CLONTECH酵母雙雜中文版[共54頁(yè)]

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1、 目錄 （一） 介紹 4 （二） 試劑盒物品清單 7 （三） 額外附加物品列表 9 （四） 酵母菌株 11 （五） 酵母載體 14 （六） 方法簡(jiǎn)述：?jiǎn)坞s交文庫(kù)的構(gòu)建和篩選 16 方法簡(jiǎn)述：雙雜交文庫(kù)的構(gòu)建和篩選 17 （七） 構(gòu)建用于酵母單雜交的報(bào)告質(zhì)粒載體 18 （八） 構(gòu)建用于酵母雙雜交的DNA-BD融合載體 19 （九） 構(gòu)建生成cDNA文庫(kù) 21 （十） 構(gòu)建和篩選酵母單雜交和雙雜交文庫(kù)（簡(jiǎn)述） 27 （十一） 酵母單雜交文庫(kù)的構(gòu)建和篩選 28 （十二） 酵母雙雜交文庫(kù)的構(gòu)建和篩選 30 方法A:通過酵母配對(duì)（Yeast Mating）來篩選目的蛋

2、白 30 方法B:通過共轉(zhuǎn)化的方法篩選目的蛋白 35 （十三） 分析陽性相互作用結(jié)果 38 （十四） 問題解決指南 44 （十五） 參考文獻(xiàn) 47 （十六） 相關(guān)產(chǎn)品 50 附錄A: 雙鏈 cDNA合成的典型結(jié)果 51 附錄B: 酵母感受態(tài)的制備—LiAc 法 52 附錄C： 單雜交對(duì)照載體信息 53 附錄D： 雙雜對(duì)照載體信息 54 表格列表 Table I． BD Matchmaker酵母菌株的基因型 11 Table I

3、I． BD Matchmaker酵母菌株的表型 11 Table III．單雜交系統(tǒng)的載體 14 Table IV． 雙雜交系統(tǒng)的載體 15 Table V． 各BD-Matchmaker DNA-BD 載體的比較 19 Table VI． RNA起始濃度和PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)之間的關(guān)系 24 Table VII．單雜交共轉(zhuǎn)化的對(duì)照實(shí)驗(yàn)的設(shè)置 29 Table VIII．單雜共轉(zhuǎn)化對(duì)照實(shí)驗(yàn)：期望的結(jié)果 29 Table IX． 雙雜交轉(zhuǎn)化的對(duì)照實(shí)驗(yàn)的設(shè)置 33 Table X． 雙雜交配對(duì)篩選的對(duì)照實(shí)驗(yàn)的設(shè)置 Table XI． 雙雜交共轉(zhuǎn)化的對(duì)照實(shí)驗(yàn)的設(shè)置 Tabl

4、e XII． 雙雜交共轉(zhuǎn)化的對(duì)照實(shí)驗(yàn)：期望的結(jié)果 Table XIII． 用于PCR篩選菌落的Assembling Master Mixs 圖片列表 Figure 1．使用BD Matchmaker單雜交系統(tǒng)篩選蛋白-DNA相互作用 4 Figure 2．使用BD Matchmaker單雜交系統(tǒng)篩選蛋白-蛋白相互作用 4 Figure 3．酵母單雜交和雙雜交篩選的大致步驟 5 Figure 4．構(gòu)建和篩選BD Matchmaker酵母單雜交和雙雜交文庫(kù) 6 Figure 5．酵母菌株AH109和Y187中的報(bào)告基因 12 Figure 6．

5、BD Matchmaker酵母單雜交文庫(kù)的構(gòu)建和篩選 16 Figure 7．BD Matchmaker酵母雙雜交文庫(kù)的構(gòu)建和篩選 17 Figure 8．用BD SMART技術(shù)合成高質(zhì)量的ds cDNA 21 Figure 9．BD CHROMA SPIN純化柱和收集管 26 Figure 10．通過酵母重整合作用來構(gòu)建AD融合文庫(kù) 27 Figure 11．為雙雜交篩選AD融合文庫(kù) 32 Figure 12．分析和證明可能的單雜交和雙雜交相互作用陽性結(jié)果的策略 39 Figure 13．通過酵母配對(duì)來驗(yàn)證蛋白-蛋白相互作用 42 Figure 14．用對(duì)照用人胎盤Poly

6、A+ RNA合成雙鏈cDNA 51 Figure 15．p53HIS對(duì)照載體的圖譜 53 Figure 16．pGAD-Rec2-53 AD對(duì)照載體的圖譜 53 Figure 17．pGADT7-RecT AD對(duì)照載體的圖譜 54 Figure 18．pGBKT7-53 DNA-BD 對(duì)照載體圖譜 54 Figure 19．pGBKT7-Lam DNA-BD 對(duì)照載體圖譜 55 （一） 介紹 BD MatchmakerTM Library Construction & Screening試劑盒提供一種簡(jiǎn)便的方法構(gòu)建cDNA文庫(kù)用來進(jìn)行酵母雙雜交和單雜交的篩選，這些試劑盒結(jié)合了B

7、D Matchmaker TM Systems和BD SMART TM cDNA Synthesis的技術(shù)，只需要用任何組織的1 μg poly A+ RNA 或total RNA就能構(gòu)建cDNA文庫(kù)。 通過一般細(xì)胞內(nèi)克隆步驟，你能利用BD Matchmaker Systems所提供的靈敏的轉(zhuǎn)錄方法所構(gòu)建的文庫(kù)來進(jìn)行單雜交或雙雜交實(shí)驗(yàn)。 單雜交實(shí)驗(yàn)的原理——蛋白-DNA相互作用實(shí)驗(yàn) 單雜交實(shí)驗(yàn)使你能夠確定和描述蛋白與目的順式DNA激活序列的綁定，該序列可能是處于最小限度的啟動(dòng)子上游的用于增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的元件。這個(gè)實(shí)驗(yàn)也可以用于預(yù)測(cè)或新蛋白的DNA綁定結(jié)構(gòu)域的確定。通過BD Matchmaker

8、One-Hybrid System你可以很容易的獲得這些基因表達(dá)的蛋白 在BD Matchmaker One-Hybrid實(shí)驗(yàn)中，潛在的DNA綁定蛋白基因是與克隆在pGADT7-Rec2（為單雜交設(shè)計(jì)的低拷貝載體）上GAL4激活結(jié)構(gòu)域（AD）序列一起融合表達(dá)的。一個(gè)或多個(gè)目的DNA序列的串聯(lián)拷貝被構(gòu)建在pHIS2（含有HIS3營(yíng)養(yǎng)缺陷報(bào)告基因的報(bào)告載體）。DNA綁定蛋白和目標(biāo)序列的相互作用會(huì)激活HIS3的轉(zhuǎn)錄（Figure 1），該過程要在宿主菌株Y187（組氨酸缺陷型）中進(jìn)行并在缺少組氨酸的培養(yǎng)基生長(zhǎng) 雙雜交實(shí)驗(yàn)的原理——蛋白-蛋白相互作用的原理 雙雜實(shí)驗(yàn)分析能用于鑒定新的蛋白與蛋白相

9、互作用、確定疑似作用、明確結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)BD Matchmaker雙雜交實(shí)驗(yàn)分析中，誘餌基因是與GAL4 DNA（DNA-BD）綁定結(jié)構(gòu)域序列融合表達(dá)的，同時(shí)其他的基因或其cDNA與GAL4激活域（AD）序列融合表達(dá)（Fields & Song, 1989; Chien et al., 1991）。當(dāng)誘餌與文庫(kù)融合蛋白在AH109（ADE2, HIS3, lacZ, MEL1）這樣的報(bào)告菌株中相互作用， DNA-BD和 AD相接近結(jié)合，并激活報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄（Figure 2) DNA-BD 和AD的融合序列是將cDNA序列克隆進(jìn)酵母表達(dá)載體pGBKT7 和pGADT7-Rec載體中來實(shí)現(xiàn)的。

10、pGBKT7表達(dá)了與GAL4 DNA-BD融合的蛋白，而 pGADT7-Rec表達(dá)與GAL4 AD相融合的蛋白。在酵母中，兩種融合基因在組成型啟動(dòng)子PADH1下高水平表達(dá)的。其他的像pGBT9、ADH1、pAS2-1、pBridge基于GAL4的克隆載體與這個(gè)試劑盒也相兼容的。pBridge載體能被用于鑒定三蛋白復(fù)合體的酵母三雜交實(shí)驗(yàn)。 單雜交和雙雜交實(shí)驗(yàn)分析的生物學(xué)基礎(chǔ) 單雜交和雙雜交方法是基于許多真核轉(zhuǎn)錄因子被發(fā)現(xiàn)是復(fù)合組成的，它們的轉(zhuǎn)錄激活和DNA綁第結(jié)構(gòu)域在結(jié)構(gòu)上和功能上是分開的。這使研究者可以構(gòu)建各種融合基因，當(dāng)在酵母中表達(dá)時(shí)，能同時(shí)結(jié)合到目標(biāo)DNA序列并激活下游報(bào)告基因

11、的轉(zhuǎn)錄（Figure1 和Figure2），BD Matchmaker systems使用的GAL4的轉(zhuǎn)錄激活域與DNA綁定域是被完全闡述的的轉(zhuǎn)錄因子（Zhu, L. & Hannon, G. J., 2000.） 雙雜和單雜文庫(kù)的建立和篩選 雙雜和單雜文庫(kù)的建立和篩選由四個(gè)主要步驟組成，（注：有兩個(gè)步驟遵從同樣的流程）。 如果想去篩選雙雜交相互作用，第一步是建立一種DNA-BD融合載體。第二步是使用試劑盒所提供BD SMART試劑從你所抽提poly A 和total RNA建立cDNA文庫(kù)。 就酵母雙雜篩選而言，如果你打算我們從

12、預(yù)制的BD Matchmaker cDNA文庫(kù)選取來替代自己準(zhǔn)備文庫(kù)，可以跳過RNA分離、cDNA合成、AD融合文庫(kù)構(gòu)建。這些包含非常廣泛組織的文庫(kù)被有效的保存在甘油中或預(yù)轉(zhuǎn)化到Y(jié)187酵母菌株。我們也提供一種BD Matchmaker文庫(kù)服務(wù)，基于這個(gè)服務(wù)，提供給我們你想篩選的組織與細(xì)胞，我們?yōu)槟阒谱鰽D融合文庫(kù)。請(qǐng)注意，我們盡管在高拷貝酵母表達(dá)載體中建立了很多的預(yù)制和預(yù)轉(zhuǎn)化的BD Matchmaker cDNA文庫(kù)，對(duì)雙雜工作非常理想的，但他們很少適合單雜分析。在單雜分析中我們推薦使用pGADT7-Rec2 and pHIS2等低拷貝載體，因?yàn)樗麄儺a(chǎn)生較少的假陽性克隆。 其次是cDNA

13、合成，把cDNA克隆到BD Matchmaker AD克隆載體中建立一個(gè)GAL4 AD融合文庫(kù)，如果是建立雙雜文庫(kù)是pGADT7-Rec載體，單雜則是pGADT7-Rec2載體?？寺≡诩?xì)胞內(nèi)通過同源重組來進(jìn)行的，這一步利用酵母替內(nèi)高效重組系統(tǒng)使ds cDNA和相應(yīng)的GAL4 AD質(zhì)粒融合。采用重組介導(dǎo)的克隆，文庫(kù)的構(gòu)建和篩選能緊密的完成，而不需要任何的細(xì)菌轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增步驟。簡(jiǎn)單的把cDNA文庫(kù)和相應(yīng)的BD Matchmaker載體轉(zhuǎn)化到酵母中，然后把細(xì)胞用于成分缺省培養(yǎng)基篩選雙雜作用。 Figur

14、e 3. 酵母單雜和雙雜篩選的一般步驟，更加詳細(xì)單雜和雙雜篩選流程圖，請(qǐng)參考Figures 6 and 7.  Figure 4. BD MatchmakerTM 單雜和雙雜文庫(kù)篩選與構(gòu)建. 如這個(gè)圖表所示，As this diagram shows,重組介導(dǎo)克隆使文庫(kù)構(gòu)建和篩選更快捷高效，盡管這里沒有顯示，雙雜文庫(kù)能通過酵母融合篩選（細(xì)節(jié)參照Section XII）.BD SMARTTM 的cDNA合成和擴(kuò)增，請(qǐng)參照Section IX

15、. pGADT7-Rec被用于雙雜文庫(kù)構(gòu)建和篩選而 pGADT7-Rec2被用于單雜文庫(kù)構(gòu)建和篩選。被pGADT7-Rec[2]所顯示的兩個(gè)相關(guān)載體有不同復(fù)制元件。更多的信息請(qǐng)參照Section X 和相關(guān)的載體信息包.i （二）試劑盒內(nèi)試劑列表 此試劑盒包含有足夠試劑能制備5次單雜或5次雙雜文庫(kù)。 去離子水、BD CHROMA SPIN柱,、NaCl溶液、缺省(DO)補(bǔ)充物、NaOAc、LiAc、PEG、TE Buffer,、YPD Plus培養(yǎng)基在室溫下保存；.酵母菌株、對(duì)照Poly A +和BD SMART III Oligo保存在–70°C，其他試劑儲(chǔ)存在–20°C.下。

16、 cDNA第一條鏈合成 cDNA擴(kuò)增 Trial –Size BD Advantage TM PCR 試劑盒 cDNA 純化 單雜交文庫(kù)構(gòu)建 雙雜交文庫(kù)構(gòu)建 BD Yeastmaker 酵母轉(zhuǎn)化系統(tǒng) （三）自備材料 下列試劑自備，無其他特別要求所有的試劑與溶液均儲(chǔ)存與室溫下。 cDNA第一條鏈合成 l 無菌0.5ml離心管 l Poly A+ or total RNA l 礦物油 l 熱循環(huán)儀 l DNA marker (1-kb DNA ladder) l 1.2% Agarose/EtBr gel cDNA的分

17、離 l 1.5ml無菌離心管 l 帶有小架子環(huán)型支架 l 95%乙醇（-20℃） l 1% 氯代二甲苯 誘餌質(zhì)粒構(gòu)建 l E. coli感受態(tài)細(xì)胞。像DH5α or BD Fusion-Blue 感受態(tài)細(xì)胞 l T4 DNA連接酶 l 10X T4 連接buffer l LB/amp 平板 l 50 mM NaCl l 從E. coli轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒的試劑盒 酵母轉(zhuǎn)化（在無菌容器中準(zhǔn)備試劑） l PEG/LiAc溶液 l 1.1X TE/LiAc溶液 l 二甲亞砜 酵母的培養(yǎng)與配對(duì) l YPD培養(yǎng)基(參照Yeast Protocols Handbook)

18、 l YPDA培養(yǎng)基（添加30 mg/L adenine hemisulfate，參照Yeast Protocols Handbook） l TE buffer或者無菌的蒸餾水 l 適合轉(zhuǎn)化的無菌試管和燒瓶 l 100-和150-培養(yǎng)平板 l 無菌玻璃棒，用于撲板彎曲的吸管 l X-α-Gal（用于酵母雙雜MEL1表達(dá)的藍(lán)白篩選） l 有agar的Minimal SD Base和沒有agar的Minimal SD Base l 3-AT（抑制SD缺省his培養(yǎng)基背景生長(zhǎng)） l Kanamycin 儲(chǔ)存液（ 50 mg/ml ）保存于-20℃ l Ampicillin 儲(chǔ)

19、存液（ 50 mg/ml ）保存于-20℃ 文庫(kù)長(zhǎng)期保存 l 100%甘油 l YPD冷凍培養(yǎng)基（25%v/v甘油） 酵母雙雜文庫(kù)的構(gòu)建與篩選 BD Matchmaker Two-Hybrid Library Construction & Screening Kit不提供下列缺省補(bǔ)充物。用戶必須自己從其他公司購(gòu)買或者按照Yeast Protocols Handbook的附錄C的配比自己準(zhǔn)備。 l Trp DO Supplement l –His/–Leu/–Trp DO Supplement l –His/–Trp DO Suppleme

20、nt l –Ade/–Trp DO Supplement PCR 克隆篩選 l BD Matchmaker GAL4 AD LD-Insert Screening Amplimer Set IV．酵母菌株 酵母生長(zhǎng)和保藏的其它信息，請(qǐng)參考Yeast Protocols Handbook。我們也推薦Guthrie & Fink的Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology (1991)和Heslot & Gaillardin的Molecular Biology and Genetic Engineering of Yeasts (19

21、92)。 A 基因型 TABLE I. BD MATCHMAKERTM酵母的基因型 a．GAL1, GAL2和 MEL1 的上游激活序列（UASs）應(yīng)答于GAL4轉(zhuǎn)錄激活因子。trp1,his3, gal4和 gal80的突變都被刪除；leu2-3, 112是一個(gè)雙突變。 b. AH109衍生于 PJ69-2A菌株，包括ADE2 、HIS3營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記和一個(gè)內(nèi)源的MEL1基因(James et al., 1996)。lacZ 報(bào)告基因被引入PJ69-2A 而得到AH109菌株。 B.表現(xiàn)型 驗(yàn)證AH109 和Y187表現(xiàn)型是很重要的(Table II)。 1

22、. 復(fù)蘇凍存的菌株，用無菌環(huán)或者牙簽挑少量的細(xì)胞劃到Y(jié)PDA平板上。 2. 30°C溫育平板3到5天直到克隆出現(xiàn)，從這個(gè)工作平板上分離克隆增殖其他的平板。 3. 按照Table II測(cè)試營(yíng)養(yǎng)需求 a. 用無菌環(huán)或者牙簽，從工作平板上劃3-4個(gè)克隆帶單個(gè)合適的SD選擇平板上。 b. 30°C溫育平板3到6天。酵母在SD選擇培養(yǎng)基生長(zhǎng)比YPDA培養(yǎng)基上要慢一些。 c. 參照Table II比對(duì)你的結(jié)果，只有AH109 和Y181是期望的表現(xiàn)型才繼續(xù)進(jìn)行。 4. 進(jìn)行菌株融合或準(zhǔn)備感受態(tài)細(xì)胞的液體培養(yǎng)，要使用已分離好經(jīng)過驗(yàn)證工作平板克隆，用保鮮膜密封好經(jīng)過表型驗(yàn)證的工作平板，包藏在4°C

23、。 TABLE II .BD MATCHMAKER酵母菌株的表型 注： l 如果TRP1 和LEU2功能基因被導(dǎo)入，AH109 和Y187能夠在SD/–Leu/–Trp上生長(zhǎng)。 l 如果AH109攜帶ADE2 and HIS3基因被激活，AH109 and AH109/Y187 二倍體能在SD/–Ade/–His生長(zhǎng)。(i.e., in the presence of GAL4). C可配對(duì)的菌株 Y187 (MATα)能夠與AH109, HF7c, CG-1945, Y190或 SFY526 (all MATa)相融合。 D. 克隆的顏色和大小 l Y187攜帶的ad

24、e2-101突變和AH109在缺乏GAL4顯示Ade-表型。在低含量的ade 培養(yǎng)基上，克隆在幾天后將變成粉紅色，并在克隆老化后可能變暗。在補(bǔ)充Ade的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，顏色變化不顯著。這些克隆生長(zhǎng)到直徑>2 mm。由于自發(fā)缺失線粒體功能的突變，會(huì)形成1–2%小的白色克隆。溫育培養(yǎng)時(shí)要避免這些白色克隆。 l 總體上Y187比AH109生長(zhǎng)慢并形成明顯較小的克隆。 E.報(bào)告基因 AH109包含四個(gè)在三個(gè)遠(yuǎn)距離GAL4上游調(diào)空序列(UASs)和TATA boxes調(diào)控下的ADE2, HIS3, MEL1和 lacZ四個(gè)報(bào)告基因(Figure 5)。ADE2報(bào)告基因針對(duì)ADE2 and HIS

25、3，單獨(dú)提供強(qiáng)的高嚴(yán)緊度的營(yíng)養(yǎng)選擇，減少假陽性率(James et al., 1996)。你也可以選擇分析編碼α-galactosidase的MEL1。由于α-galactosidase是一種內(nèi)分泌酶，MEL1對(duì)于Y187和 AH109兩者是內(nèi)源性的，可以通過添加X-α-Ga到選擇平板來檢測(cè)他的的活性，如果X-α-Gal存在，MEL1被激活，克隆將變成蘭色。由于在完整的GAL1 UAS調(diào)控下，在陽性的雙雜分析中Y187的lacZ表現(xiàn)出高水平的誘導(dǎo)β-galactosidase活性。 Figure 5. 酵母菌株AH109 和Y187中的報(bào)告基因。AH109是由PJ69-2A派生而來，包括

26、了ADE2和HIS3兩個(gè)營(yíng)養(yǎng)合成基因（James et al., 1996）。MEL1是GAL4的內(nèi)源效應(yīng)基因。lacZ報(bào)告基因被引入PJ69-2A而建成AH109。HIS3，ADE2 和MEL1/lacZ報(bào)告基因都在不完全的GAL4效應(yīng)序列和啟動(dòng)子元件GAL1，GAL2，MEL1的分別控制下 F. 缺失HIS3的表達(dá) l 3-AT是酵母HIS3蛋白的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。它被用于在缺省方式下阻止低水平的His3p的表達(dá)，抑制缺省his SD培養(yǎng)基的北京生長(zhǎng)。 l 由于誘餌蛋白內(nèi)在的dna結(jié)合特性，源于AH109的轉(zhuǎn)化子可能表現(xiàn)出稍高HIS3表達(dá)。通常少量3-AT足以抑制SD/–His上

27、的背景生長(zhǎng)。然而，如果你的選擇是針對(duì)his3和 ade2兩者共同表達(dá)的，在初始文庫(kù)篩選中沒有必要去抑制缺省的HIS3。 l 某些酵母菌株有相對(duì)較高本底水平的His3p，如果你使用Y190作為宿主菌，在培養(yǎng)基中需要25–45 mM 3-AT去抑制背景生長(zhǎng)。 l 在你的選擇培養(yǎng)基中優(yōu)化3-AT的濃度 在你開始這個(gè)步驟以前，注意這個(gè)試劑盒不提供–His/–Trp缺省補(bǔ)充物，你必須自己?jiǎn)为?dú)購(gòu)買或者按照Yeast Protocols Handbook的目錄c的配比自己準(zhǔn)備。 1. 鋪酵母轉(zhuǎn)化子于一系列的不同3-AT濃度的SD/–His/–Trp平板上。 l 如果你采用是包含有像pGBKT7這樣

28、 DNA-BD質(zhì)粒的AH109轉(zhuǎn)化子，我們推薦你從0 到15 mM之間開始測(cè)試3-AT的濃度（0,2.5, 5, 7.5, 10, 12.5, 15 mM） l 如果你是采用包含有pHIS2報(bào)告質(zhì)粒Y187轉(zhuǎn)化子，我推薦你從10 到60 mM之間測(cè)試3-AT的濃度。 注：這些僅僅是推薦，優(yōu)化濃度的高低主要依賴于使用的構(gòu)件和菌株。 2. 使用低濃度的3-AT，一周后，僅允許小的克隆去生長(zhǎng)。培養(yǎng)基中太多的3-AT能 新的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。 （五）.酵母載體 A．單雜交系統(tǒng) 1、克隆載體 l 信號(hào)載體pHIS2：cis-acting DNA片段插在HIS3營(yíng)養(yǎng)報(bào)告基因的上游多克隆位點(diǎn)

29、（MCS）上，與HIS3基因（PminHIS3）啟動(dòng)子區(qū)相鏈接。在信號(hào)載體上還有一段高度保守的低拷貝的CEN6/ARS4序列。 l 克隆載體pGADT7-Rec2: 表達(dá)一個(gè)與GAL4 激活結(jié)構(gòu)域(AD)相融合的蛋白，用于酵母中同源重組介導(dǎo)的克?。▓D4）。因此用戶可以用Sma1消化的pGADT7-Rec2（提供的）和ds cDNA（BD SMART文庫(kù)構(gòu)建法得到的）（Section IX）通過酵母轉(zhuǎn)化構(gòu)建cDNA/AD融合文庫(kù)。 2、對(duì)照載體（附錄C） l 陽性對(duì)照載體p53HIS2：由DNA片段（包含至少3個(gè)連續(xù)拷貝的p53 cis-acting DNA序列）插在pHIS2載體的多

30、克隆位點(diǎn)上構(gòu)成。插入片段在載體中HIS3基因（PminHIS3）及其啟動(dòng)子的上游。 l 陽性對(duì)照載體pGAD-Rec2-53：編碼一個(gè)融合于GAL4 AD的鼠源p53蛋白。包含p53HIS2和pGAD-Rec2-53的酵母細(xì)胞可以在缺組氨酸的SD培養(yǎng)基（如SD/–His/–Leu/–Trp）上生長(zhǎng)。 a、HA是血凝素，這些免疫標(biāo)記用于通過體外的免疫共沉淀來鑒定蛋白與蛋白相互作用，使用的抗體和實(shí)驗(yàn)方案由BD Matchmaker Co-IP 試劑盒提供。它們不適用于檢測(cè)、親合純化和酵母內(nèi)表達(dá)蛋白的免疫共沉淀。 b、通過SV40 Large T PCR Fragment和 pGADT7-Re

31、c共轉(zhuǎn)化，在體內(nèi)同源重組產(chǎn)生的。 c、DNA-BD 和AD載體有不同的營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記，酵母轉(zhuǎn)化子被涂布在缺少特定成分的基礎(chǔ)培養(yǎng)基他們可以被單獨(dú)地篩選出來。 B．雙雜交系統(tǒng) 2. 克隆載體 l pGBKT7：被用于表達(dá)一種與GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)(DNA-BD域融合的蛋白。 l pGADT7-Rec：被用于表達(dá)一種與GAL4 激活結(jié)構(gòu)域(AD)融合的蛋白。這個(gè)載體被設(shè)計(jì)成針對(duì)同源重組介導(dǎo)的克隆。提供的pGADT7-Rec是被Sma I消化的線形DNA。 3. 對(duì)照載體 a. 陽性對(duì)照 l pGBKT7-53編碼一種GAL4 DNA-BD和

32、鼠源的p53融合蛋白。 l SV40 Large T PCR Fragment編碼SV40 large T-antigen。一起使用這個(gè)DNA片段和pGADT7-Rec去檢測(cè)酵母轉(zhuǎn)化重組的效率。SV40 Large T PCR Fragment和pGADT7-Rec重組形成pGADT7-RecT，它編碼GAL4 AD 和large T-antigen的融合蛋白。 l p53和 SV40 large T-antigen在酵母雙雜分析中相互作用 b. 陰性對(duì)照 l pGBKT7-Lam編碼一種GAL4 DNA-BD和人類lamin C融合基因，提供一個(gè)對(duì)照，針對(duì)一種不相關(guān)的蛋白和pGADT

33、7-RecT 和你的AD/library的質(zhì)粒兩者之一的意外作用。Lamin C既不形成復(fù)合體也不于大多數(shù)蛋白相互作用。 TABLE IV. 雙雜系統(tǒng)的載體 a. HA是血凝素，這些免疫標(biāo)記被用于通過體外的免疫共沉淀來鑒定蛋白與蛋白相互作用，使用的抗體和實(shí)驗(yàn)方案由BD Matchmaker Co-IP Kit 提供。它們無意被用于去檢測(cè)、親合純化或者酵母內(nèi)表達(dá)的蛋白的免疫共沉淀。 b. 通過SV40 Large T PCR Fragment和 pGADT7-Rec共轉(zhuǎn)化，在體內(nèi)同源重組產(chǎn)生的。 c. DNA-BD 和AD載體有不同的營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記，當(dāng)酵母轉(zhuǎn)化子被撲到缺少特定成分的基礎(chǔ)培養(yǎng)

34、基他們可以被單獨(dú)的選擇。 d. 載體可以攜帶不同的抗生素標(biāo)記因此可以在E. coli.中單獨(dú)選擇。 （六） 酵母雙雜交文庫(kù)構(gòu)建與篩選 （七）酵母雙雜交文庫(kù)的構(gòu)建和篩選VII、構(gòu)建酵母單雜實(shí)驗(yàn)的信號(hào)載體 A、背景 如果用BD Matchmaker單雜體系從cDNA庫(kù)中篩選DNA-結(jié)合蛋白，必須先確定一個(gè)正確的或預(yù)測(cè)的靶元件。比如，敲除和點(diǎn)突變分析必須非常精確的運(yùn)用。所構(gòu)建的含有一個(gè)或多個(gè)拷貝的連續(xù)靶調(diào)控元件，其邊界包含限制性酶切位點(diǎn)，重組入pHIS2的多克隆位點(diǎn)（MCS）。這就使得靶元件和HIS3信號(hào)基因聯(lián)系到一起。插入靶元件后可能會(huì)影響HIS3

35、表達(dá)的強(qiáng)度。因此，在做單雜實(shí)驗(yàn)前，要先檢測(cè)一下構(gòu)建的載體是否會(huì)減弱HIS3的表達(dá)。背景克隆的生長(zhǎng)是由于HIS3的表達(dá)遺漏造成的，這可以通過在選擇培養(yǎng)基中添加3-AT來控制，在第IV、F部分有詳述。 B、靶元件的合成 每個(gè)靶-信號(hào)載體的構(gòu)建都應(yīng)在報(bào)告基因上游插入包含至少DNA靶元件的一個(gè)拷貝。早期的許多研究都提出，信號(hào)蛋白應(yīng)包含至少3個(gè)連續(xù)拷貝的DNA靶元件。然而，Wei et al. (1999)證實(shí)了在許多情況下，單拷貝就已經(jīng)足夠了。關(guān)于靶元件數(shù)量問題可以參見Ghosh et al., 1993。連續(xù)的拷貝可通過多種方法制備，我們發(fā)現(xiàn)的最便捷、可靠的方法是寡核苷酸合成法。該方法之所

36、以受歡迎是因?yàn)閷?duì)于≤20 bp長(zhǎng)度的調(diào)控元件該方法都很有效。 1、設(shè)計(jì)兩條反向平行核苷酸鏈，一條為正義鏈，另一條為反義互補(bǔ)鏈。 注：正義鏈應(yīng)包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的靶元件和兩端不同的酶切位點(diǎn)。當(dāng)兩鏈退火時(shí)，雙鏈DNA會(huì)在每個(gè)末端有不同的突出來定向連入pHIS2。設(shè)計(jì)載體時(shí)參照pHIS2載體的多克隆位點(diǎn)信息（PT3705-5）。 2、合成不含5’ 磷酸鹽的雙鏈（參照合成方法）。 C、將靶DNA插入pHIS2的多克隆位點(diǎn) 1、正反義鏈核苷酸各0.1μg在10μl 50mM NaCl中混勻 2、核苷酸置于70℃ 5min退火，慢慢冷卻至室溫（~30min） 3、20μl體系完全酶切0.1μ

37、g pHIS2。37℃ 2hr或者按生產(chǎn)商的指導(dǎo)。 4、取2μl樣品進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，確定質(zhì)粒是否完全線性化。 5、將5μl酶切后的質(zhì)粒、1μl退火后的寡核苷酸和4μl水混勻。 6、加入1.2μl 10×T4連接酶buffer和0.8μl（至少0.8units）T4 DNA連接酶，置于室溫4hr。 注：寡核苷酸和載體的摩爾分子量為比100：1或者更大，無需通過膠回收來出除小片段。 7、用標(biāo)準(zhǔn)方法，每個(gè)構(gòu)建的載體各自轉(zhuǎn)化大腸桿菌（Sambrook et al., 1989）。我們推薦用DH5α或者BD Fusion-BlueTM 提供的感受態(tài)細(xì)胞。 8、涂布在LB/Kan平板

38、上，３７℃過夜。 ９、用任意標(biāo)準(zhǔn)方法制備純凈的DNA（Sambrook et al., 1989）。通過用２％瓊脂糖凝膠電泳和測(cè)序來鑒定靶片段插入是否正確。 Ｄ、鑒定靶－信號(hào)載體的HIS3背景表達(dá) １、靶－信號(hào)載體用小規(guī)模方法轉(zhuǎn)化Y187（參見第XI、C部分） ２、按第IV、F部分的方法來決定優(yōu)化選擇性培養(yǎng)基中３-AT的濃度。比如，我們發(fā)現(xiàn)１０mM ３-AT 就足夠抑制Y１８７細(xì)胞轉(zhuǎn)化p53HIS2對(duì)照實(shí)驗(yàn)的背景生長(zhǎng)了。VIII、為雙雜分析建立一個(gè)與DNA-BD融合的載體 A. 建立一個(gè)DNA-BD融合基因 l 如果相同的酶切位點(diǎn)在測(cè)試基因和相應(yīng)的載體都存在，你可以建立一個(gè)

39、GAL4 DNA-BD融合基因。如果不，你可以通過PCR擴(kuò)增基因片段，使用的引物帶有相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，通過合并期望的突變PCR引物，一個(gè)在基因末端酶切位點(diǎn)可以被改變成不同的位點(diǎn)或者加入到不同的閱讀框。另外，如果你已經(jīng)把一個(gè)基因克隆到BD Creator Donor Vector中，使用Cre recombinase把你的基因轉(zhuǎn)到pLP-GBKT7中。參考BD Creator DNA Cloning Kits User Manual。 l 更多關(guān)于克隆的具體信息，請(qǐng)參照Sambrook et al. (1989) TABLE V. BD MATCHMAKERTMDNA-BD載體的比較

40、 a. 包含兩個(gè)檢測(cè)三蛋白復(fù)合體的遠(yuǎn)距離表達(dá)框。 b. 在以前BD Matchmaker Two-Hybrid Systems使用的DNA-BD載體。 c. BD Creator Acceptor Vector (LP = loxP). 從任何BD Creator Donor Vector接受基因，作為GAL4 DNA-BD融合蛋白表達(dá)它。 1. 純化基因片段。（我們推薦使用NucleoSpin Extraction Kit (#K3051-1, -2)快速純化DNA片段）。 2. 用合適的內(nèi)切酶消化DNA-BD載體，進(jìn)行磷酸化和醇化處理 3. 連接相應(yīng)的載體和插入片段，轉(zhuǎn)化連接混

41、合物到E. coli。 4. 用酶切分析或PCR來鑒定被插入的質(zhì)粒 B. 檢測(cè)DNA-BD融合基因的轉(zhuǎn)錄激活 1. 使用少量轉(zhuǎn)化方案（Section XII.A.7），使AH109 和Y187轉(zhuǎn)化雜交。撲轉(zhuǎn)化子在下列平板上： l SD/–Trp/X-α-Gal l SD/–His/–Trp/X-α-Gal l SD/–Ade/–Trp/X-α-Gal 包括一個(gè)假陽性對(duì)照，例如利用空載的DNA-BD載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞。 注：BD Matchmaker Library Construction & Screening Kit (#K1615-1)不提供制作這些培養(yǎng)基所要求的卻省培養(yǎng)物

42、。你必須自己?jiǎn)为?dú)購(gòu)買或者按照Yeast Protocols Handbook的目錄c的配比自己準(zhǔn)備。 2. 結(jié)果分析 l 誘餌蛋白不被激活，如果轉(zhuǎn)化子克隆是白色的并不能在SD/–His/–Trp 或者SD/–Ade/–Trp上生長(zhǎng)，繼續(xù)5-6步。 l 誘餌蛋白沒有激活，如果轉(zhuǎn)化子克隆是蘭色的，并能SD/–His/–Trp 或者SD/–Ade/–Trp生長(zhǎng)，用3-4步驟繼續(xù)。 4. 如果誘餌菌株在缺少His的培養(yǎng)基顯示背景生長(zhǎng)，在你可以通過添加3-AT到選擇培養(yǎng)基（Section IV.F）。也可以使用–Ade/–His/–Leu/–Trp培養(yǎng)基篩選文庫(kù)。 5. 如果一個(gè)誘餌菌株在缺少

43、Ade和His的培養(yǎng)基上顯示背景生長(zhǎng)，很難在雙雜篩選中使用這個(gè)誘餌蛋白。請(qǐng)參照故障處理指導(dǎo)。 6. 如果就你的誘餌蛋白而言已知蛋白可用，用他去核對(duì)用這個(gè)特別DNA-BD/bait fusion雙雜相互作用的是否 有可檢測(cè)性。 7. 蛋白表達(dá)的鑒定 l 用轉(zhuǎn)化的菌液做Western印記，用GAL4 DNA-BD的抗體做印記探針。使用沒有轉(zhuǎn)化的酵母菌液做對(duì)照。 注：使用多克隆抗體可能導(dǎo)致多重交叉反映帶；pGBT9 和pBridge的表達(dá)水平太低不允許使用GAL4 DNA-BD單克隆抗體檢測(cè)。 C. 測(cè)試DNA-BD融合蛋白的毒性 l 對(duì)比轉(zhuǎn)化空載DNA-BD載體和DNA-BD/誘餌質(zhì)粒

44、的液體培養(yǎng)Y187細(xì)胞的生長(zhǎng)率，如果誘餌菌株生長(zhǎng)明顯減慢，你的DNA-BD/誘餌質(zhì)?？赡苡卸尽? l 使用少量酵母轉(zhuǎn)化方案去準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化子。在SD/–Trp上選擇轉(zhuǎn)化子，如下方案貯備過夜培養(yǎng)： 1. 用50 ml SD/–Trp/Kan (20 μg/ml)溫育一個(gè)大的克隆（2-3mm） 2. 30°C，250–270 rpm 搖晃，過夜培養(yǎng)(16–24 hr)。 3. 檢測(cè)培養(yǎng)物OD600。它應(yīng)該≥0.8，如果OD600遠(yuǎn)小于0.8/，DNA-BD融合蛋白可能有毒。如果融合基因不阻止酵母的生長(zhǎng)，她是無毒的，你可以計(jì)劃用酵母融合去篩選你的雙雜文庫(kù)，用步驟4-7繼續(xù)。如果你打算用共轉(zhuǎn)化去篩選，

45、你可以停在這里并采用Section IX。 4. 離心600 x g，5分鐘。 5. 棄上清 6. 在5 ml SD/–Trp液體培養(yǎng)基重新懸浮，用計(jì)數(shù)器計(jì)算細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞密度應(yīng)該≥1 x 10 cells/ml. 7. 融合這些誘餌菌株和你的AD融合文庫(kù)的宿主菌(Section XII.A.4)。 注：Y187 (MATα)能與AH109, HF7c, CG-1945, Y190, or SFY526 (MATa)菌株融合。μ （九）建立一個(gè)cDNA文庫(kù) A. 用BD SMART技術(shù)建立一個(gè)cDNA文庫(kù) 使用BD SMART技術(shù)mrna的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物能被有效的

46、復(fù)制成ds cDNA，由于它可以保持序列的完整性同時(shí)可以高通量產(chǎn)生cDNA，非常適合單雜和雙雜文庫(kù)的構(gòu)建.通過保持器官組織的復(fù)雜性，BD SMART步驟可以提供你檢測(cè)稀有的和潛在的未知相互作用良好機(jī)會(huì)，在酵母單雜和雙雜篩選過程中。 B. BD SMART cDNA 合成與擴(kuò)增是如何進(jìn)行的 在首鏈cDNA合成步驟中，MMLV反轉(zhuǎn)錄酶用于把RNA反轉(zhuǎn)錄成DNA.就cDNA合成的引物RNA，你即可以使用被修正的oligo(dT)引物（CDS III Primer）也可以使用隨機(jī)引物(CDS III/6 Primer). 得到的cDNA文庫(kù)的復(fù)雜性可能不同，主要依賴于你選擇哪種引物.如果

47、你使用CDS III引物，它雜交到poly A RNA的3'末端，在接近5'的反轉(zhuǎn)錄序有稍低的保真性.如果你使用CDS III/6引物替代，隨機(jī)引物可以能雜交到RNA摸板序列的不同部位，你的文庫(kù)應(yīng)該包括很多不同5'- 和3'-端的序列，他們可能被均等的表達(dá)。 MMLV RT遇到摸板的5'末端時(shí)候，酶的末端轉(zhuǎn)移活性就回增加一些額外的核酸到cDNA的3'末端，主要是脫氧胞啶。那么具有oligo(G)序列3'末端的BD SMART III寡核苷與脫氧胞啶骨架配對(duì)，產(chǎn)生一個(gè)延伸摸板。此時(shí)RT轉(zhuǎn)換摸板繼續(xù)復(fù)制到核苷酸的末端。在大部分的合成中，生成的ss cDNA包含有完整的可以與BD SMART

48、III Oligo互補(bǔ)mrna 5'末端，它可以后續(xù)擴(kuò)增作為長(zhǎng)距離PCR的通用引物，僅這些具有BD SMART 5' 末端錨定序列的ss cDNAs可以做為摸板，被LD PCR呈指數(shù)級(jí)擴(kuò)增。 在第二步中，ss cDNA被LD PCR擴(kuò)增產(chǎn)生ds cDNA庫(kù)。Library Construction &Screening Kits 包括一個(gè)免費(fèi)試用包裝BD Advantage(TM)2 PCR Kit，因而你可以產(chǎn)生和擴(kuò)增ds cDNA。BD Advantage 2 Polymerase Mix包括有：BD TITANIUM(TM) Taq DNA Polymerase（沒有n末端檢測(cè)能力

49、的Taq DNA polymerase），適用于hot-start PCR的BD TaqStart(TM) Antibody，少量的具有校正能力的聚合酶。這個(gè)酶可以允許你比普通的PCR更高的保真度來擴(kuò)增cDNA（大約20 kb） Figure 8．使用BD SMART(TM) 技術(shù)高質(zhì)量ds cDNA的合成 C. 良好的實(shí)驗(yàn)室操作 l 帶手套保護(hù)你的RNA 、cDNA摸板免于被核酸酶降解 l 在懸浮液體或者混合反應(yīng)物時(shí)，輕輕上下吸打液體或者輕敲打試管底部。簡(jiǎn)短的把液體甩到試管底部。在懸浮試劑時(shí)不要渦旋震蕩樣品；渦旋震蕩可能震短你的cDNA.。 l 所有的操作在冰上進(jìn)行

50、，除非有其他提示。 l 最后加酶到反應(yīng)混合液中，一定確定通過輕輕的上下戲打混合液試使酶完全混合到反應(yīng)混合物中。 l 不要增加任何反應(yīng)的體積，所有的組分都是為這個(gè)特定體積優(yōu)化的。 l EB是致癌物，在操作與處理這些試劑小心使用。對(duì)于其他信息，參照sambrook et al。BondEx Ethidium Bromide Detoxification Cartridges 可以從BD Biosciences Clontech獲得。 l 苯酚也是常備的，處理含有這個(gè)試劑的溶液時(shí)，一直帶手套穿防護(hù)服。如果可以，在通風(fēng)櫥里處理含有苯酚或氯仿。 l 準(zhǔn)備你的反映時(shí)，使用提供的去離子水，其他的

51、，使用新鮮的不經(jīng)DEPC處理去離子水。避免使用蒸餾水，因?yàn)槟承┱麴s器的循環(huán)蒸汽可能會(huì)導(dǎo)入妨礙PCR的污染物。 l 用0.5 N NaOH 清洗所有的玻璃制品，在用去離子水沖洗，然后在烘箱160–180°C烘烤4-9小時(shí)。 l 處理RNA時(shí)，使用一次性的塑料移液管和槍頭。 D、RNA的分離 l 對(duì)于total RNA和poly A RNA的分離，很多方法是有效的。BD Biosciences Clontech提供幾個(gè)試劑盒用于total RNA的分離和后續(xù)poly A RNA的分離。 l 100 ng或者25 ng poly A RNA 是cDNA合成最少的起始材料，一般來講，你開

52、始有的RNA越多，擴(kuò)增要求的pcr循環(huán)數(shù)越少。更少的熱循環(huán)數(shù)可能更少產(chǎn)生非特異性pcr產(chǎn)物。對(duì)于優(yōu)化cDNA和文庫(kù)的質(zhì)量是非常好的。此時(shí)，如果你的RNA樣本不受限制，請(qǐng)按照表格使用高啟動(dòng)量的RNA。 E. RNA Analysis l 合成的ds cDNA序列完整性、最終的構(gòu)建的cDNA完整性都依賴于實(shí)驗(yàn)起始RNA的質(zhì)量。因此，在第一條合成你使用rna之前，我們推薦，你在變性凝膠上檢測(cè)一個(gè)樣本的RNA，來評(píng)估她的完整性。哺乳動(dòng)物來源的Total RNA因該在4.5 和1.9 kb位置上出現(xiàn)兩個(gè)亮帶（28S 和18S 核糖體RNA），28S 和18S rRNA帶強(qiáng)度比列應(yīng)在1.5–2.5:1

53、。完整的哺乳動(dòng)物poly A RNA也應(yīng)出現(xiàn)弱28S and 18S rRNA的smear帶，在大小分布上應(yīng)該比非哺乳動(dòng)物小。 l 如果，28S RNA 對(duì)18S RNA（對(duì)total RNA）強(qiáng)度比列少于1:1或者你實(shí)驗(yàn)用的poly A RNA明顯的比預(yù)期少。我們建議我們建議你準(zhǔn)備新的ran在核對(duì)了針對(duì)RNase和其他雜質(zhì)的RNase純化試劑后，如果問題在出現(xiàn)，你需要尋找其他來源的組織和細(xì)胞。 l 我們建議你用Human Placenta Poly A RNA作為cDNA合成的陽性對(duì)照，這個(gè)對(duì)照讓你鑒定所有的組分正常工作并讓你從你的RNA樣本合成的ds cDNA的大小和產(chǎn)量。 l

54、在接下來的步驟中，你有選擇首鏈合成的引物，oligo(dT)或者隨機(jī)引物。反應(yīng)條件變化依賴于與使用的引物。 F.使用Oligo (dT)引物合成第一條鏈cDNA 1. 加下列試劑到一個(gè)0.25ml離心管中 2.混合各個(gè)成分并簡(jiǎn)短混合 3. 72°C溫育2min 4. 在冰上放置2min 5. 簡(jiǎn)短的離心 6. 增加下列試劑到反應(yīng)試管中 2.0 μl 5X First-Strand Buffer 1.0 μl DTT (20 mM) 1.0 μl dNTP Mix (10 mM ) 1.0 μl MMLV Reverse Transcriptas

55、e 9.0 μl Total volume 7. 輕輕敲打混合。簡(jiǎn)短離心 8. 42°C溫育10min 9. 加1.0 μl BD SMART III Oligonucleotide 10.在空氣培養(yǎng)廂或者熱蓋熱循環(huán)中42°C溫育一個(gè)小時(shí)。 注：這種溫育你使用水浴或者非熱蓋熱循環(huán)，在你閉上管蓋前，加一滴礦物油覆蓋反應(yīng)混合物。這樣可以阻止因?yàn)檎舭l(fā)引起的水分流失。 11. 75°C，10 min終止試管里的首鏈合成反應(yīng)。 12.在室溫下冷卻，然后加入1.0 μl RNase H。 13. 37°

56、C溫育20min 14.如果你打算直接進(jìn)行LD-PCR步驟，從首鏈合成物取2-μl液體并加入到一個(gè)干凈的、預(yù)冷的、0.5ml試管中，放置在冰上，進(jìn)行到Section H。如果你在首鏈合成中你使用礦物油，避開礦物油從試管底部取2-μl樣品。 15.任何不使用的首鏈反應(yīng)物立即放到–20°C.下。首鏈合成cdna在–20°C保存三個(gè)月。 G. 使用隨機(jī)引物合成首鏈cDNA 1. 加下列試劑到一個(gè)0.25ml離心管中 2. 混合各個(gè)組分，簡(jiǎn)短離心。 3. 72°C 溫育2min 4. 在冰上冷卻2min。 5. 簡(jiǎn)短離心。 6. 離心管放置在室溫下，加入下列組分：

57、 2.0 μl 5X First-Strand Buffer 1.0 μl DTT (20 mM) 1.0 μl dNTP Mix (10 mM ) 1.0 μl MMLV Reverse Transcriptase 9.0 μl Total volume 7. 輕敲混勻，稍微離心 8. 在25–30°C的室溫下，溫育10min。 9. 42°C溫育10min。 10. 加入1.0 μl BD SMART III Oligonucleotide. 11. 在空氣培養(yǎng)箱或者熱蓋PCR儀上，42°C溫育一個(gè)小時(shí)。 注：這種溫育你使用水浴或者非熱蓋

58、熱循環(huán)，在你閉上管蓋前，加一滴礦物油覆蓋反應(yīng)混合物。這樣可以阻止因?yàn)檎舭l(fā)引起的水分流失。 12. 放置反應(yīng)試管75°C、10min，終止首鏈合成。 13.室溫下冷卻，在加1.0 μl（3個(gè)單位）RNase H。 14. 37°C溫育20min。 15. 如果你打算直接進(jìn)行LD-PCR步驟，從首鏈合成物取2-μl液體并加入到一個(gè)干凈的、預(yù)冷的、0.5ml試管中，放置在冰上，進(jìn)行到Section H。如果你在首鏈合成中你使用礦物油，避開礦物油從試管底部取2-μl樣品。 16. 任何不使用的首鏈反應(yīng)物立即放到–20°C.下。首鏈合成cdna在–20°C保存三個(gè)月。 H. LD-PCR

59、擴(kuò)增ds cDNA Table VI 顯示基于首鏈合成使用的RNA的數(shù)量的最優(yōu)的熱循環(huán)數(shù)。較少的循環(huán)數(shù)通常意味著比較少的非特異性PCR產(chǎn)物。使用對(duì)照的Poly A + Human Placenta RNA來確定最優(yōu)的熱循環(huán)數(shù)。不同的摸板和和熱循環(huán)儀對(duì)應(yīng)于不同的參數(shù)。 TABLE VI. RNA數(shù)量和優(yōu)化熱循環(huán)數(shù)之間的關(guān)系 1. 預(yù)熱PCR儀到95°C。 2. 準(zhǔn)備足量的轉(zhuǎn)化的ds cDNA，為每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本建立一個(gè)100-μl PCR體系。為對(duì)照建立一個(gè)反應(yīng)。在每一個(gè)反應(yīng)管中，加入下列試劑： 2 μl First-Strand cDNA 70 μl Deioni

60、zed H2 O 10 μl 10X BD Advantage 2 PCR Buffer 2 μl 50X dNTP Mix 2 μl 5' PCR Primer 2 μl 3' PCR Primer 10 μl 10X GC-Melt Solution 2 μl 50X BD Advantage 2 Polymerase Mix 100 μl Total volume 3. 快速的輕打試管混合。稍微離心以下。 4. 如果必要用兩滴礦物油覆蓋反應(yīng)混合物，閉蓋放到預(yù)熱95°C的熱循環(huán)上。 5.開始循環(huán)反應(yīng)。如果你使用是熱蓋循環(huán)儀器，使用以下程序： a. 參考Tab

61、le V確定最優(yōu)的循環(huán)數(shù)。 b. 設(shè)置循環(huán)儀每個(gè)循環(huán)增加5 sec的延伸時(shí)間。 注：這些參數(shù)對(duì)于非熱蓋循環(huán)儀不是最優(yōu)的。 8. 循環(huán)反應(yīng)結(jié)束，每個(gè)樣品在1.2% agarose/EtBr gel上分析7-μl PCR反應(yīng)物，旁邊加入0.25 μg的1-kb DNA大小的標(biāo)記。Human Placenta Poly A RNA的典型結(jié)果顯示在Appendix A。如果你的PCR不是預(yù)期的結(jié)果，請(qǐng)查閱故障處理。 9. 按照Section I處理，不使用請(qǐng)?jiān)讪C20°C下保藏ds cDNA。 I. 用BD CHROMA SPIN(TM) TE-400柱純化ds cDNA BD CHRO

62、MA SPIN Columns包裹有樹脂，它依據(jù)大小來分離分子。比孔徑大的分子被樹脂阻止，這些分子在離心的時(shí)候能夠快速通過膠床，而比孔徑小的分子被阻止。在接下來的步驟中，BD CHROMA SPIN TE-400 Column被用于選擇>200 bp的DNA分子。關(guān)于更多的BD CHROMA SPIN Columns的信息，請(qǐng)參考BD CHROMA SPIN Columns User Manual (PT1300-1)（ 注：我們推薦離心使用BD CHROMA SPIN Columns在轉(zhuǎn)桶或者水平轉(zhuǎn)頭上。固定角度的轉(zhuǎn)子上也能被使用，但是有一定的風(fēng)險(xiǎn)，有一定比例的樣品從柱子的內(nèi)壁劃過而不是通

63、過凝膠柱，就導(dǎo)致減少或者不穩(wěn)定的純化。每個(gè)實(shí)驗(yàn)或者對(duì)照樣本執(zhí)行下列步驟： 1. 出去BD CHROMA SPIN Column的保護(hù)塑料蓋，反轉(zhuǎn)幾次完全懸浮凝膠柱。每95-μl cDNA樣品使用一個(gè)柱子。 2. 保持BD CHROMA SPIN Column垂直，拇指與食指抓緊break-away end，分開。放spin column到一個(gè)2-ml的離心管中，并彈出top cap。保存top cap 和 white-end cap。 3. 700 x g離心5min。離心后，柱體將出現(xiàn)半干狀.這個(gè)步驟從柱子清除平衡buffer并重新建立柱床。 注：在吊桶轉(zhuǎn)子離心時(shí)候，能放置

64、2ml離心管的柱子能放在17 x 100-mm的聚丙烯管中. 4. 從轉(zhuǎn)子移去spin column和收集管，棄掉收集管和柱子的平衡buffer。 注：當(dāng)從轉(zhuǎn)子移取時(shí)，一直握住BD CHROMA SPIN Column和2-ml離心管。 5. 把spin column放到第二個(gè)2-ml離心管，漫漫的仔細(xì)把你的cDNA樣品加到膠床平面的中心。不要讓任何樣品流到柱子的內(nèi)壁傍邊。 注：尖的、普通的1.5ml離心管可以替代2-ml收集管，這樣就把樣品限制到一個(gè)比較窄的區(qū)域，容易處理。 6. 700 x g離心5min。 7. 從轉(zhuǎn)子中移出spin column和收集管，拆開他們。純化

65、的樣本在收集管的底部。 8. 加所有的重復(fù)實(shí)驗(yàn)樣品到一個(gè)試管中。 9. 加入下列試劑： 1/10 vol. Sodium Acetate (3 M; pH 4.8) 2.5 vol. 95% ethanol (–20°C) 10. 通過前后的搖晃輕輕的混合。 11. 把試管放到–20°C冰箱或者干冰中一個(gè)小時(shí)。（最好：放在–20°C過夜，這樣可以有更好的效果。） 12. 室溫下14,000 rpm離心20min。 13. 仔細(xì)的用移液器移去上清。不要攪動(dòng)小塊沉淀。 14. 稍稍離心，把剩余的液體摔到底部。 15. 小心的吸取液體并讓小塊沉淀空氣干燥10min中。

66、16. 在20 μl去離子水中重新懸浮小塊沉淀，輕輕的混合。這些cDNA現(xiàn)在準(zhǔn)備與pGADT7-Rec 和pGADT7-Rec2在體外重組。繼續(xù)進(jìn)行雙雜文庫(kù)的構(gòu)建，除非你準(zhǔn)備使用，cDNA保存在–20°C下。 十、單雜和雙雜文庫(kù)的建立和篩選 A、為單雜和雙雜篩選建立GAL4 AD融合文庫(kù) 1.你不管是單雜篩選還是雙雜篩選，建立文庫(kù)的方法是同樣的。在兩個(gè)方案中，重組介導(dǎo)克隆被用于BD SMART ds cDNA與GAL4 AD的融合。雖然克隆的方法一樣，但是GAL4 AD克隆載體不一樣。 使用pGADT7-Rec2建立單雜文庫(kù)。 使用pGADT7-Rec建立雙雜文庫(kù)。 pGADT7-Rec2 和pGADT7-Rec在復(fù)制的模式上不一樣。pGADT7-Rec是一個(gè)高拷貝質(zhì)粒，它包括 2 μ的復(fù)制起點(diǎn)，在細(xì)胞周期中踏可以讓載體復(fù)制多次。另一方面，pGADT7-Rec2是一個(gè)低拷貝質(zhì)粒，它包括一個(gè)自主復(fù)制序列，或者ARS元件，它可以讓載體在細(xì)胞周期中復(fù)制一次。pGADT7-Rec2還包括一個(gè)著絲點(diǎn)序列，或