離子交換層析[共54頁]

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1、生物技術(shù)綜合實驗生物技術(shù)綜合實驗Comprehensive experiments of biotechnology 主要內(nèi)容主要內(nèi)容 ContentsContents：一、課程簡介一、課程簡介 核酸的分離與純化核酸的分離與純化 Isolation and Purification of Nucleic Acid二、電泳技術(shù)二、電泳技術(shù) Agarose Gel Elrctrophoresis and SDS-PAGE 三、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)三、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù) Polymerase Chain Reaction四、四、DNADNA序列測定序列測定 DNA Sequencing五、分子雜交技術(shù)

2、五、分子雜交技術(shù) Molecular Hybridization Southern,Northern and Western Blot六、基因文庫和六、基因文庫和cDNAcDNA文庫的構(gòu)建文庫的構(gòu)建 Construction of cDNA Library and DNA Library 七、外源基因的克隆與表達(dá)七、外源基因的克隆與表達(dá) Heterogenic Gene Cloning and Expression八、蛋白質(zhì)的分離、純化技術(shù)八、蛋白質(zhì)的分離、純化技術(shù) Isolation and Purification of Protein1 1 表達(dá)蛋白質(zhì)的分離沉淀表達(dá)蛋白質(zhì)的分離沉淀蛋白質(zhì)

3、分離收集菌體收集菌體洗滌洗滌破碎細(xì)胞破碎細(xì)胞等電沉淀鹽析沉淀高分子物質(zhì)分級沉淀分級沉淀超聲破碎 化學(xué)法 溶菌酶上清液上清液培養(yǎng)基培養(yǎng)基1.1 凝膠過濾層析凝膠過濾又叫分子篩層析，其原因是凝膠小球具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，小分子物質(zhì)能進(jìn)入其內(nèi)部，而大分子物質(zhì)卻被排除在外部。當(dāng)一混合溶液通過凝膠過濾層析柱時，溶液中的物質(zhì)就按不同分子量篩分開了。 凝膠過濾層析柱膠球大小-介質(zhì)離子粗細(xì)影響流動(1) 膠球顆粒有一定大小，一般可分為 corse, medium, fine, super fine 四種粗細(xì) (grade)；越粗的膠體，流率越好，但分辨率越差。 因膠球外面的緩沖液是由膠球表面向內(nèi)擴散，樣本蛋白質(zhì)也是以

4、擴散方式進(jìn)入膠球，再由中心向外擴散出來。膠球半徑越大，擴散距離越大，效果越差。(2) 下圖說明這種擴散介質(zhì)的機制。 而近年來因材料科學(xué)的進(jìn)步，發(fā)展出通透性特強的膠球，緩沖液可直接浸潤而進(jìn)入膠球，不需經(jīng)過擴散作用，是為dispersion彌散式的膠體，效果較好且快速。商品化稱為 perfusion chromatography。 膠球大小膠球大小- -介質(zhì)離子粗細(xì)影響流動介質(zhì)離子粗細(xì)影響流動二、二、 離子交換層析離子交換層析 離子交換層析是在以離子交換劑為固定相，液體為流動相的系統(tǒng)中進(jìn)行的。離子交換劑是由基質(zhì)、電荷基團和反離子構(gòu)成的。離子交換劑與水溶液中離子或離子化合物的反應(yīng)主要以離子交換方式進(jìn)

5、行，或借助離子交換劑上電荷基團對溶液中離子或離子化合物的吸附作用進(jìn)行。兩大類離子交換介質(zhì)兩大類離子交換介質(zhì)由介質(zhì)帶電基團的不同，可分為兩大類： 介質(zhì)帶電基團(counter ion)(1) 陽離子交換介質(zhì) (cation exchanger)： 載體-陰離子基團 . 陽離子(2) 陰離子交換介質(zhì) (anion exchanger)： 載體-陽離子基團 . 陰離子 陽離子： 兩價陽離子 NH4+ K+ Na+ H+ Li+陰離子： I - Br - Cl - HCO3- CH3COO-, OH- 四、四、 親和層析親和層析 親和層析的原理與眾所周知的抗原一抗體、激素一受體和酶一底物等特異性反應(yīng)的

6、機理相類似，每對反應(yīng)物之間都有一定的親和力。在親和層析中是特異的配體才能和一定的生命大分子之間具有親和力，并產(chǎn)生復(fù)合物。實質(zhì)上親和層析是把具有識別能力的配體L（對酶的配體可以是類似底物、抑制劑或輔基等）以共價鍵的方式固化到含有活化基團的基質(zhì)M（如活化瓊脂糖等）上，制成親和吸附劑ML，或者叫做固相載體。而固化后的配體仍保持束縛特異物質(zhì)的能力。特異性配體親和層析法與通用性配體親和層析法特異性配體親和層析法：配體一般為復(fù)雜的生命大分子物質(zhì)（如抗體、受體和酶的類似底物等），它具有較強的吸附選擇性和較大的結(jié)合力。通用性配體親和層析法：配體則一般為簡單的小分子物質(zhì)（如金屬、染料，以及氨基酸等），它成本低廉

7、、具有較高的吸附容量，通過改善吸附和脫附條件可提高層析的分辨率。金屬螯合親和層析a. 許多蛋白分子上帶有金屬離子，則此蛋白質(zhì)可能會吸附該金屬。b. 若把某金屬固定到固相載體上，則此載體將會專一性地吸附需要此金屬的蛋白質(zhì)。c. 基因操作時，經(jīng)常在表達(dá)蛋白質(zhì)的末端加上一段含有六個 His 的片段；則此表達(dá)蛋白質(zhì)，可以吸附到含有鎳的吸著劑上，可以用咪唑流洗出來 。d. 這種載體上結(jié)合有某些可與金屬產(chǎn)生配位鍵的基團 (如 nitrilotriacetic acid)，這些基團與金屬離子結(jié)合 (如鎳離子)后，即可成為親和吸附劑。疏水性層析法(1) 蛋白質(zhì)分子表面有部份疏水性區(qū)域，若在一極性很強的環(huán)境中，

8、則會被吸附在非極性的固定相載體上；若環(huán)境的極性降低，則可被洗脫出來，即為 疏水性層析法 (hydrophobic interaction chromatography, HIC)。(2) HIC 沒有親和層析析法那么強的專一性，較似離子交換法，但所根據(jù)的作用力，則是非極性基團間的疏水性引力。 反相層析法(1) 是 HIC 及離子交換法的綜合體，但屬于一種 partition 層析；可使用離子交換 (或類似 HIC) 的介質(zhì)。(2) 混合極性及非極性溶液為流動相，當(dāng)流動相通入介質(zhì)后，介質(zhì)表面可固定其中的極性溶液 (若使用 HIC 介質(zhì)則固定非極性者)，樣本分子會在此二相中進(jìn)行 partition

9、 分離。(3) 因固定相及流動相的極性剛好相反，故名 reverse phase。離子交換層析樹脂材質(zhì) 疏水性：聚苯乙烯-苯二乙烯親水性：纖維素（cellulose）、葡聚糖凝膠（Sephadex gel）和瓊脂糖凝膠（Sepharose） 特性是具有親水性和較大的表面積，對生物活性物質(zhì)而言，是一個較為溫和的環(huán)境，同時也是大分子所適用的分離純化材質(zhì) 離子交換劑的選擇 保持欲分離物質(zhì)的生物活性。已知等電點的物質(zhì)，在高於等電點的pH條件下，因帶有負(fù)電荷，應(yīng)采用陰離子子交換，在低於等電點的pH下，則采用陽離子交換。未知等電點的物質(zhì)，在一定pH條件下進(jìn)行電泳，向陽極移動較快的物質(zhì)，在同樣條件下可被陰離

10、子交換劑吸附，向陰極移動較快的物質(zhì)可被陽離子交換劑吸附。 緩衝液的選擇緩衝液離子以不干擾分離物活性測定、不影響待測物溶解度、不發(fā)生沉澱為原則；使用陰離子交換纖維時要選用低於交換劑離子 pK值的緩衝液，若欲分離的物質(zhì)屬於酸性，則緩衝液的pH值要高於該物的等電點；用陽離子交換纖維時要選用高於 pK值的緩衝液，目的物屬於鹼性物質(zhì)的話，緩衝液要低於該物等電點的pH值。所使用的緩衝液 pH 只要比樣本蛋白質(zhì)的 pI 稍高或低 1 pH 單位即可 。Donnan Effect 與 pH 變化離子交換介質(zhì)表面的 微環(huán)境 會比緩衝液高或低一個 pH 單位。離子交換樹脂的前處理 離子交換樹脂使用前，先以蒸餾水除

11、去其內(nèi)之雜質(zhì) ，並以NaOH和HCl處理樹脂，使其上的官能基完全露出。再以水清洗至pH 7.0，最後用欲使用的緩衝液浸泡。(1) 離子交換介質(zhì)與蛋白質(zhì)的結(jié)合量有一定限度，稱為該交換介質(zhì)的 容量 (capacity)；若超過此一容量，多出的樣本會直接流出。(2) 交換介質(zhì)的結(jié)合容量大小，受層析條件不同、蛋白質(zhì)種類不同、緩衝液不同、pH 或離子濃度不同等，有很大的差異。 如 DEAE-Sepharose CL-6B 每 100 mL 可結(jié)合 11 克白蛋白，但對 ferritin 只有 0.4 克。介質(zhì)容量有限 可用 pH 或 鹽 梯度洗脫方式有： 連續(xù)梯度 (continuous gradien

12、t) 及 階段梯度 (stepwise gradient)。洗脫洗脫離子交換法操作要點離子交換法操作要點1膠體平衡：用過的膠體要再生完全平衡在緩沖液中；2洗脫方式：通常都以氯化鈉進(jìn)行連續(xù)梯度洗脫；3濃度體積：高低限洗脫液的濃度及體積離子交換層析的應(yīng)用制備、純化生命物質(zhì)測定蛋白質(zhì)等電點凝膠過濾層析凝膠的分類1）葡聚糖凝膠2）瓊脂糖凝膠3）聚丙烯酰胺凝膠凝膠過濾法的應(yīng)用脫鹽和濃縮分離生命物質(zhì)去熱源物質(zhì)（糖蛋白）測定分子量親和層析親和層析法基質(zhì)的選擇理想基質(zhì)：1）極低的非特異吸附性；2）高度親水性3）較好的理化穩(wěn)定性4）具有大量化學(xué)基團，能有效活化，易和配體結(jié)合；5）具有適當(dāng)?shù)亩嗫仔?纖維素、聚丙烯

13、酰胺、交聯(lián)葡聚糖、瓊脂糖、交聯(lián)瓊脂糖、多孔性玻璃珠； 用在蛋白質(zhì)，仍以 聚糖類 為最佳。 以 Sepharose為例，可自行用 CNBr 活化，使糖分子接上 -O-CN (cyanate ester) 基，再與配體上的胺基反應(yīng)。 有些親和層析法使用 spacer arm 來降低配體的立體障礙影響親和層析的因素樣品體積和流速溫度親和層析法的應(yīng)用 1. 核酸的純化：單股DNA與纖維素（cellulose）組合的凝膠，已成為分離mRNA的重要方法之一將單股DNA接在Sepharose上，純化DNA聚合酶或RNA聚合酶。2. 激素受體（receptor）的純化3. 抗體與抗原的純化4. 酶和酶的抑制劑純化液相柱層析總結(jié)介質(zhì)粒子越細(xì)，色析法的 解析力 就越佳，但流動相的流速也就越慢。流速太慢反而會導(dǎo)致解析力變差。