動(dòng)物性食品中六溴環(huán)十二烷和四溴雙酚A含量的測(cè)定編制說(shuō)明

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1、動(dòng)物性食品中六溴環(huán)十二烷和四溴雙酚A含量的測(cè)定 Determination of Hexabromocyclododecane and Tetrabromobisphenol-A in Animal-dereived Food （編制說(shuō)明） 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所 2013年10月 目錄 1 編制過(guò)程----------------------------------------------------------------------------------------3 2 國(guó)內(nèi)外的概況 --------------------------------

2、------------------------------------------------3 3 方法研究?jī)?nèi)容及結(jié)果 -----------------------------------------------------------------------6 3.1 理化特性 --------------------------------------------------------------------------------6 3.2樣品前處理---------------------------------------------------------------

3、---------------6 3.3目標(biāo)物流出體積的確定---------------------------------------------------------------9 3.4流動(dòng)相的選擇---------------------------------------------------------------------------9 3.5質(zhì)譜條件的優(yōu)化----------------------------------------------------------------------10 3.6線性范圍-------------------------

4、-------------------------------------------------------10 3.7標(biāo)準(zhǔn)曲線的相對(duì)響應(yīng)因子---------------------------------------------------------10 3.8檢出限與定量限----------------------------------------------------------------------11 3.9回收率與精密度-----------------------------------------------------------------------1

5、2 3.10方法的可行性------------------------------------------------------------------------12 3.11國(guó)際考核樣驗(yàn)證試驗(yàn)--------------------------------------------------------------13 4 主要參考文獻(xiàn) --------------------------------------------------------------------------------14 1.編制經(jīng)過(guò) “動(dòng)物性食品中六溴環(huán)十二烷和四溴雙酚A的測(cè)定”地方標(biāo)準(zhǔn)制訂項(xiàng)目

6、由湖北省衛(wèi)生與計(jì)劃生育委員會(huì)立項(xiàng)（），該測(cè)定方法的研究由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所承擔(dān)。在充分收集和分析國(guó)內(nèi)外現(xiàn)有資料的基礎(chǔ)上，經(jīng)現(xiàn)場(chǎng)調(diào)研、實(shí)驗(yàn)室方法研究、現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)、資料整理分析統(tǒng)計(jì)，完成征求意見(jiàn)稿。現(xiàn)將該標(biāo)準(zhǔn)方法制訂的依據(jù)作如下說(shuō)明。 2．國(guó)內(nèi)外的概況 六溴環(huán)十二烷(Hexabromocyclododecanes，HBCDs) 和四溴雙酚A (Tetrabromobisphenol A，TBBPA)是世界上消費(fèi)量最大的兩種溴系阻燃劑，廣泛應(yīng)用于聚合物生產(chǎn)、印刷電路板阻燃、建筑隔熱板材、軟墊家具、室內(nèi)裝潢紡織品等領(lǐng)域。2010年全球HBCDs的生產(chǎn)量為23000 噸［1］

7、，2004年TBBPA的全球生產(chǎn)量為170000 噸［2］。HBCDs具有肝臟毒性、神經(jīng)毒性和內(nèi)分泌毒性，可導(dǎo)致老鼠肝臟增重、甲狀腺增大等，而TBBPA是一種潛在的內(nèi)分泌干擾物。 2001年5月聯(lián)合國(guó)環(huán)境規(guī)劃署（United Nations Environment Programme，簡(jiǎn)稱UNEP）在斯德哥爾摩簽署了具有劃時(shí)代的意義關(guān)于持久性有機(jī)污染物(POPs)的國(guó)際公約《斯德哥爾摩公約》，是人類保護(hù)環(huán)境的一個(gè)里程碑[3]。作為阻燃劑市場(chǎng)上最常見(jiàn)的溴系阻燃劑首當(dāng)其充與POPs公約相關(guān)聯(lián)。2013年5月，聯(lián)合國(guó)《關(guān)于持久性有機(jī)污染物的斯德哥爾摩公約》（POPs）投票一致通過(guò)一項(xiàng)禁令：在全球范

8、圍內(nèi)禁止生產(chǎn)和使用六溴環(huán)十二烷（HBCD）。這標(biāo)志著六溴環(huán)十二烷成為繼四溴聯(lián)苯醚和五溴聯(lián)苯醚之后，又一個(gè)列入《公約》禁用化學(xué)制品黑名單的溴系阻燃劑[4]。潛在的POPs還包括，四溴雙酚A(TBBPA)、短鏈氯化石蠟(SCCPs)、溴代二噁英、多氯代萘(PCNs)、德克隆(DP)等[5]。 HBCDs是含有六個(gè)溴原子的環(huán)狀化合物，有多種異構(gòu)體。HBCDs熔點(diǎn)在160～190之間，具有對(duì)熱和紫外光的穩(wěn)定性好、用量低、阻燃效果好和對(duì)材料物理性能影響小等特點(diǎn)；是一種添加型阻燃劑，可以通過(guò)生產(chǎn)、使用和產(chǎn)品的廢棄而進(jìn)入到環(huán)境中，被廣泛用作多溴聯(lián)苯醚(PBDEs)的替代品。歐洲主要用于EPS、XPS、HI

9、PS等及紡織品涂層阻燃處理上。我國(guó)主要用于發(fā)泡聚苯乙烯、聚丙烯纖維、苯乙烯樹脂、聚乙烯、聚碳酸酯等的阻燃添加劑，及對(duì)織物、粘合劑、涂料及不飽和聚酯樹脂進(jìn)行阻燃處理等。研究表明HBCDs具有很強(qiáng)的生物蓄積性和持久性，被認(rèn)為是一種新型的環(huán)境持久有機(jī)污染物，已經(jīng)受到了國(guó)際社會(huì)的廣泛關(guān)注。HBCDs可導(dǎo)致血清甲狀腺激素濃度下降、抑制神經(jīng)遞質(zhì)正常吸收、引起肝組織病理學(xué)改變等生物毒性，歐盟在RoHS中將其定為管控物質(zhì)，ECHA將其歸類為高關(guān)注度物質(zhì)，同時(shí)持久性有機(jī)污染物審查委員會(huì)已將其列入《關(guān)于持久性有機(jī)污染物的斯德哥爾摩公約》。HBCDs普遍存在于環(huán)境中，生長(zhǎng)在格蘭陵(Greenland)和斯瓦爾巴特群

10、島(Savalbard)的北極熊、海鳥及海豹身上均可檢測(cè)到HBCDs。 商品HBCDs由3種非對(duì)映異構(gòu)體(α，β，γ-HBCD )組成，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。其中γ-HBCD 的含量最高，為75%～89%，α-HBCD的含量為10%～13%，β-HBCD的含量為0.5%～12%。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在環(huán)境樣品(土壤、污泥、污水等樣品)中HBCD的主要成分是γ-HBCD，占總HBCD 的60%以上；在空氣中的HBCD 主要為α-HBCD 和γ-HBCD，β-HBCD含量很少；而在水生生物和鳥類體內(nèi)組織里α-HBCD占HBCD總量的80%以上?？梢?jiàn)對(duì)HBCDs的危險(xiǎn)性評(píng)價(jià)需要對(duì)3種異構(gòu)體分別進(jìn)行精確定量。 TBB

11、PA結(jié)構(gòu)中有兩個(gè)活潑的酚羥基，呈強(qiáng)極性,結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖2。TBBPA是目前使用量最大的一種溴系阻燃劑，其總用量約占全球阻燃劑用量的1/3，年消耗量達(dá)120000 T。它被廣泛應(yīng)用于電子電機(jī)設(shè)備中，如印刷電路版和塑料零件中，以強(qiáng)化阻燃防火的功能，全球有超過(guò)70％的電子電機(jī)設(shè)備含有TBBPA。盡管它是反應(yīng)型阻燃劑，但是在產(chǎn)品中仍然有大量的非聚合的TBBP-A存在，并且有可能釋放、污染環(huán)境。由于TBBPA與甲狀腺荷爾蒙(thyroxin，T4)的結(jié)構(gòu)相似，現(xiàn)階段被認(rèn)為是一種潛在的內(nèi)分泌干擾物。有研究表明，TBBPA能夠與人類的轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(transthyretin) (前白蛋白)緊密結(jié)合,是一種免疫

12、毒素。 (a) (b) (c) 圖1 α、β、γ-HBCD結(jié)構(gòu)示意圖，(a) α-HBCD， (b) β-HBCD，(c) γ-HBCD 圖2 TBBPA結(jié)構(gòu)示意圖 2007年6月，挪威污染控制管理局向世界貿(mào)易組織（WTO）通報(bào)提議，一旦產(chǎn)品中某些特定物質(zhì)的含量大于或等于最高限量時(shí)應(yīng)嚴(yán)格控制該類消費(fèi)產(chǎn)品的生產(chǎn)、進(jìn)口、出口和銷售。挪威污染控制管理局發(fā)布了《消費(fèi)性產(chǎn)品中禁用特定有害物質(zhì)》禁令，即PoHS （Prohibition on Certain Hazardous Substances

13、 in Consumer Products）指令，該指令于2007年12月15日通過(guò)，2008年1月1日生效。規(guī)定建議限制的18種物質(zhì)中包括HBCDs和TBBPA，PoHS指令規(guī)定HBCDs的限量為0.1％，TBBPA的限量為1％。我國(guó)目前沒(méi)有HBCDs和TBBPA的限量標(biāo)準(zhǔn)。 目前國(guó)內(nèi)沒(méi)有針對(duì)HBCDs和TBBPA分項(xiàng)單獨(dú)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，HBCDs和TBBPA同時(shí)檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)更是不存在。目前，HBCD的分析方法在前處理方面一般采取酸化硅膠或濃硫酸或凝膠色譜分離法(GPC)除去脂肪，再用硅膠柱/酸化硅膠柱凈化；分析HBCD的結(jié)構(gòu)不難發(fā)現(xiàn)，HBCD呈弱極性，所以洗脫液一般選取弱極性的混合溶劑正己烷:二

14、氯甲烷(1:1，v/v)；儀器檢測(cè)方面，HBCD三種異構(gòu)體的分析測(cè)定基本上是采用LC-MS。TBBPA在針對(duì)水體、土壤、空氣等環(huán)境基質(zhì)方面有較完善的前處理方法，即索式提取后采用固相萃取進(jìn)行純化；而針對(duì)動(dòng)物性基質(zhì)前處理方法的報(bào)道較少。常見(jiàn)的固相萃取(SPE)凈化法利用的是目標(biāo)物極性的不同來(lái)達(dá)到分離的目的，然而TBBPA這種極性強(qiáng)的物質(zhì)會(huì)與硅膠牢固結(jié)合，所以需要采取極性強(qiáng)的有機(jī)溶劑如甲醇、乙腈等來(lái)洗脫。在儀器檢測(cè)方面，LC-MS測(cè)定TBBPA簡(jiǎn)單快捷，且靈敏度較高。 總體來(lái)說(shuō)，目前單獨(dú)對(duì)HBCD和TBBPA的分析方法已經(jīng)較為成熟了。由于兩種物質(zhì)的用途大，用量廣，具有一定的危害且分析檢測(cè)方法相近，

15、故考慮將這兩種物質(zhì)進(jìn)行同時(shí)分析。施致雄等[6]建立了一套同時(shí)測(cè)定動(dòng)物性食品中HBCD和TBBPA的超高效液相色譜-質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)的測(cè)定方法，前處理方面采取自動(dòng)GPC脫脂結(jié)合濃硫酸脫脂的凈化方法，洗脫劑選取正己烷:二氯甲烷(1:1，v/v)，實(shí)驗(yàn)證明方法靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度均符合痕量檢測(cè)的要求；然而凈化方法采取濃硫酸脫脂，可能會(huì)產(chǎn)生安全性、前處理過(guò)程中發(fā)生乳化現(xiàn)象從而影響檢測(cè)結(jié)果等問(wèn)題。 對(duì)于HBCDs和TBBPA這兩類物質(zhì)，由于他們的生物蓄積性和脂溶性，HBCDs和TBBPA隨著食物鏈的延長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生富集現(xiàn)象，處于食物鏈較高點(diǎn)的動(dòng)物和人類體內(nèi)的富集程度相對(duì)環(huán)境基質(zhì)要高，有的甚至高

16、出上千倍。因此，需要建立一個(gè)適合各種食品(主要為動(dòng)物源性食品)的方便、快捷、安全且高靈敏的檢測(cè)方法來(lái)滿足同時(shí)對(duì)HBCD和TBBPA這兩種物質(zhì)的分析要求，以便今后對(duì)這兩種物質(zhì)的檢測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)水平的評(píng)估，保障湖北及全國(guó)動(dòng)物源性食品質(zhì)量安全。本標(biāo)準(zhǔn)在現(xiàn)有的HBCD和TBBPA前處理及分析技術(shù)的基礎(chǔ)上，采取穩(wěn)定性同位素稀釋技術(shù)，在動(dòng)物樣品中加入13C標(biāo)記的HBCD和TBBPA內(nèi)標(biāo)溶液，用索氏提取法提取動(dòng)物基質(zhì)中目標(biāo)化合物，用自制的酸化硅膠固相萃取柱凈化，高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)的多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)(MRM)模式進(jìn)行測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量，實(shí)現(xiàn)了對(duì)TBBPA和三種HBCD(α、β、γ-HBCD

17、)的同時(shí)測(cè)定，從而為HBCD和TBBPA在食物中的分布和風(fēng)險(xiǎn)水平評(píng)估工作奠定基礎(chǔ)。 3 方法研究?jī)?nèi)容及結(jié)果 3.1 理化性質(zhì) 六溴環(huán)十二烷：1,2,5,6,9,10-Hexabro，CAS號(hào)：3194-55-6，分子量：641.70，分子式：C12H18Br6。 四溴雙酚A：3,3,5,5-Tetrabromobi，CAS號(hào)：79-94-7，分子量：543.87，分子式：C15H12Br4O2。 3.2 樣品前處理 采用索氏提取的方法提取樣品，自制酸化硅膠固相萃取柱凈化提取液。 具體操作如下：干凈的固相萃取玻璃柱底部塞一小撮棉花，從下往上依次倒入1 cm的無(wú)水硫酸鈉、5 g硅膠、

18、15 g 44%酸化硅膠、5 g硅膠、1 cm的無(wú)水硫酸鈉。用洗耳球輕震管壁以使填料表面水平，正己烷倒入管內(nèi)排除氣泡后，再用200 mL正己烷活化柱子備用。將提取的樣品旋蒸至近干，用正己烷復(fù)溶，每次2~4 mL，滴入酸化硅膠柱上部，如此重復(fù)清洗燒瓶3~4次，100 mL正己烷淋洗去除多余雜質(zhì)，100 mL正己烷:二氯甲烷混合溶液(1:1，v/v)洗脫，收集洗脫液并旋蒸至近干，再用正己烷復(fù)溶，每次2~4 mL，重復(fù)清洗燒瓶3~4次，轉(zhuǎn)移至10 mL試管，氮?dú)獯蹈珊蠹尤?00 μL甲醇，旋渦振蕩1 min，經(jīng)0.2 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后上機(jī)測(cè)定。 以上提取凈化方法針對(duì)魚肉、雞蛋、牛奶等固體、半固態(tài)

19、和液態(tài)樣品，而對(duì)于油脂樣品，如植物油，則不需要索式提取，直接1~2 mL油樣轉(zhuǎn)入手動(dòng)填充硅膠柱中，加內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液B200μL，100 mL正己烷淋洗去除多余雜質(zhì)，100 mL正己烷:二氯甲烷混合溶液(1:1，v/v)洗脫，收集洗脫液并旋蒸至近干，再用正己烷復(fù)溶，每次2~4 mL，重復(fù)清洗燒瓶3~4次，轉(zhuǎn)移至10 mL試管；氮?dú)獯蹈珊蠹尤?00 μL甲醇，旋渦振蕩1 min，經(jīng)0.2 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后上機(jī)測(cè)定。 本方法動(dòng)物源性食品的提取選擇了傳統(tǒng)的索氏提取方法，索氏提取雖然費(fèi)時(shí)費(fèi)溶劑，但是索氏提取裝置簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)，操作簡(jiǎn)單，洗脫效率與回收率高，也是EPA 3540（索式萃取法）中使用的標(biāo)準(zhǔn)

20、方法。查閱文獻(xiàn)試驗(yàn)對(duì)比了5種凈化方法后，最終采用的是自制酸化硅膠固相萃取柱凈化法。采用理由如下： 在凈化過(guò)程中，去除動(dòng)物源性食品樣品中的油脂是最為重要的一步，如果不能有效地除盡脂肪，會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果且污染儀器；如果在除去油脂的同時(shí)造成了目標(biāo)物的損失同樣會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果?，F(xiàn)階段除脂方法主要分兩類，一類是破壞性方法，如酸化硅膠處理、硫酸處理等；另一類是非破壞性方法，如凝膠滲透色譜(GPC)法，吸附色譜等。絕對(duì)回收率衡量的是整個(gè)的分析方法對(duì)目標(biāo)物會(huì)造成多大的損失。作為痕量分析方法，一般要求其值大于50%。對(duì)于本檢測(cè)方法，能滿足HBCD和TBBPA同時(shí)分析的要求有兩點(diǎn)：一是能將樣品中的油脂能否有效被清除

21、；二是兩種物質(zhì)經(jīng)前處理之后絕對(duì)回收率均能達(dá)到50%以上，以此來(lái)評(píng)判方法的可行與否。在采用金龍魚植物油為空白基質(zhì)，加入HBCD與TBBPA混合標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液B作為模擬樣品，5種凈化方法及效果如下： 方法1 酸化硅膠柱。于干凈的固相萃取玻璃柱底部塞一小撮棉花，從下往上依次倒入1cm的無(wú)水硫酸鈉、5g硅膠、15g 44%酸化硅膠、5g硅膠、1cm的無(wú)水硫酸鈉。用洗耳球輕震管壁以使填料表面水平，倒入正己烷排盡氣泡，再用200mL正己烷活化柱子備用。 將提取的樣品旋蒸至近干，用正己烷復(fù)溶，每次2-4mL，滴入酸化硅膠柱上部，如此重復(fù)清洗燒瓶3-4次，100mL正己烷淋洗去除多余雜質(zhì)，250mL正己烷:二

22、氯甲烷(1:1，v/v)洗脫，收集洗脫液并旋蒸至近干，再用正己烷復(fù)溶，每次2-4mL，重復(fù)清洗燒瓶3-4次，轉(zhuǎn)移至10mL試管，氮?dú)獯蹈珊蠹尤?00μL甲醇，旋渦振蕩1min，經(jīng)0.2μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后上機(jī)測(cè)定。 經(jīng)三次平行測(cè)定知HBCD的絕對(duì)回收率可達(dá)50%以上，但TBBPA的回收率只有15%-30%，主要原因可能是TBBPA有活潑酚羥基的存在，硅膠會(huì)與其牢固結(jié)合，導(dǎo)致洗脫液不能將其有效地洗脫下來(lái)，因此方法1不能滿足分析需要。 方法2 手動(dòng)填裝GPC柱。于燒杯中用甲苯將活化的SX3生物珠混勻震搖至均一的糊狀，立即倒入干凈的玻璃管(50mm×50cm)中，再接著用甲苯將殘留的填料混勻倒入玻

23、璃管，如此重復(fù)多次，待填料沉淀下來(lái)與液相分層后，用環(huán)己烷:乙酸乙酯混合溶液(1:1，v/v)置換出甲苯，備用。 將提取好的樣品用環(huán)己烷:乙酸乙酯混合溶液(1:1，v/v)復(fù)溶，每次2-4mL，滴入GPC柱上部，如此重復(fù)清洗燒瓶3-4次，400mL環(huán)己烷:乙酸乙酯(1:1，v/v)洗脫，收集190-350mL之間的洗脫液(之前的洗脫液中不含目標(biāo)物)，旋蒸至近干，再用正己烷復(fù)溶，每次2-4mL，重復(fù)清洗燒瓶3-4次，轉(zhuǎn)移至10mL試管，氮?dú)獯蹈珊蠹尤?00μL甲醇，旋渦振蕩1min，經(jīng)0.2μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后上機(jī)測(cè)定。 采用該方法時(shí)的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象為接收液旋蒸后燒瓶?jī)?nèi)仍有極少量粘稠油分，在氮吹干過(guò)

24、后現(xiàn)象更加明顯，該現(xiàn)象表明此方法不能完全除盡脂肪，需要進(jìn)行進(jìn)一步凈化才能進(jìn)行后續(xù)測(cè)定。 方法3 濃硫酸處理[6]。將提取好的樣品用正己烷復(fù)溶，每次2-4mL，如此重復(fù)清洗燒瓶3-4次，合并至50mL帶刻度具塞離心管中，加入過(guò)量的濃硫酸，渦旋震蕩1min，3000rpm離心5min，將上層有機(jī)層轉(zhuǎn)移至試管中，旋蒸至近干，再用正己烷復(fù)溶，每次2-4mL，重復(fù)清洗燒瓶3-4次，轉(zhuǎn)移至10mL試管中，氮?dú)獯蹈珊蠹尤?00μL甲醇，旋渦振蕩1min，經(jīng)0.2μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后上機(jī)測(cè)定。 該方法實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象為加入濃硫酸充分搖勻并離心之后，上清液與濃硫酸層中間會(huì)有一層橘黃色的乳狀物出現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)該乳化現(xiàn)象的嚴(yán)重

25、程度與絕對(duì)回收率成負(fù)相關(guān)，采用加鹽去乳化處理會(huì)與濃酸反應(yīng)釋放氣體，導(dǎo)致溶液噴出。分析其原因是由于油分遇到強(qiáng)酸會(huì)發(fā)生乳化現(xiàn)象，導(dǎo)致部分有機(jī)層與濃硫酸層不能有效分離，而加鹽會(huì)與濃硫酸發(fā)生化學(xué)反應(yīng)釋放出氣體。雖然TBBPA和HBCD均對(duì)酸穩(wěn)定，能得到較好的回收率(40%-70%)，但需考慮到不同樣品基質(zhì)復(fù)雜程度不同，若有些樣品遇強(qiáng)酸發(fā)生嚴(yán)重的乳化反應(yīng)，回收率就不一定能滿足分析要求了，況且此方法要多次連續(xù)的進(jìn)行液液萃取操作，耗時(shí)費(fèi)力，強(qiáng)酸處理也容易發(fā)生危險(xiǎn)，所以此方法并不理想。 方法4結(jié)合法。方法2 GPC之后油脂未完全除凈，繼續(xù)采用方法1和方法3，直至油脂完全除凈。 凝膠色譜分離法與濃硫酸法相結(jié)

26、合除脂，先用凝膠色譜除去大量脂肪，接收液再加入濃硫酸去除剩余脂肪，回收率在40%-70%之間，結(jié)果較為理想，但操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不便于大量處理樣品。 方法5自制酸化硅膠固相萃取柱凈化法。通過(guò)理論分析發(fā)現(xiàn)TBBPA的結(jié)構(gòu)中有兩個(gè)活潑的酚羥基，屬于強(qiáng)極性物質(zhì)，TBBPA與硅膠會(huì)緊密結(jié)合，若洗脫液的極性不足以將其洗脫下來(lái)，則目標(biāo)物TBBPA損失很大。制作酸化硅膠時(shí)，酸化后的硅膠已被濃硫酸磺基化，將活潑的氫離子取代，使其喪失了強(qiáng)極性，因此酸化硅膠層不會(huì)與TBBPA發(fā)生牢固的結(jié)合，而未酸化的硅膠層會(huì)強(qiáng)烈地吸附TBBPA，因此對(duì)傳統(tǒng)的酸化硅膠柱(共五層：從下往上依次為無(wú)水硫酸鈉層、硅膠層、酸化硅膠層、

27、硅膠層和無(wú)水硫酸鈉)進(jìn)行了大膽改進(jìn)，將酸化硅膠柱中的硅膠層去除，新型的酸化硅膠柱從下往上依次為：2cm無(wú)水硫酸鈉、15g 44%酸化硅膠(過(guò)量)、2cm無(wú)水硫酸鈉。試驗(yàn)結(jié)果證明，采用這個(gè)凈化方法，HBCD和TBBPA均取得了較為理想的絕對(duì)回收率(50%-80%)；而且此方法簡(jiǎn)單快捷，油脂可以完全去除，能滿足后續(xù)液質(zhì)分析的需要，故采用自制酸化硅膠固相萃取柱進(jìn)行凈化處理。 3.3目標(biāo)物流出體積的確定 手動(dòng)填充的酸化硅膠柱滿柱體積為150 mL，因此設(shè)定150 mL可將目標(biāo)物100%洗脫下來(lái)。在將加標(biāo)的空白基質(zhì)上柱之后，每次加入10 mL洗脫液，分15次加入，編號(hào)為1-15，進(jìn)樣后測(cè)定1-15號(hào)

28、濃縮液中目標(biāo)物的含量。發(fā)現(xiàn)2號(hào)-4號(hào)濃縮液有目標(biāo)物的流出，5號(hào)-8號(hào)有極少量的目標(biāo)物流出，所以，流出體積確定為80 mL，但是為了確保目標(biāo)物完全流出，所以本試驗(yàn)將目標(biāo)物流出體積定為100 mL。 3.4流動(dòng)相的選擇 根據(jù)相關(guān)資料，選擇了Waters BEH C18柱（2.1 mm i.d. ×50 mm，1.7 μm）色譜柱。由于電噴霧質(zhì)譜的電離是在溶液狀態(tài)電離，因此流動(dòng)相的組成和添加劑除了影響目標(biāo)化合物的保留時(shí)間和峰形外，還明顯影響到目標(biāo)化合物的離子化效率。從而影響目標(biāo)化合物的檢測(cè)靈敏度。實(shí)驗(yàn)在滿足較好的色譜分離的同時(shí)，比較了甲醇/乙腈(V/V: 1/1)-水、乙腈-水這2種流動(dòng)相對(duì)目標(biāo)

29、化合物離子化程度的影響。結(jié)果表明，當(dāng)流動(dòng)相為甲醇/乙腈-水時(shí)，響應(yīng)值明顯高于乙腈-水流動(dòng)相時(shí)的響應(yīng)值(約為2～4倍)。因此，實(shí)驗(yàn)選用甲醇/乙腈(V/V: 1/1)-水為流動(dòng)相進(jìn)行80-20等洗脫。 除了考察了流動(dòng)相組成外，還比較了流動(dòng)相為甲醇/乙腈(V/V: 1/1)-水和分別在此流動(dòng)相中加入一定量的醋酸銨和氨水等添加劑對(duì)目標(biāo)化合物離子化效率的影響。當(dāng)加入一定量的醋酸銨或氨水后，目標(biāo)化合物的響應(yīng)值均有所降低，因此，實(shí)驗(yàn)中采用甲醇/乙腈(V/V: 1/1)-水混合液作為流動(dòng)相。 3.5質(zhì)譜條件的優(yōu)化 分析TBBPA，需要用到多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式。首先，利用流動(dòng)注射泵連續(xù)進(jìn)樣。在正離子和

30、負(fù)離子模式下進(jìn)行全掃描以選擇適當(dāng)?shù)姆肿与x子峰和電離方式。結(jié)果表明：在負(fù)離子模式下，全掃描的分子離子[M - H ]- m/z 542.6最理想。因此選用TBBPA的[M -H]-作碰撞誘導(dǎo)解離的母離子。二級(jí)質(zhì)譜圖中，觀察到m/z 447.6、417.8等碎片離子峰。其中m/z 447.6碎片離子是[M- Br-OH ]-，m/z 417.8離子是[M-Br-OH-CO ]-。 分析HBCDS時(shí)，同樣利用流動(dòng)注射泵連續(xù)進(jìn)樣。在正離子和負(fù)離子模式下進(jìn)行全掃描以選擇適當(dāng)?shù)姆肿与x子峰和電離方式。結(jié)果表明：在負(fù)離子模式下，同樣是全掃描的分子離子[M - H ]- m/z 640.7最理想，但是對(duì)于二級(jí)

31、質(zhì)譜，該化合物只能檢測(cè)Br-，所以用選擇離子（SIM）模式即可。但是本著高效的原則，希望和四溴雙酚A同時(shí)檢測(cè)，所以選擇了m/z 78.9和m/z 80.9作為其子離子，與四溴雙酚A一起使用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式。 在確定了母離子和子離子的基礎(chǔ)上，對(duì)毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、離子源溫度、脫溶劑溫度等條件進(jìn)行了優(yōu)化。 3.6線性范圍 以5.0、10.0、50.0、250.0、500.0 ng/mLHBCDs與TBBPA混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，根據(jù)待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)的峰面積比（y）和對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液中待測(cè)物的質(zhì)量（x）進(jìn)行線性回歸，得出線性方程為：TBBPA：y = 0.1013x+0.0930；相關(guān)系數(shù)：R

32、2= 0.9984；α-HBCD：y = 4.2101x - 2.3241；相關(guān)系數(shù)：R2= 0.9999；β-HBCD：y = 0.4612x - 0.5900；相關(guān)系數(shù)：R2= 0.9994；γ-HBCD：y = 0.1929x +0.0519；相關(guān)系數(shù)：R2= 0.9990。 3.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的相對(duì)響應(yīng)因子 計(jì)算線性曲線圖中每個(gè)點(diǎn)上的相對(duì)響應(yīng)因子RRF得出平均相對(duì)響應(yīng)因子(見(jiàn)表1)，計(jì)算公式如下： 公式中：Cs-定量?jī)?nèi)標(biāo)的質(zhì)量； Cn-目標(biāo)化合物的質(zhì)量； An-目標(biāo)化合物的峰面積； As-定量?jī)?nèi)標(biāo)的峰面積。 表1 HBCDs與TBBPA混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液相對(duì)響應(yīng)因子

33、f1 f2 f3 f4 f5 f平均 RSD% TBBPA 39.13 38.38 40.50 41.63 41.88 40.30 3.79 α-HBCD 4.320 4.070 3.970 4.460 4.570 4.280 5.94 β- HBCD 1.984 1.850 1.900 2.050 1.925 1.940 3.98 γ- HBCD 1.120 1.072 1.020 1.102 1.012 1.062 4.63 3.8檢出限與定量限 檢測(cè)限根據(jù)對(duì)基質(zhì)空白的測(cè)定確定噪聲，以3倍噪聲峰高對(duì)應(yīng)的濃

34、度為檢測(cè)限(LOD)。計(jì)算公式如下： 式中：N-噪音峰高，本試驗(yàn)N值為1；MS-加入定量?jī)?nèi)標(biāo)的量； H-定量?jī)?nèi)標(biāo)的峰高；S-脂肪重量。 而以10倍噪聲峰高對(duì)應(yīng)的濃度為定量限(LOQ)。計(jì)算公式如下： 取5g凍干好的肉制樣品(經(jīng)檢測(cè)確定不含TBBPA和HBCD的魚肉樣品)作為不含目標(biāo)物的基質(zhì)樣，加入20 ng內(nèi)標(biāo)(同位素內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用溶液B 200μL)，按前述3.2樣品提取方法提取并凈化處理后，上機(jī)測(cè)定(三組平行，取平均值)。結(jié)果如表2所示。確定HBCD三種異構(gòu)體α-HBCD、β-HBCD和γ-HBCD的檢測(cè)限和定量限分別為0.031、0.102 ng/g，0.009、0.032n

35、g/g，0.017、0.058 ng/g(以脂肪計(jì))；TBBPA的檢測(cè)限和定量限分別為0.031、0.103 ng/g (以脂肪計(jì))。 表2 檢測(cè)限和定量限測(cè)定結(jié)果(ng/g，以脂肪計(jì)) α-HBCD β-HBCD γ-HBCD TBBPA 檢出限 定量限 檢出限 定量限 檢出限 定量限 檢出限 定量限 平行1 0.030 0.099 0.011 0.036 0.018 0.059 0.029 0.097 平行2 0.028 0.094 0.008 0.028 0.017 0.056 0.031 0.104 平行3

36、 0.034 0.113 0.009 0.031 0.018 0.059 0.032 0.108 均值 0.031 0.102 0.009 0.032 0.017 0.058 0.031 0.103 3.9回收率與精密度 采用市售的金龍魚植物油為空白基質(zhì)，在樣品中添加低、中、高三個(gè)不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行HPLC-MS分析，每個(gè)添加水平平行測(cè)定6次?；厥章时硎痉椒ǖ目尚行?，以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)表示方法的重現(xiàn)率即精密度，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果顯示三種HBCD與TBBPA的平均回收率在89.1%-114.0%之間，RSD范圍為5.78%-13.85%之間。表明該方

37、法可行，且精密度良好。 表3 HBCDs和TBBPA的回收率和精密度 加標(biāo) 水平 平均回收率(%) RSD%(n=6) α-HBCD β-HBCD γ-HBCD TBBPA α-HBCD β-HBCD γ-HBCD TBBPA 2ng 103.3 105.8 105.3 102.5 13.85 8.65 12.30 9.11 5ng 100.9 90.3 89.8 89.1 11.19 9.64 8.71 5.78 20ng 90.6 114.0 108.4 103.9 13.41 8.64 7.23 9.45

38、 3.10 方法的可行性 為了驗(yàn)證方法在實(shí)際樣品中的可行性，采用建立的方法，在魚類、肉類、蛋類、乳類這四種實(shí)際的空白樣品(樣品經(jīng)測(cè)定不含目標(biāo)物)中添加質(zhì)量濃度為20 ng的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行HPLC-MS分析，每個(gè)添加水平平行測(cè)定6次。以回收率表示方法的可行性，以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)表示方法的重現(xiàn)性即精密度，結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果顯示三種HBCD與TBBPA的平均回收率在87.5%-114.4%之間，RSD范圍為4.73%-13.24%之間，表明該方法可行，且精密度良好。 表4 實(shí)際樣品中加標(biāo)回收結(jié)果 實(shí)際樣品 平均回收率(%) RSD%(n=6) α-HBCD β-HBCD γ-HBCD

39、 TBBPA α-HBCD β-HBCD γ-HBCD TBBPA 魚類 101.9 97.4 99.6 114.4 12.34 7.78 9.12 8.31 肉類 89.9 108.7 102.1 94.4 6.82 12.36 11.77 7.73 蛋類 104.3 97.1 87.5 98.3 10.01 5.51 13.24 9.71 奶類 106.7 113.4 92.7 92.8 7.92 4.73 11.74 9.12 3.11國(guó)際考核樣品驗(yàn)證試驗(yàn) 采用所建立的方

40、法，測(cè)定了從挪威采購(gòu)的鱒魚肉(trout)樣品，并用此方法測(cè)得的樣品值與2010年挪威公共衛(wèi)生學(xué)院組織的食品中PCBs, PBDEs and HBCD試驗(yàn)室間比對(duì)試驗(yàn)得出的均值進(jìn)行了比對(duì)。樣品中α，β，γ-HBCD、TBBPA及相應(yīng)的同位素內(nèi)標(biāo)的色譜圖如圖3所示。檢測(cè)結(jié)果均以濕重計(jì)，結(jié)果如表5所示。采用本方法分析的結(jié)果與國(guó)際不同試驗(yàn)室的均值相接近，說(shuō)明本方法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，該分析方法可行。但實(shí)測(cè)值均低于國(guó)際均值，其原因可能是：同時(shí)分析兩種物質(zhì)時(shí)，前處理方法的目標(biāo)物損失率較單獨(dú)分析HBCDs稍高。 7 4 6 3 1 5 2 圖3 挪威鱒魚樣品中HBCD異構(gòu)體、TBBPA及同位

41、素內(nèi)標(biāo)的色譜圖 1- 13C-TBBPA；2- 13C-α-HBCD；3- 13C-β-HBCD；4- 13C-γ-HBCD； 5- α-HBCD ；6- β-HBCD ；7- γ-HBCD 。 表5本方法對(duì)HBCD & TBBPA的實(shí)測(cè)值與2010年國(guó)際比對(duì)考核中鱒魚樣品均值的比較 目標(biāo)物質(zhì) 本方法實(shí)測(cè)值(pg/g) 國(guó)際均值(pg/g) α-HBCD β-HBCD γ-HBCD TBBPA 15864 176 422 0 19014 192 440 0 4. 參考文獻(xiàn) [1] 焦杏春，路國(guó)慧，王曉春，等． 環(huán)境中溴系阻燃劑六溴環(huán)十二烷的

42、水平及分析進(jìn)展［J］． 巖礦測(cè)試，2012，31( 2) : 210-217. [2] Birnbaum L S，Staskal D F． Brominated flame retardants: Cause for concern?［J］． Environ Health Perspect，2004，112( 1) : 9-17. [3] 江桂斌. 持久性有機(jī)化學(xué)污染物(POPs)的定性與定量分析[J]. 分析試驗(yàn)室, 2003, 22. [4] 中國(guó)POPs科技網(wǎng). :// china- [5] 董亮, 張秀藍(lán), 史雙昕, 許鵬軍等. 新型持久性有機(jī)污染物分析方法研究進(jìn)

43、展[J]. 中國(guó)科學(xué), 2013, 43(03): 336-350. [6] 施致雄. 食品中六溴環(huán)十二烷和四溴雙酚A的檢測(cè)技術(shù)與暴露評(píng)估[D]. 北京: 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心營(yíng)養(yǎng)與食品安全所, 2009. 驗(yàn)證報(bào)告 方法名稱：動(dòng)物性食品中六溴環(huán)十二烷和四溴雙酚A的測(cè)定 驗(yàn)證單位：湖北省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心 報(bào)告日期：2013年10月21日 方法名稱：動(dòng)物性食品中六溴環(huán)十二烷和四溴雙酚A的測(cè)定 一、 樣品與樣品前處理 樣品前處理： 魚類樣品，取其可食用部分約50g，經(jīng)勻漿機(jī)勻漿后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，于-20℃冰箱中冷凍24h，轉(zhuǎn)移至冷凍干燥機(jī)中干燥24h，將干燥后的固體樣品

44、切成小塊備用。準(zhǔn)確稱取3g(精確到0.001)冷凍干燥魚肉樣品,置于纖維素套筒中，加入內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液B200μL（100 ng/mL）和適量無(wú)水硫酸鈉，正己烷:丙酮混合溶液(1:1，v/v)作為提取劑，在50-70℃的溫度下，用索氏提取裝置提取24h。提取液充分旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后放置過(guò)夜備用。 凈化方法： 固相萃取玻璃柱底部塞一小撮棉花，從下往上依次倒入2cm的無(wú)水硫酸鈉、15g 44%酸化硅膠(過(guò)量)、2cm的無(wú)水硫酸鈉。用洗耳球輕震管壁，正己烷倒入管內(nèi)排除氣泡后，用200mL正己烷活化柱子。選擇過(guò)夜后的樣品用正己烷復(fù)溶，每次3 mL，滴入活化好的固相萃取玻璃柱上部，如此重復(fù)清洗燒瓶4次，1

45、00 mL正己烷淋洗去除多余雜質(zhì)，100mL正己烷:二氯甲烷混合溶液(1:1，v/v)洗脫，收集洗脫液并旋蒸至近干后用正己烷復(fù)溶，每次3mL，重復(fù)清洗燒瓶3次，轉(zhuǎn)移至10mL試管，氮?dú)獯蹈珊蠹尤?00μL甲醇，旋渦振蕩1min，經(jīng)0.2 μm有機(jī)針頭過(guò)濾器過(guò)濾后用上機(jī)測(cè)定。 二、 分析條件 UPLC條件： a） 色譜柱：Eclipse Plus C18, 100 mm×2.1 mm（i.d.），粒度1.8 μm； b） 柱溫：50 oC； c） 流速：0.3mL/min； d） 進(jìn)樣量：5 μL； e） 樣品室溫度：10℃ f） 流動(dòng)相：A相：甲醇:乙腈混合溶液 (1:1，v/

46、v)，B相：超純水。80-20等度洗脫。 質(zhì)譜條件： a） 離子源：電噴霧離子源； a) 電離方式：ESI-； b) 檢測(cè)方式：MRM； c) 氣體溫度（Gas Temp）：350℃； d) 氣體流量（Gas Flow）：14 L/min； e) 壓力（Nebulizer）：43 psi； f) 鞘氣溫度（Sheath Gas Temp）：300℃； g) 鞘氣流量（Sheath Gas Flow）：9 L/min； h) 毛細(xì)管電壓（Capillary）：4000 V； i）噴嘴電壓（Nozzle Voltage）：1900 V； j）離子源溫度（Ion Temp）：

47、120℃； k）監(jiān)測(cè)離子、碰撞能量和錐孔電壓（見(jiàn)表2）： 表2 六溴環(huán)十二烷和四溴雙酚A的多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)分析參數(shù) 監(jiān)測(cè)離子對(duì) （Channel Reaction）（m/z） 駐留時(shí)間 （Dwell）（ms） 錐孔電壓（Frag）(V) 碰撞能量 （Collision Energy）(V) 四溴雙酚A *542.8 ／ 447.6 50 170 30 542.8 ／ 417.8 50 170 38 六溴環(huán)十二烷 *640.7 ／ 78.9 50 80 10 640.7 ／ 80.9 50 80 10 *為定量離子對(duì) 三、 工作曲線

48、及平均響應(yīng)因子 目標(biāo)物 線性方程 線性范圍（ng） 相關(guān)系數(shù) r 平均響應(yīng)因子RRF RSD% α-HBCD y = 4.2621x-2.3657 0.25-100 0.9998 4.322 4.23 β- HBCD y = 0.4653x - 0.5829 0.25-100 0.9997 1.911 2.95 γ- HBCD y = 0.2001x +0.0531 0.25-100 0.9992 1.053 4.68 TBBPA y = 0.1042x+0.0927 0.25-100 0.9989 39.923 3.49 四、 精

49、密度和回收率 目標(biāo)物 添加濃度（μg/mL食用油） RSD（n=6,%） 平均回收率（%） α-HBCD 2 6.0 94.6 20 4.1 101.8 β- HBCD 2 9.2 62.8 20 7.2 103.6 γ- HBCD 2 4.2 109.4 20 7.5 97.4 TBBPA 2 11.8 97.5 20 9.2 100.2 五、 實(shí)際樣品的測(cè)定 目標(biāo)物 樣品一（豬肉） 樣品二 （鯽魚肉） 樣品五 （草魚肉） 樣品六 （牛肉） 樣品三 （牛奶） 樣品四 （雞蛋）

50、α-HBCD 1.2562 0.5591 ND 0.1387 0.0992 0.2553 β- HBCD 0.0091 0.0662 ND ND 0.0182 0.067 γ- HBCD 0.0234 0.3922 1.5051 ND 0.0453 ND TBBPA 0.1282 1.4243 6.7012 ND 0.1011 ND 單位：ng/g 以脂肪計(jì) ND：沒(méi)有檢測(cè)出來(lái) 六、 檢出限 物質(zhì) LOD(pg/g,以脂肪計(jì)) α-HBCD 0.032 β- HBCD 0.007 γ- HBCD 0.023 TBBP

51、A 0.036 驗(yàn)證報(bào)告 方法名稱：動(dòng)物性食品中六溴環(huán)十二烷和四溴雙酚A的測(cè)定 驗(yàn)證單位：湖北省疾控中心 報(bào)告日期：2013年11月20日 方法名稱：動(dòng)物性食品中六溴環(huán)十二烷和四溴雙酚A的測(cè)定 一、樣品與樣品前處理 秤取冷凍干燥豬肉樣品3g左右，將濾膜放入索氏抽提裝置中，放入冷凍干燥豬肉樣品的同時(shí)加入100 ng/mL的13C12-六溴環(huán)十二烷標(biāo)準(zhǔn)和13C12-四溴雙酚A混合標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用溶液B 200 μL作為內(nèi)標(biāo)，同時(shí)加入無(wú)水硫酸鈉適量。用300mL正己烷和丙酮（1:1，體積比）提取18-24h，回流速度控制在4次～6次/h。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮提取液至盡干，放置過(guò)夜后測(cè)定脂肪含量。用

52、正己烷復(fù)溶，再次濃縮至2~3mL備用。手動(dòng)填充硅膠柱凈化：在固相萃取玻璃柱從下往上填入2 cm無(wú)水硫酸鈉，15 g 44% 酸化硅膠，2 cm無(wú)水硫酸鈉，用洗耳球輕震使填料界面水平，加入正己烷排掉氣泡，加入200 mL正已烷。將上述用2~3mL正己烷復(fù)溶的樣品，滴入手動(dòng)填充硅膠柱中，并用正己烷反復(fù)洗燒瓶3次。用100 mL正己烷淋洗，然后用100 mL正己烷：二氯甲烷體積比1:1的混合液洗脫，收集所有洗脫液并旋轉(zhuǎn)至近干，每次用3 mL正己烷復(fù)溶，如此反復(fù)3-4次，轉(zhuǎn)移至10 mL試管，氮?dú)獯蹈珊蠹尤?00 μL甲醇，旋渦振蕩后經(jīng)0.2 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后上機(jī)測(cè)定。 二、分析條件 UPLC條

53、件：Waters BEH C18柱（2.1 mm i.d. ×50 mm，1.7 μm）, 柱溫：50℃；樣品池溫度：10℃；進(jìn)樣體積：5μL；流速：0.3 mL/min；流動(dòng)相：A液為甲醇：乙腈混合液(1：1，v/v)，B液為超純水，80-20等度洗脫。 質(zhì)譜參數(shù)：離子源：電噴霧電離源，負(fù)電離模式(ESI (-))。毛細(xì)管電壓：4.00 kV，錐孔電壓: HBCD為80V，TBBPA為170V。噴霧器壓力：42psi。源溫度: 120℃；脫溶劑溫度：325℃。脫溶劑氣：N2，800L/h；反吹氣流量：N2，50L/h。碰撞氣：Ar，0.2mL/min。檢測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)。

54、HBCD、TBBPA、13C-HBCD和13C-TBBPA的監(jiān)測(cè)母離子、子離子以及定量離子如表1所示。 表1 目標(biāo)化學(xué)物質(zhì)譜定量參數(shù) 化合物 母離子 m/z 子離子m/z 定量離子 m/z HBCD 640.7 78.9，80.9 80.9 TBBPA 542.6 447.6，417.8 447.6 13C-HBCD 652.7 78.9，80.9 80.9 13C-TBBPA 554.6 459.6，429.8 459.6 三、工作曲線 以5.0、10.0、50.0、250.0、500.0 ng/mLHBCDs與TBBPA混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，根據(jù)

55、待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)的峰面積比（y）和對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液中待測(cè)物的質(zhì)量（x）進(jìn)行線性回歸，內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度為50 ng/mL，用標(biāo)準(zhǔn)溶液系列建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。根據(jù)濃度與峰面積關(guān)系，得到RRF值。經(jīng)計(jì)算，α-、β-、γ-HBCDs與TBBPA的RRF值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.21%-6.67%，滿足檢測(cè)要求。 四、精密度和回收率 以金龍魚植物油為空白基質(zhì)，抽提時(shí)加入HBCDs與TBBPA的標(biāo)準(zhǔn)溶液和同位素標(biāo)準(zhǔn)液各15 ng，其它按照以上試驗(yàn)方法處理，平行5份，測(cè)定HBCDs與TBBPA的回收率在85%-113%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.6%-13.1%。 表1 HBCDs和TBBPA的精密度和回收率結(jié)果 添

56、加量（ng） 測(cè)定量 平均值（ng） 標(biāo)準(zhǔn)偏差 RSD% 回收率 15 α-HBCD 14.1 5.6 91-102 β-HBCD 15.3 13.1 89-113 γ-HBCD 14.5 9.2 87-105 TBBPA 13.8 8.0 85-101 五、方法檢出限 按照分析步驟，連續(xù)測(cè)定5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液，計(jì)算測(cè)定濃度的標(biāo)準(zhǔn)差，按照3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算得方法的檢出限。 α-HBCD、β-HBCD、γ-HBCD和TBBPA的儀器檢出限為0.5、0.1、0.3和0.5 ng/mL，本方法對(duì)α-HBCD、β-HBCD、γ-HBCD和TBB

57、PA的檢出限分別為0.035、0.009、0.022和0.036ng/g(以脂肪計(jì))。 驗(yàn)證報(bào)告 方法名稱：動(dòng)物性食品中六溴環(huán)十二烷和四溴雙酚A的測(cè)定 驗(yàn)證單位：湖北省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院 報(bào)告日期：2013年11月21日 方法名稱：動(dòng)物性食品中六溴環(huán)十二烷和四溴雙酚A的測(cè)定 一、樣品及前處理 牛奶 50 mL，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，于-80℃冰箱中冷凍4 h，轉(zhuǎn)移至冷凍干燥機(jī)中干燥24 h得牛奶固體。將濾膜和PUF放入索氏抽提裝置中，同時(shí)將冷凍干燥后得到的牛奶固體研碎并全部轉(zhuǎn)移至玻璃纖維套筒中并加入13C標(biāo)記HBCDs和TBBPA混合內(nèi)標(biāo)溶液B 200 μL，用正己烷和丙酮（1:1

58、，體積比）提取18-24h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至盡干，放置過(guò)夜后測(cè)定脂肪含量，用4 mL正己烷復(fù)溶樣品。手動(dòng)填充固相萃取柱：固相萃取玻璃柱底部塞一小撮棉花，從下往上依次倒入2 cm無(wú)水硫酸鈉、15 g 44%酸化硅膠、2 cm無(wú)水硫酸鈉。用洗耳球輕震管壁以使填料表面水平，正己烷倒入管內(nèi)排除氣泡后用100 mL正己烷活化柱子。正己烷復(fù)溶的樣品滴入手動(dòng)填充柱內(nèi)，并用正己烷反復(fù)清洗燒瓶3次，先用100 mL正己烷去除雜質(zhì)，再用100 mL正己烷:二氯甲烷混合溶液(1:1，v/v)洗脫，收集洗脫液并旋蒸至近干，再用正己烷復(fù)溶，反復(fù)3次正己烷清洗燒瓶轉(zhuǎn)移至10 mL試管，氮?dú)獯蹈珊蠹尤爰状?00 μL，渦輪震

59、蕩后果針頭有機(jī)濾膜（0.2 μm），HBLC-MS/MS分析用。 二、分析條件 液相條件色譜柱：Waters BEH C18柱（2.1 mm i.d. ×50 mm，1.7 μm）；柱溫：50℃；樣品池溫度：10℃；進(jìn)樣體積：5 μL；流動(dòng)相：A液為甲醇-乙腈混合液（1：1，v/v），B液為超純水，等度洗脫；流速：0.3 mL/min。 質(zhì)譜參數(shù)離子源：電噴霧電離（ES I（-））；檢測(cè)方式：MRM；毛細(xì)管電壓：4.00 kV；錐孔電壓:：六溴環(huán)十二烷為80 V，四溴雙酚A為170 V；噴霧器壓力：42 psi；源溫度： 120℃；脫溶劑溫度：350℃；脫溶劑氣：N2，800 L/h；反

60、吹氣流量：N2，50 L/h；碰撞氣：Ar，0.2 mL/min；六溴環(huán)十二烷：母離子m/z 640.7、子離子m/z 78.9（[79Br]-）、m/z 80.9（[81Br]-）；13C12-六溴環(huán)十二烷：母離子m/z 652.7、子離子m/z 78.9、m/z 80.9；定量離子：六溴環(huán)十二烷和13C12-六溴環(huán)十二烷均為m/z 80.9；四溴雙酚A：母離子m/z 542.6、子離子m/z 447.6 ([M-Br-OH ]-)、m/z 417.8（[M-Br-OH-CO]-）；13C12-四溴雙酚A：母離子m/z 554.6、子離子m/z 459.6；定量離子：四溴雙酚A為m/z 44

61、7.6，13C12-四溴雙酚A均為m/z 459.6。 三、工作曲線 用標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，即六溴環(huán)十二烷異構(gòu)體和四溴雙酚A的濃度分別為5.0、10.0、50.0、250.0、500.0 ng/mL，內(nèi)標(biāo)濃度為50.0 ng/mL建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。根據(jù)濃度與峰面積關(guān)系，得到RRF值。經(jīng)計(jì)算，HBCDs與TBBPA的RRF值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.01%-9.98%，滿足要求。 四、精密度和回收率 取福臨門食用油作為空白基底，抽提時(shí)加入HBCDs和TBBPA標(biāo)準(zhǔn)混合液和帶13C標(biāo)記HBCDs和TBBPA內(nèi)標(biāo)。測(cè)定方法為：量取植物油1mL(油重約0.8g)，加入一定量的待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)10ng(同位素內(nèi)

62、標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用溶液B100μL)，其他按照以上試驗(yàn)方法，平行5份，測(cè)定同位素內(nèi)標(biāo)的回收率在62-103%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.4-14.7%之間（見(jiàn)表1）。 表1 精密度和回收率結(jié)果 加標(biāo) 水平 平均回收率(%) RSD%(n=5) α-HBCD β-HBCD γ-HBCD TBBPA α-HBCD β-HBCD γ-HBCD TBBPA 1 ng 104.1 101.3 104.9 106.2 11.95 9.07 11.20 8.27 10 ng 98.6 94.1 90.0 92.2 10.38 9.45 7.96 6.33

63、 五、樣品穩(wěn)定性試驗(yàn) 隨機(jī)選擇前處理過(guò)的兩份樣品，分成4組并分別加入濃度為100 ng/mL 13C12記HBCDs和TBBPA標(biāo)準(zhǔn)溶液B，然后分別置于-20 ℃和4 ℃環(huán)境中保存，于放置的當(dāng)天、3天、5天、7天各測(cè)定含量，每組樣品測(cè)定三次，結(jié)果取平均值并與第1天比較，數(shù)據(jù)見(jiàn)表2和表3。第七天樣品在-20 ℃和4 ℃環(huán)境中降解率2.3%和3.9%，降解率均＜5%，表明樣品可在-20 ℃和4 ℃環(huán)境中都能保存7d，但-20 ℃降解率更小。 表2 -20 ℃環(huán)境中HBCDs和TBBPA穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 保存時(shí)間（天） 樣品數(shù)量 測(cè)得平均濃度（ng/mL） 降解率（%） 1 2

64、91.72 — 3 2 90.89 0.9 5 2 89.70 2.2 7 2 89.61 2.3 表3 4 ℃環(huán)境中HBCDs和TBBPA穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 保存時(shí)間（天） 樣品數(shù)量 測(cè)得平均濃度（ng/mL） 降解率（%） 1 2 91.19 — 3 2 91.15 0.4 5 2 90.28 1.0 7 2 87.63 3.9 六、方法檢出限和定量限 取5g確定不含TBBPA和HBCD的魚肉凍干樣品，加入20ng內(nèi)標(biāo)，按前述提取方法提取并凈化處理后上機(jī)測(cè)定(做三組平行，取平均值)。結(jié)果如表4所示。 本方法對(duì)α-HBC

65、D、β-HBCD、γ-HBCD和TBBPA的檢出限分別為0.030、0.008、0.016和0.032 ng/g(以脂肪計(jì))；α-HBCD、β-HBCD、γ-HBCD和TBBPA的定量限分別是0.097、0.032、0.058、0.103ng/g(以脂肪計(jì))。 表4 檢測(cè)限和定量限測(cè)定結(jié)果(ng/g，以脂肪計(jì)) 檢出限 定量限 α-HBCD β-HBCD γ-HBCD TBBPA α-HBCD β-HBCD γ-HBCD TBBPA 平行1 0.028 0.008 0.016 0.029 0.092 0.035 0.058 0.099 平行2 0.030 0.009 0.016 0.034 0.094 0.029 0.059 0.102 平行3 0.032 0.009 0.017 0.031 0.106 0.032 0.058 0.108 均值 0.030 0.008 0.016 0.032 0.097 0.032 0.058 0.103