd14PPAR- mRNA表達豐度誘導(dǎo)天數(shù)PPAR595 bp-actin 399 bp成脂誘導(dǎo)第31頁/共48頁成脂誘導(dǎo)第32頁/共48頁豬AMSC細胞系建立的初步研究第33頁/共48頁第34頁/共48頁所有細胞均來源于同一祖細胞，細胞形態(tài)一致第35頁/共48頁CD105CD4424代細胞表面marker鑒定第36頁/共48頁第37頁/共48頁第38頁/共48頁第39頁/共48頁 另外，種子細胞最終移入體內(nèi)還需有合適的生物材料作載體，這種載
13、體必須具有生物相容性，并可生物降解，易于生長因子等促細胞分化和組織形成的分子物質(zhì)的連接和輸送，易于生產(chǎn)和使用。目前關(guān)于生物載體的研究相對較少，因此，特異性組織生物材料也將是一個重要而廣闊的研究領(lǐng)域。第40頁/共48頁第41頁/共48頁第42頁/共48頁索，索，2005年年1月月5日前已經(jīng)公開的日前已經(jīng)公開的關(guān)于關(guān)于脂肪源性干細胞脂肪源性干細胞的基本專利的基本專利共有共有14項，顯示出項，顯示出脂肪間充質(zhì)干脂肪間充質(zhì)干細胞細胞潛在的市場價值。潛在的市場價值。第43頁/共48頁 專利號及相關(guān)專利專利號及相關(guān)專利 專利名稱專利名稱 EP1453954 US2003124721，WO03039489
14、脂肪干細胞分化成內(nèi)分泌胰腺及其用途US2003166278 US6555374、CA2316400 脂肪干細胞的多重中胚層細胞系分化 潛能及其應(yīng)用 WO03080801 分離的脂肪干細胞用于治療心功能衰竭、帕金森疾 病、糖尿病、貧血癥和地中海貧血US2004092011 脂肪基質(zhì)分化成成人脂肪干細胞及其用途 WO03084468 脂肪基質(zhì)分化成成人脂肪干細胞及其用途的改進US2004213767 使用脂肪干細胞修復(fù)主動脈瘤組織 US2004229351 人脂肪組織來源的多能干細胞， 用于移植（組織修復(fù)BR0305721、WO2004013275 或整形的）且不引起排斥反應(yīng)WO2004074457 脂肪干細胞治療心血管疾病的方法US2004171146 US6777231、EP1434855 脂肪來源的干細胞和網(wǎng)格 CA2459202、WO03022988CN1352696T 第44頁/共48頁學(xué)研究的理想種子細胞和最終用于以學(xué)研究的理想種子細胞和最終用于以細胞為基礎(chǔ)的臨床治療提供前提和保細胞為基礎(chǔ)的臨床治療提供前提和保障。障。第45頁/共48頁第46頁/共48頁第47頁/共48頁
脂肪干細胞 PPT學(xué)習(xí)教案
