高中生物選修一 植物組織培養(yǎng)技術(shù)

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1、2021/6/301 一、植物組織培養(yǎng)的概念一、植物組織培養(yǎng)的概念 1. 1. 概概 念念 植物組織培養(yǎng)（植物組織培養(yǎng)（Plant tissue culturePlant tissue culture）廣義上是指無菌條件下，在特定的培養(yǎng)基上廣義上是指無菌條件下，在特定的培養(yǎng)基上對(duì)離體的植物器官、組織、細(xì)胞和原生質(zhì)體對(duì)離體的植物器官、組織、細(xì)胞和原生質(zhì)體甚至包括完整植株進(jìn)行培養(yǎng)的技術(shù)。甚至包括完整植株進(jìn)行培養(yǎng)的技術(shù)。2021/6/302 2.2.主要特征主要特征 （1 1）在培養(yǎng)）在培養(yǎng)容器中容器中進(jìn)行；進(jìn)行； （2 2）無菌無菌培養(yǎng)環(huán)境，排除了微生物如真菌、細(xì)菌以及害蟲培養(yǎng)環(huán)境，排除了微生物如

2、真菌、細(xì)菌以及害蟲等的侵入；等的侵入； （3 3）各種環(huán)境因子如營(yíng)養(yǎng)因子、激素因子以及光照、溫度）各種環(huán)境因子如營(yíng)養(yǎng)因子、激素因子以及光照、溫度等物理因子處于等物理因子處于人工控制人工控制之下，并可達(dá)到最適條件。之下，并可達(dá)到最適條件。 （4 4）通常打破了正常的植物發(fā)育過程和格局；）通常打破了正常的植物發(fā)育過程和格局； （5 5）隨著單細(xì)胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)植物顯）隨著單細(xì)胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)植物顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行操作成為可能。微結(jié)構(gòu)進(jìn)行操作成為可能。2021/6/303 二、植物組織培養(yǎng)類型：二、植物組織培養(yǎng)類型： 根據(jù)不同分類的依據(jù)可以分為不同類型。根據(jù)不同分類的依據(jù)可以分

3、為不同類型。 根據(jù)培養(yǎng)材料不同分為：根據(jù)培養(yǎng)材料不同分為： （1 1）完整植株培養(yǎng)：對(duì)幼苗和較大植株等的培養(yǎng)。）完整植株培養(yǎng)：對(duì)幼苗和較大植株等的培養(yǎng)。 （2 2）胚胎培養(yǎng)：包括成熟胚、幼胚、子房、胚珠等的培養(yǎng)。）胚胎培養(yǎng)：包括成熟胚、幼胚、子房、胚珠等的培養(yǎng)。 （3 3）器官培養(yǎng)：包括離體根、莖、葉、果實(shí)、種子、花的培養(yǎng)。）器官培養(yǎng)：包括離體根、莖、葉、果實(shí)、種子、花的培養(yǎng)。 （4 4）組織培養(yǎng)：如分生組織、薄壁組織、輸導(dǎo)組織培養(yǎng)。）組織培養(yǎng)：如分生組織、薄壁組織、輸導(dǎo)組織培養(yǎng)。 （5 5）細(xì)胞培養(yǎng)：對(duì)單細(xì)胞或較小的細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行培養(yǎng)。）細(xì)胞培養(yǎng)：對(duì)單細(xì)胞或較小的細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行培養(yǎng)。 （6 6）原生

4、質(zhì)體培養(yǎng)：對(duì)去掉細(xì)胞壁后所獲得的原生質(zhì)體進(jìn)行培養(yǎng)）原生質(zhì)體培養(yǎng)：對(duì)去掉細(xì)胞壁后所獲得的原生質(zhì)體進(jìn)行培養(yǎng)2021/6/304矮牽牛莖尖離體培養(yǎng)培矮牽牛莖尖離體培養(yǎng)培養(yǎng)養(yǎng)2021/6/305人參細(xì)胞人參細(xì)胞懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)三、植物組織培養(yǎng)技術(shù)的理論基礎(chǔ)三、植物組織培養(yǎng)技術(shù)的理論基礎(chǔ) 植物細(xì)胞的全能性植物細(xì)胞的全能性(Plant cellular totipotency） 從理論上講，植物體的每個(gè)生活從理論上講，植物體的每個(gè)生活細(xì)胞都具有細(xì)胞都具有該植物體的全部遺傳信息，在特定的離體培養(yǎng)條該植物體的全部遺傳信息，在特定的離體培養(yǎng)條件下，具有發(fā)育成完整植株的潛在能力。件下，具有發(fā)育成完整植株的潛在能力

5、。 分化、脫分化與再分化：分化、脫分化與再分化：分化是指?jìng)€(gè)體發(fā)育分化是指?jìng)€(gè)體發(fā)育過程中，不同部位的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理功能發(fā)過程中，不同部位的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理功能發(fā)生改變，形成不同組織或器官。生改變，形成不同組織或器官。 脫分化也稱去分化，是指離體條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞、組脫分化也稱去分化，是指離體條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞、組織或器官逐漸失去原來的結(jié)構(gòu)和功能而恢復(fù)分生能力，形織或器官逐漸失去原來的結(jié)構(gòu)和功能而恢復(fù)分生能力，形成無組織結(jié)構(gòu)的細(xì)胞團(tuán)或愈傷組織的過程。再分化是由脫成無組織結(jié)構(gòu)的細(xì)胞團(tuán)或愈傷組織的過程。再分化是由脫分化形成的愈傷組織重新分化出特定細(xì)胞、組織和器官的分化形成的愈傷組織重新分化出特定細(xì)胞

6、、組織和器官的過程。過程。 細(xì)胞全能性的表達(dá)：細(xì)胞全能性的表達(dá)：盡管理論上每個(gè)細(xì)胞都具盡管理論上每個(gè)細(xì)胞都具有全能性，但實(shí)際表達(dá)難易程度卻隨有全能性，但實(shí)際表達(dá)難易程度卻隨植物種類、植物種類、組織和細(xì)胞的不同而異。組織和細(xì)胞的不同而異。2021/6/3081 1 實(shí)驗(yàn)室設(shè)置及儀器設(shè)備實(shí)驗(yàn)室設(shè)置及儀器設(shè)備2 2 實(shí)驗(yàn)基本操作實(shí)驗(yàn)基本操作3 3 培養(yǎng)基的成分及其配制培養(yǎng)基的成分及其配制4 4 培養(yǎng)條件的選擇培養(yǎng)條件的選擇2021/6/3091 1 實(shí)驗(yàn)室設(shè)置及儀器設(shè)備實(shí)驗(yàn)室設(shè)置及儀器設(shè)備 實(shí)驗(yàn)室是進(jìn)行組培研究的主要場(chǎng)所，應(yīng)實(shí)驗(yàn)室是進(jìn)行組培研究的主要場(chǎng)所，應(yīng)能滿足清洗、培養(yǎng)基制備、儲(chǔ)藏、無菌能滿足清

7、洗、培養(yǎng)基制備、儲(chǔ)藏、無菌操作、培養(yǎng)、鑒定等多方面的工作。操作、培養(yǎng)、鑒定等多方面的工作。2021/6/3010 1 1基本實(shí)驗(yàn)室基本實(shí)驗(yàn)室1.1 1.1 洗滌洗滌 根據(jù)工作量的大小決定其大小，一般面積控根據(jù)工作量的大小決定其大小，一般面積控制在制在30-50m30-50m2 2。在實(shí)驗(yàn)室的一側(cè)設(shè)置專用的洗滌。在實(shí)驗(yàn)室的一側(cè)設(shè)置專用的洗滌水槽，用來清洗玻璃器皿。中央實(shí)驗(yàn)臺(tái)還應(yīng)配置水槽，用來清洗玻璃器皿。中央實(shí)驗(yàn)臺(tái)還應(yīng)配置2 2個(gè)水槽，用于清洗小型玻璃器皿。如果工作量個(gè)水槽，用于清洗小型玻璃器皿。如果工作量大，可以購置一臺(tái)洗瓶機(jī)。準(zhǔn)備大，可以購置一臺(tái)洗瓶機(jī)。準(zhǔn)備1-21-2個(gè)洗液缸，個(gè)洗液缸，專

8、門用于洗滌對(duì)潔凈度要求很高的玻璃器皿。此專門用于洗滌對(duì)潔凈度要求很高的玻璃器皿。此外還應(yīng)配置落水架、干燥箱、柜子、超聲波清洗外還應(yīng)配置落水架、干燥箱、柜子、超聲波清洗器等。地面應(yīng)器等。地面應(yīng)耐濕并排水良好耐濕并排水良好。 2021/6/3011配備的主要儀器設(shè)備有配備的主要儀器設(shè)備有 ：天平、微波爐、：天平、微波爐、pH計(jì)、計(jì)、藥品柜、器械柜、電爐、各種規(guī)格的培養(yǎng)瓶、培藥品柜、器械柜、電爐、各種規(guī)格的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、移液管、燒杯、量筒、容量瓶、儲(chǔ)藏瓶、養(yǎng)皿、移液管、燒杯、量筒、容量瓶、儲(chǔ)藏瓶、冰箱等。冰箱等。冰箱用于儲(chǔ)存培養(yǎng)基冰箱用于儲(chǔ)存培養(yǎng)基母液母液、激素維生素等貴重藥、激素維生素等貴重藥品

9、、彩色膠卷、及保存植物材料。天平應(yīng)有不同品、彩色膠卷、及保存植物材料。天平應(yīng)有不同感量。感量。1.2配制培養(yǎng)基配制培養(yǎng)基?2021/6/30122021/6/3013 配備高壓滅菌鍋、排風(fēng)滅火設(shè)備等。配備高壓滅菌鍋、排風(fēng)滅火設(shè)備等。 如果沒有條件的話，可以將上述工作如果沒有條件的話，可以將上述工作合并合并成一成一個(gè)準(zhǔn)備間，要求是設(shè)備的安裝和排列要合理、房間個(gè)準(zhǔn)備間，要求是設(shè)備的安裝和排列要合理、房間要明亮、透風(fēng)，地面要便于清潔、防滑。要明亮、透風(fēng)，地面要便于清潔、防滑。1.3 消毒消毒2021/6/30142021/6/3015無菌操作室主要用于實(shí)驗(yàn)材料的接種操作，所以又叫無菌操作室主要用于實(shí)

10、驗(yàn)材料的接種操作，所以又叫接種室。通常由里外兩間組成，外間是緩沖間，用于接種室。通常由里外兩間組成，外間是緩沖間，用于準(zhǔn)備工作，還有防止污染的作用。緩沖間的門應(yīng)該與準(zhǔn)備工作，還有防止污染的作用。緩沖間的門應(yīng)該與接種室的門錯(cuò)開，兩個(gè)門也不要同時(shí)開啟，以保證無接種室的門錯(cuò)開，兩個(gè)門也不要同時(shí)開啟，以保證無菌室不因開門和人的進(jìn)出帶進(jìn)雜菌。緩沖間內(nèi)應(yīng)該設(shè)菌室不因開門和人的進(jìn)出帶進(jìn)雜菌。緩沖間內(nèi)應(yīng)該設(shè)有水槽、實(shí)驗(yàn)臺(tái)、鞋帽架、和柜子、紫外燈。無菌操有水槽、實(shí)驗(yàn)臺(tái)、鞋帽架、和柜子、紫外燈。無菌操作室的內(nèi)壁應(yīng)當(dāng)用塑鋼板或瓷磚裝修，工作人員進(jìn)入作室的內(nèi)壁應(yīng)當(dāng)用塑鋼板或瓷磚裝修，工作人員進(jìn)入操作間前要穿上消過毒的

11、工作服和拖鞋。操作間前要穿上消過毒的工作服和拖鞋。 室內(nèi)應(yīng)配有室內(nèi)應(yīng)配有超凈工作臺(tái)超凈工作臺(tái)，紫外燈、解剖鏡、各種，紫外燈、解剖鏡、各種接種器械等。接種器械等。 1.4 無菌操作室無菌操作室？2021/6/30162021/6/3017 為了控制培養(yǎng)室的溫度和光照時(shí)間及其強(qiáng)度，培養(yǎng)為了控制培養(yǎng)室的溫度和光照時(shí)間及其強(qiáng)度，培養(yǎng)室的房間不要窗戶，但應(yīng)當(dāng)留一個(gè)通氣窗，并安上排氣室的房間不要窗戶，但應(yīng)當(dāng)留一個(gè)通氣窗，并安上排氣扇。室內(nèi)扇。室內(nèi)溫度溫度由空調(diào)控制，由空調(diào)控制，光照光照由日光燈控制。一般要由日光燈控制。一般要分兩間，一為光照培養(yǎng)室，一為暗培養(yǎng)室。培養(yǎng)室外應(yīng)分兩間，一為光照培養(yǎng)室，一為暗培養(yǎng)

12、室。培養(yǎng)室外應(yīng)有一預(yù)備間或走廊。有一預(yù)備間或走廊。 培養(yǎng)室應(yīng)配有培養(yǎng)架、搖床、光照培養(yǎng)箱、生化培培養(yǎng)室應(yīng)配有培養(yǎng)架、搖床、光照培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱、自動(dòng)控時(shí)器等。日光燈一般用養(yǎng)箱、自動(dòng)控時(shí)器等。日光燈一般用40W，固定在培養(yǎng)，固定在培養(yǎng)架的側(cè)面或擱板的下面，每層有兩支日光燈，距離在架的側(cè)面或擱板的下面，每層有兩支日光燈，距離在20cm，光照強(qiáng)度為，光照強(qiáng)度為2000-3000lx。1.5 培養(yǎng)室培養(yǎng)室2021/6/30182021/6/30192021/6/3020為試管苗提供滿足生長(zhǎng)的適宜環(huán)境條件。為試管苗提供滿足生長(zhǎng)的適宜環(huán)境條件。2.2、溫室、溫室2021/6/3021（一）、滅菌工作是極

13、其重要的。（一）、滅菌工作是極其重要的。 首先應(yīng)建立有菌和無菌的概念有菌的范疇：首先應(yīng)建立有菌和無菌的概念有菌的范疇：有菌：有菌：凡是暴露在空氣中的物體，至少其表面都是有菌的。凡是暴露在空氣中的物體，至少其表面都是有菌的。如植物的表面、超凈工作臺(tái)的臺(tái)面，未處理的工具和手等。如植物的表面、超凈工作臺(tái)的臺(tái)面，未處理的工具和手等。 無菌無菌：高壓高溫處理（工具、器皿、培養(yǎng)基等）：高壓高溫處理（工具、器皿、培養(yǎng)基等） 物理或化學(xué)處理；物理或化學(xué)處理； 火烤后的物體；火烤后的物體； 健康的動(dòng)植物不與內(nèi)外部表面接觸的組織健康的動(dòng)植物不與內(nèi)外部表面接觸的組織 內(nèi)部可能是無菌的（有時(shí)也有內(nèi)生菌，但內(nèi)部可能是無

14、菌的（有時(shí)也有內(nèi)生菌，但 不會(huì)影響培養(yǎng)，也不會(huì)污染）不會(huì)影響培養(yǎng)，也不會(huì)污染）滅菌滅菌2 2 實(shí)驗(yàn)基本操作實(shí)驗(yàn)基本操作2021/6/30221 1、物理方法物理方法：干熱、：干熱、濕熱濕熱、過濾（、過濾（0.250.25微微米）、紫外燈、超聲波等。米）、紫外燈、超聲波等。 2 2、化學(xué)方法化學(xué)方法：使用滅菌劑或抗菌素，如酒：使用滅菌劑或抗菌素，如酒精、次氯酸鈉、升汞、漂白粉、高錳酸鉀、精、次氯酸鈉、升汞、漂白粉、高錳酸鉀、雙氧水、福爾馬林等雙氧水、福爾馬林等 （二）、滅菌的方法（二）、滅菌的方法2021/6/3023干熱滅菌干熱滅菌 玻璃器皿、器械玻璃器皿、器械 濕熱滅菌濕熱滅菌 培養(yǎng)基、蒸餾

15、水、器械、棉塞等培養(yǎng)基、蒸餾水、器械、棉塞等熏蒸滅菌熏蒸滅菌 接種室、培養(yǎng)室接種室、培養(yǎng)室過濾滅菌過濾滅菌 液體培養(yǎng)基、蒸餾水液體培養(yǎng)基、蒸餾水藥劑滅菌藥劑滅菌 培養(yǎng)材料培養(yǎng)材料燒灼滅菌燒灼滅菌 器械、瓶口、棉塞、包頭紙器械、瓶口、棉塞、包頭紙輻射滅菌輻射滅菌 接種室、培養(yǎng)間接種室、培養(yǎng)間各種滅菌方法及其使用范圍各種滅菌方法及其使用范圍2021/6/3024適用于玻璃器皿和金屬器械的滅菌。操作方適用于玻璃器皿和金屬器械的滅菌。操作方法：法：150 150 、40min40min或或120 120 、120min120min，如，如果發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌，果發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌，160 160 、9090120

16、min120min（1 1）干熱滅菌）干熱滅菌2021/6/3025適用于各種器皿、培養(yǎng)基、器皿、蒸餾水、適用于各種器皿、培養(yǎng)基、器皿、蒸餾水、棉塞、紙等。棉塞、紙等。121 121 維持維持202030min30min注意點(diǎn)：加足水、排盡氣、氣壓降到注意點(diǎn)：加足水、排盡氣、氣壓降到0 0時(shí)，時(shí)，才能開蓋才能開蓋（2 2）濕熱滅菌）濕熱滅菌2021/6/3026 培養(yǎng)基的滅菌一般用高壓高溫處理，但如果培養(yǎng)基的滅菌一般用高壓高溫處理，但如果培養(yǎng)基中某些成分遇到高溫分解（如某些生長(zhǎng)調(diào)培養(yǎng)基中某些成分遇到高溫分解（如某些生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑節(jié)劑GA3GA3、玉米素等），就需要過濾滅菌。另外酶、玉米素等），就需

17、要過濾滅菌。另外酶、血清等也需要過濾滅菌血清等也需要過濾滅菌 滅菌方法：將生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑或酶配成一定濃度，滅菌方法：將生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑或酶配成一定濃度，用注射器注入微孔濾膜慮，濾膜孔徑用注射器注入微孔濾膜慮，濾膜孔徑0.220.220.450.45微米。制培養(yǎng)基時(shí)，現(xiàn)將培養(yǎng)基高壓滅菌，待降微米。制培養(yǎng)基時(shí)，現(xiàn)將培養(yǎng)基高壓滅菌，待降至至5050左右時(shí)，加入適量的激素，然后分裝。左右時(shí)，加入適量的激素，然后分裝。（3 3）過濾滅菌）過濾滅菌2021/6/3027主要是利用紫外燈進(jìn)行照射，適合實(shí)驗(yàn)室主要是利用紫外燈進(jìn)行照射，適合實(shí)驗(yàn)室空氣、操作臺(tái)等，滅菌時(shí)間空氣、操作臺(tái)等，滅菌時(shí)間202030min30min

18、。注意：關(guān)燈后注意：關(guān)燈后5min5min后再進(jìn)入。超凈工作臺(tái)后再進(jìn)入。超凈工作臺(tái)關(guān)燈后要打開風(fēng)機(jī)。關(guān)燈后要打開風(fēng)機(jī)。（4 4）射線滅菌）射線滅菌2021/6/3028用火焰灼燒達(dá)到滅菌目的，適用于用火焰灼燒達(dá)到滅菌目的，適用于接種器皿的滅菌。接種器皿的滅菌。（5 5）火焰灼燒滅菌）火焰灼燒滅菌2021/6/3029適用外植體、實(shí)驗(yàn)器皿、操作表面、皮膚等。適用外植體、實(shí)驗(yàn)器皿、操作表面、皮膚等。幾種常用消毒劑的效果比較幾種常用消毒劑的效果比較消消 毒毒 劑劑使用濃度使用濃度(%)(%)消毒時(shí)間消毒時(shí)間(min)(min)效效 果果殘液去除殘液去除難易難易乙醇乙醇70-7570-750.1-30

19、.1-3好好易易新潔爾滅新潔爾滅101020205 53030好好易易氯化汞氯化汞0.10.11 12 21515最好最好最難最難過氧化氫過氧化氫101012125 51515較好較好最易最易抗菌素抗菌素4 450mgl50mgl-1-130306060較好較好較難較難次氯酸鈣次氯酸鈣/ /納納9 9 10105 53030好好易易（6 6）消毒劑）消毒劑2021/6/3030長(zhǎng)期不用的培養(yǎng)室或接種室要進(jìn)行熏蒸。方法：長(zhǎng)期不用的培養(yǎng)室或接種室要進(jìn)行熏蒸。方法：甲甲醛、高錳酸鉀熏蒸醛、高錳酸鉀熏蒸。 甲醛的用量通常按每立方米空間甲醛的用量通常按每立方米空間2-62-6毫升計(jì)算，毫升計(jì)算，高錳酸鉀

20、的用量是甲醛的一半。室內(nèi)準(zhǔn)備妥當(dāng)后，高錳酸鉀的用量是甲醛的一半。室內(nèi)準(zhǔn)備妥當(dāng)后，把稱好的高錳酸鉀放在瓷碗或燒杯內(nèi)把稱好的高錳酸鉀放在瓷碗或燒杯內(nèi)( (最好在碗或最好在碗或杯下面鋪一張報(bào)紙，以利清洗杯下面鋪一張報(bào)紙，以利清洗) )，然后將甲醛也倒，然后將甲醛也倒入碗或杯內(nèi)，立即出屋關(guān)門。幾秒鐘后，甲醛溶液入碗或杯內(nèi)，立即出屋關(guān)門。幾秒鐘后，甲醛溶液即揮發(fā)。高錳酸鉀是一種氧化劑，當(dāng)它與一部分甲即揮發(fā)。高錳酸鉀是一種氧化劑，當(dāng)它與一部分甲醛作用時(shí)，由氧化反應(yīng)產(chǎn)生的熱可使其余的甲醛揮醛作用時(shí)，由氧化反應(yīng)產(chǎn)生的熱可使其余的甲醛揮發(fā)為氣體。發(fā)為氣體。熏蒸滅菌熏蒸滅菌2021/6/3031甲醛熏蒸接種室應(yīng)至

21、少在使用前甲醛熏蒸接種室應(yīng)至少在使用前2424小時(shí)進(jìn)行，熏蒸后小時(shí)進(jìn)行，熏蒸后密閉保持密閉保持4 4小時(shí)以上再進(jìn)入室內(nèi)工作。甲醛對(duì)人的眼、小時(shí)以上再進(jìn)入室內(nèi)工作。甲醛對(duì)人的眼、鼻有強(qiáng)烈刺激作用。因此，可在使用前用氨進(jìn)行中和。鼻有強(qiáng)烈刺激作用。因此，可在使用前用氨進(jìn)行中和。取與甲醛等量的氨水，倒在另一個(gè)燒杯里，迅速放入取與甲醛等量的氨水，倒在另一個(gè)燒杯里，迅速放入熏蒸室內(nèi)，使甲醛和氨水發(fā)生中和反應(yīng)，以消除甲醛熏蒸室內(nèi)，使甲醛和氨水發(fā)生中和反應(yīng)，以消除甲醛味，減少對(duì)人體的刺激作用。使用氨水應(yīng)在工作前味，減少對(duì)人體的刺激作用。使用氨水應(yīng)在工作前2 2小時(shí)進(jìn)行。小時(shí)進(jìn)行。 對(duì)有材料的培養(yǎng)室，也可以采用

22、乙二醇加熱熏蒸對(duì)有材料的培養(yǎng)室，也可以采用乙二醇加熱熏蒸2021/6/3032人為因素（工作人員本身）：工作服、帽、口罩、酒精擦手。人為因素（工作人員本身）：工作服、帽、口罩、酒精擦手。物品因素物品因素器器皿皿和和用用具具培養(yǎng)皿：洗培養(yǎng)皿：洗熱壓熱壓 玻璃器皿：洗玻璃器皿：洗干熱（干熱箱）或晾干干熱（干熱箱）或晾干 接種用具：用接種用具：用CCLCCL4 4布擦布擦濕布擦濕布擦 泡泡75%95%75%95%酒精酒精燒燒培養(yǎng)基：濕熱培養(yǎng)基：濕熱培培養(yǎng)養(yǎng)材材料料外部細(xì)菌：用水沖洗外部細(xì)菌：用水沖洗化學(xué)藥劑處理化學(xué)藥劑處理 內(nèi)部細(xì)菌內(nèi)部細(xì)菌 莖尖培養(yǎng)莖尖培養(yǎng) 加抗生素：青霉素、利福平加抗生素：青霉素

23、、利福平操作的空氣：洗刷地板操作的空氣：洗刷地板95%酒精擦超凈工作臺(tái)酒精擦超凈工作臺(tái) 用化學(xué)試劑薰蒸用化學(xué)試劑薰蒸污染來源污染來源三、無菌操作技術(shù)三、無菌操作技術(shù)2021/6/30331 1、實(shí)驗(yàn)器具和材料的準(zhǔn)備、實(shí)驗(yàn)器具和材料的準(zhǔn)備2 2、用、用75%75%的酒精擦拭超凈工作臺(tái)，然后室內(nèi)及超的酒精擦拭超凈工作臺(tái)，然后室內(nèi)及超凈工作臺(tái)用紫外燈殺菌凈工作臺(tái)用紫外燈殺菌20min-30min20min-30min。注意：臺(tái)。注意：臺(tái)面上的用品不要放置太多或重疊放置，以免降低面上的用品不要放置太多或重疊放置，以免降低滅菌效果。滅菌效果。3 3、關(guān)紫外燈、打開風(fēng)機(jī)，過、關(guān)紫外燈、打開風(fēng)機(jī)，過5-10

24、min5-10min進(jìn)入緩沖間，進(jìn)入緩沖間，以以75%75%洗手和手臂，更換無菌服、帽子和口罩。洗手和手臂，更換無菌服、帽子和口罩。進(jìn)入接種室。（注：沒有特別情況，盡量不要下進(jìn)入接種室。（注：沒有特別情況，盡量不要下工作臺(tái)）工作臺(tái)）2021/6/30344 4、用、用70707575的的酒精酒精拭擦臺(tái)面并拭擦臺(tái)面并消毒雙手消毒雙手。試驗(yàn)。試驗(yàn)用具也應(yīng)該用酒精消毒。點(diǎn)燃酒精燈，將金屬器用具也應(yīng)該用酒精消毒。點(diǎn)燃酒精燈，將金屬器械在其火焰上灼燒，冷卻待用。械在其火焰上灼燒，冷卻待用。注意：所有操作應(yīng)在注意：所有操作應(yīng)在火焰近處火焰近處并經(jīng)過灼燒并經(jīng)過灼燒進(jìn)行進(jìn)行。金屬器械不能過度灼燒。移液管不能灼

25、燒，培養(yǎng)金屬器械不能過度灼燒。移液管不能灼燒，培養(yǎng)瓶口、塑料材料、橡膠材料過火焰不能時(shí)間太長(zhǎng)。瓶口、塑料材料、橡膠材料過火焰不能時(shí)間太長(zhǎng)。2021/6/30355 5、取流水沖洗（至少、取流水沖洗（至少30min30min）過的外植體，用一定）過的外植體，用一定的消毒劑浸泡消毒，用無菌水沖洗的消毒劑浸泡消毒，用無菌水沖洗3434次，放入無菌次，放入無菌培養(yǎng)皿中，置于酒精燈火焰下方，用無菌的接種器培養(yǎng)皿中，置于酒精燈火焰下方，用無菌的接種器械進(jìn)行分離、切割或其他處理。械進(jìn)行分離、切割或其他處理。2021/6/30366 6、打開培養(yǎng)瓶，瓶口在燈焰處旋轉(zhuǎn)灼燒，用鑷、打開培養(yǎng)瓶，瓶口在燈焰處旋轉(zhuǎn)灼燒

26、，用鑷子將培養(yǎng)材料置于培養(yǎng)基上，灼燒鑷子放回，子將培養(yǎng)材料置于培養(yǎng)基上，灼燒鑷子放回，灼燒瓶口，蓋上瓶塞。灼燒瓶口，蓋上瓶塞。7 7、用酒精擦洗工作臺(tái)和手。進(jìn)行下一輪操作。、用酒精擦洗工作臺(tái)和手。進(jìn)行下一輪操作。2021/6/3037注意注意（1 1）進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，）進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷，但又不必，但又不必太快，以防空氣流動(dòng)，增加污染機(jī)會(huì)。（太快，以防空氣流動(dòng)，增加污染機(jī)會(huì)。（2 2）不能用不能用手觸及已消毒器皿手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。取備品更換。 （3 3）為拿取方便，工作臺(tái)面上的用品）為拿取方便，工作臺(tái)面上的

27、用品要有合理的布局，原則上應(yīng)是右手使用的東西放置在要有合理的布局，原則上應(yīng)是右手使用的東西放置在右側(cè)，左手用品在左側(cè)，酒精燈置于中央。（右側(cè)，左手用品在左側(cè)，酒精燈置于中央。（4 4）工）工作由始至終要保持一定順序性，組織或細(xì)胞在未做處作由始至終要保持一定順序性，組織或細(xì)胞在未做處理之前，勿過早暴露在空氣中。同樣，培養(yǎng)液在未用理之前，勿過早暴露在空氣中。同樣，培養(yǎng)液在未用前，不要過早開瓶；用過之后如不再重復(fù)使用，應(yīng)立前，不要過早開瓶；用過之后如不再重復(fù)使用，應(yīng)立即封閉瓶口直立可增加落菌機(jī)會(huì)。即封閉瓶口直立可增加落菌機(jī)會(huì)。2021/6/3038（5 5）吸取營(yíng)養(yǎng)液、細(xì)胞懸液及其它各種用液時(shí)，均）

28、吸取營(yíng)養(yǎng)液、細(xì)胞懸液及其它各種用液時(shí)，均應(yīng)分別使用吸管，不能混用，以防擴(kuò)大污染或?qū)е录?xì)應(yīng)分別使用吸管，不能混用，以防擴(kuò)大污染或?qū)е录?xì)胞交叉污染。胞交叉污染。（6 6）工作中）工作中不能面向操作區(qū)講話或咳嗽不能面向操作區(qū)講話或咳嗽，以，以免唾沫把細(xì)菌或支原體帶入工作臺(tái)面發(fā)生污染。免唾沫把細(xì)菌或支原體帶入工作臺(tái)面發(fā)生污染。（7 7）手或相對(duì)較臟的物品不能經(jīng)過開放的瓶口上方，）手或相對(duì)較臟的物品不能經(jīng)過開放的瓶口上方，瓶口最易污染，加液時(shí)如吸管尖碰到瓶口，則應(yīng)將吸瓶口最易污染，加液時(shí)如吸管尖碰到瓶口，則應(yīng)將吸管丟掉。管丟掉。2021/6/3039整個(gè)接種操作應(yīng)在近火焰處進(jìn)行，且動(dòng)作要整個(gè)接種操作應(yīng)在

29、近火焰處進(jìn)行，且動(dòng)作要迅速迅速正正 確確 錯(cuò)錯(cuò) 誤誤2021/6/3040接種過程中盡可能達(dá)到懸空要求防止操作帶來的污染防止操作帶來的污染正正 確確 錯(cuò)錯(cuò) 誤誤2021/6/3041接種時(shí)不得用手接觸瓶蓋內(nèi)壁或瓶口正正 確確 錯(cuò)錯(cuò) 誤誤2021/6/3042瓶蓋朝上放，接種完畢后立即蓋好瓶口正正 確確 錯(cuò)錯(cuò) 誤誤2021/6/3043接種完一瓶用火燒用具以防止交叉污染產(chǎn)生接種完一瓶用火燒用具以防止交叉污染產(chǎn)生2021/6/3044種子和分生組織：培養(yǎng)時(shí)通常將其貼放在培養(yǎng)基表種子和分生組織：培養(yǎng)時(shí)通常將其貼放在培養(yǎng)基表面，而不是插到培養(yǎng)基內(nèi)部，以免供氧不足面，而不是插到培養(yǎng)基內(nèi)部，以免供氧不足正

30、正 確確 錯(cuò)錯(cuò) 誤誤2021/6/3045接種莖段：注意形態(tài)學(xué)下端插入培養(yǎng)基內(nèi)，而形接種莖段：注意形態(tài)學(xué)下端插入培養(yǎng)基內(nèi)，而形態(tài)學(xué)上端露于空氣中態(tài)學(xué)上端露于空氣中正正 確確 錯(cuò)錯(cuò) 誤誤2021/6/3046用于外植體分離的母體植物材料一般有用于外植體分離的母體植物材料一般有3種來源：種來源：一是一是生長(zhǎng)在自然環(huán)境下的植物生長(zhǎng)在自然環(huán)境下的植物；二是；二是在溫室控制在溫室控制環(huán)境條件下生長(zhǎng)的植物環(huán)境條件下生長(zhǎng)的植物；三是；三是無菌環(huán)境下已經(jīng)過無菌環(huán)境下已經(jīng)過離體培養(yǎng)的植物離體培養(yǎng)的植物。 四、外植體的選擇與處理技術(shù)四、外植體的選擇與處理技術(shù)2021/6/3047 1 1、選擇優(yōu)良的基因型、選擇優(yōu)

31、良的基因型 試驗(yàn)首先要明確目的。例如，蔬菜、作物等的試驗(yàn)首先要明確目的。例如，蔬菜、作物等的脫毒快繁，是為了脫去病毒，提高產(chǎn)量和質(zhì)量，脫毒快繁，是為了脫去病毒，提高產(chǎn)量和質(zhì)量，就應(yīng)選擇當(dāng)?shù)卦耘啻_認(rèn)的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的品種作為脫就應(yīng)選擇當(dāng)?shù)卦耘啻_認(rèn)的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的品種作為脫毒的材料，并且品種一定要可靠?；ɑ?、觀賞植毒的材料，并且品種一定要可靠。花卉、觀賞植物的快繁，也應(yīng)選擇有價(jià)值的植物。物的快繁，也應(yīng)選擇有價(jià)值的植物。 2 2、取材、取材 從生長(zhǎng)旺盛、健壯、無病蟲害的植株上取材。從生長(zhǎng)旺盛、健壯、無病蟲害的植株上取材。母柱代謝旺盛期切取的外植體再生能力強(qiáng)，試驗(yàn)?zāi)钢x旺盛期切取的外植體再生能力強(qiáng)，試驗(yàn)容易成

32、功。容易成功。 （一）、外植體的選擇（一）、外植體的選擇2021/6/30483.3.培養(yǎng)基的成分及其配制培養(yǎng)基的成分及其配制一、培養(yǎng)基的成分及其作用一、培養(yǎng)基的成分及其作用（一）（一）無機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)無機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) 培養(yǎng)的植物組織、器官、細(xì)胞或者原生質(zhì)體需培養(yǎng)的植物組織、器官、細(xì)胞或者原生質(zhì)體需要連續(xù)的供給某些無機(jī)化學(xué)物質(zhì)，除了要連續(xù)的供給某些無機(jī)化學(xué)物質(zhì)，除了C C、H H、O O之之外，需要量比較多的元素叫大量元素，需要量比較外，需要量比較多的元素叫大量元素，需要量比較少的元素叫微量營(yíng)養(yǎng)元素。少的元素叫微量營(yíng)養(yǎng)元素。2021/6/3049培養(yǎng)基的大量元素使用量一般在培養(yǎng)基的大量元素使用量一般在

33、每升幾十至幾千每升幾十至幾千毫克毫克。大量元素包括。大量元素包括N, P, K, Ca, Mg, SN, P, K, Ca, Mg, S。培養(yǎng)基中加入量最多的是培養(yǎng)基中加入量最多的是N N，N N一般以硝酸鹽或氨一般以硝酸鹽或氨鹽，或者兩者結(jié)合的鹽提供鹽，或者兩者結(jié)合的鹽提供大量元素大量元素2021/6/3050微量元素的用量一般微量元素的用量一般每升不高于幾十毫克每升不高于幾十毫克。植物所。植物所需的微量元素有需的微量元素有FeFe、CuCu、ZnZn、B B、 MoMo、MnMn、CoCo，ClCl其他一些化學(xué)藥品常帶有微量元素雜質(zhì)，因此要注其他一些化學(xué)藥品常帶有微量元素雜質(zhì)，因此要注意微

34、量元素的用量不能過多，多會(huì)引起生長(zhǎng)抑制等意微量元素的用量不能過多，多會(huì)引起生長(zhǎng)抑制等毒害現(xiàn)象。毒害現(xiàn)象。微量元素微量元素2021/6/3051（二）（二）. .有機(jī)化合物有機(jī)化合物有機(jī)物質(zhì)包括維生素類物質(zhì)、氨基酸類物質(zhì)、糖類物有機(jī)物質(zhì)包括維生素類物質(zhì)、氨基酸類物質(zhì)、糖類物質(zhì)和一些其它的有機(jī)添加物質(zhì)和一些其它的有機(jī)添加物1、維生素類物質(zhì)、維生素類物質(zhì) 維生素類物質(zhì)在酶系統(tǒng)中有催化功能。維生素類物質(zhì)在酶系統(tǒng)中有催化功能。 硫胺素（硫胺素（VB1）與愈傷組織的產(chǎn)生和生活力有關(guān)，可）與愈傷組織的產(chǎn)生和生活力有關(guān)，可能是所有植物組織培養(yǎng)初期需要的維生素，而鹽酸能是所有植物組織培養(yǎng)初期需要的維生素，而鹽酸

35、吡哆醇（吡哆醇（VB6）促進(jìn)根的生長(zhǎng)，煙酸（）促進(jìn)根的生長(zhǎng)，煙酸（VB3，又稱，又稱維生素維生素PP）促進(jìn)胚的發(fā)育。有的配方中還使用了泛）促進(jìn)胚的發(fā)育。有的配方中還使用了泛酸鈣（酸鈣（VB5）、生物素（）、生物素（VH）、鈷胺素（）、鈷胺素（VB12）、）、葉酸（葉酸（VBc），），Vc等。等。 2021/6/30522、AA類物質(zhì)類物質(zhì)絕大多數(shù)絕大多數(shù)AA適量時(shí)對(duì)培養(yǎng)效果都有正象效應(yīng)。常用適量時(shí)對(duì)培養(yǎng)效果都有正象效應(yīng)。常用的有的有Gly、Asn、Gln。在植物組織培養(yǎng)中，有時(shí)也。在植物組織培養(yǎng)中，有時(shí)也用水解乳蛋白和水解酪蛋白。用水解乳蛋白和水解酪蛋白。2021/6/30533 3、糖類、糖

36、類糖在培養(yǎng)基的作用：糖在培養(yǎng)基的作用：1 1）、為細(xì)胞提供合成新物質(zhì)的碳骨架）、為細(xì)胞提供合成新物質(zhì)的碳骨架 2 2）、為細(xì)胞的呼吸代謝提供底物和能量）、為細(xì)胞的呼吸代謝提供底物和能量 3 3）、維持滲透壓）、維持滲透壓蔗糖蔗糖是廣泛應(yīng)用的一種碳源。葡萄糖和麥芽糖也是常是廣泛應(yīng)用的一種碳源。葡萄糖和麥芽糖也是常用的碳源。用的碳源。2021/6/30544、其它有機(jī)物質(zhì)、其它有機(jī)物質(zhì)1）肌醇（環(huán)己六醇）肌醇（環(huán)己六醇） 肌醇可以形成果膠物質(zhì)，是細(xì)胞壁的構(gòu)建物質(zhì)肌醇可以形成果膠物質(zhì)，是細(xì)胞壁的構(gòu)建物質(zhì)另外還可以形成植酸，與陽離子結(jié)合或形成磷脂，另外還可以形成植酸，與陽離子結(jié)合或形成磷脂，參與細(xì)胞膜

37、的組成。利于胚和芽的形成參與細(xì)胞膜的組成。利于胚和芽的形成2）天然有機(jī)物天然有機(jī)物一些天然的有機(jī)物如椰乳、番茄提取物、酵母提一些天然的有機(jī)物如椰乳、番茄提取物、酵母提取物、馬鈴薯煮汁也常用于植物組織培養(yǎng)，并表取物、馬鈴薯煮汁也常用于植物組織培養(yǎng)，并表現(xiàn)出了良好的促進(jìn)作用?，F(xiàn)出了良好的促進(jìn)作用。2021/6/3055n植物激素是在植物體內(nèi)合成的，對(duì)植物植物激素是在植物體內(nèi)合成的，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育有顯著調(diào)節(jié)作用的微量有機(jī)物，生長(zhǎng)發(fā)育有顯著調(diào)節(jié)作用的微量有機(jī)物，而而植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是外源的調(diào)節(jié)植物生劑是外源的調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育的物質(zhì)。長(zhǎng)發(fā)育的物質(zhì)。n無機(jī)元素和有機(jī)營(yíng)養(yǎng)構(gòu)成的培養(yǎng)基僅保無機(jī)元素和

38、有機(jī)營(yíng)養(yǎng)構(gòu)成的培養(yǎng)基僅保證培養(yǎng)物的生存與最低生理活動(dòng)，只有證培養(yǎng)物的生存與最低生理活動(dòng)，只有加入植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，才能誘導(dǎo)細(xì)胞加入植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，才能誘導(dǎo)細(xì)胞分裂、脫分化和再分化。分裂、脫分化和再分化。（三）、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)（三）、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)2021/6/3056 1 1、生長(zhǎng)素類：、生長(zhǎng)素類：1 1）吲哚類：）吲哚類：IAAIAA（吲哚乙酸）、（吲哚乙酸）、 IBAIBA（吲哚丁酸）（吲哚丁酸） 、IPAIPA（吲哚丙酸）（吲哚丙酸）2 2）萘酸類：）萘酸類： NAANAA（萘乙酸）（萘乙酸）3 3）苯氧羧酸類：）苯氧羧酸類：2,4-D2,4-D（2,4-2,4-二氯苯氧乙酸）、二

39、氯苯氧乙酸）、2,4,5-T2,4,5-T（ 2,4,5-2,4,5-三氯苯氧乙酸）、三氯苯氧乙酸）、 2,4,5-T2,4,5-TP P（ 2,4,5-2,4,5-三氯苯氧丙酸）等。三氯苯氧丙酸）等。其中吲哚乙酸在植物體內(nèi)普遍存在，是生理活性最其中吲哚乙酸在植物體內(nèi)普遍存在，是生理活性最強(qiáng)的生長(zhǎng)素。強(qiáng)的生長(zhǎng)素。2021/6/3057 生長(zhǎng)素的生理作用生長(zhǎng)素的生理作用1 1、促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞分裂、促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞分裂2 2、誘導(dǎo)受傷組織表面細(xì)胞恢復(fù)分裂能力、誘導(dǎo)受傷組織表面細(xì)胞恢復(fù)分裂能力3 3、形成愈傷組織，促進(jìn)生根、形成愈傷組織，促進(jìn)生根4 4、與一定量的細(xì)胞分裂素配合共同誘導(dǎo)不定與一

40、定量的細(xì)胞分裂素配合共同誘導(dǎo)不定芽的分化、側(cè)芽的萌發(fā)與生長(zhǎng)、胚狀體的誘芽的分化、側(cè)芽的萌發(fā)與生長(zhǎng)、胚狀體的誘導(dǎo)。導(dǎo)。2021/6/3058A A：NAA 0mg/LNAA 0mg/L，芽（少），根（無），芽（少），根（無） B B：NAA 0.1mg/LNAA 0.1mg/L，芽（少），根（無），愈傷組織（少量），芽（少），根（無），愈傷組織（少量） C C：NAA 5.0mg/LNAA 5.0mg/L，芽（少），根（多），愈傷組織（一定量，芽（少），根（多），愈傷組織（一定量A B C2021/6/30592、細(xì)胞分裂素、細(xì)胞分裂素n是一類腺嘌呤衍生物。主要有激動(dòng)素（是一類腺嘌呤衍生物。主要

41、有激動(dòng)素（ 6-6-糠糠基氨基嘌呤基氨基嘌呤KTKT）、）、6-6-芐基氨基嘌呤（芐基氨基嘌呤（6-BA6-BA）和）和玉米素（玉米素（ZTZT）等。其中最常用的是）等。其中最常用的是66芐基氨芐基氨基嘌呤。基嘌呤。n功能：功能：1 1、促進(jìn)細(xì)胞的分裂和分化、促進(jìn)細(xì)胞的分裂和分化2 2、誘導(dǎo)芽的分化、誘導(dǎo)芽的分化3 3、促進(jìn)側(cè)芽的萌發(fā)和生長(zhǎng)、促進(jìn)側(cè)芽的萌發(fā)和生長(zhǎng)4 4、抑制衰老、抑制衰老2021/6/3060A BA A：BA(0mg/L) BA(0mg/L) ，芽（較少），根（較多）愈傷組織（一定量），芽（較少），根（較多）愈傷組織（一定量）B B：BA(0.1mg/L)BA(0.1mg/L

42、)，芽（適量），根（適量）愈傷組織（一定量），芽（適量），根（適量）愈傷組織（一定量）2021/6/3061控制植物細(xì)胞分化控制植物細(xì)胞分化n分裂素分裂素/ /生長(zhǎng)素的比例是控制芽和根形成生長(zhǎng)素的比例是控制芽和根形成的一個(gè)重要條件的一個(gè)重要條件n比例高時(shí)比例高時(shí)產(chǎn)生芽產(chǎn)生芽, ,比例低時(shí)比例低時(shí)產(chǎn)生產(chǎn)生根根2021/6/3062生理作用：生理作用：1 1、誘導(dǎo)莖的細(xì)胞伸長(zhǎng)，對(duì)矮生型植物恢復(fù)成高、誘導(dǎo)莖的細(xì)胞伸長(zhǎng)，對(duì)矮生型植物恢復(fù)成高生型特別有效，對(duì)根無效生型特別有效，對(duì)根無效2 2、對(duì)形成層的細(xì)胞分化有影響，往往同生長(zhǎng)素、對(duì)形成層的細(xì)胞分化有影響，往往同生長(zhǎng)素有協(xié)同作用。有協(xié)同作用。IAA/G

43、AIAA/GA比值高有利于木質(zhì)部的分化，比值高有利于木質(zhì)部的分化，比值低有利于韌皮部的分化。比值低有利于韌皮部的分化。3 3、破除種子、鱗莖、塊莖休眠，使之提前萌發(fā)。、破除種子、鱗莖、塊莖休眠，使之提前萌發(fā)。4 4、對(duì)生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的活性有增效作用、對(duì)生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的活性有增效作用注：不耐熱，應(yīng)采用過濾滅菌加入注：不耐熱，應(yīng)采用過濾滅菌加入3 3、赤霉素（、赤霉素（GAGA3 3）2021/6/3063生理作用生理作用：1 1、抑制蛋白質(zhì)的合成、抑制蛋白質(zhì)的合成2 2、抵消和抑制生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、抵消和抑制生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、GAGA的作的作用用3 3、誘導(dǎo)休眠、促進(jìn)衰老和脫落、誘導(dǎo)

44、休眠、促進(jìn)衰老和脫落 4 4、脫落酸（、脫落酸（ABAABA）2021/6/3064以上四種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，前兩類用的多，后兩類只以上四種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，前兩類用的多，后兩類只是補(bǔ)充，對(duì)某些植物有利、對(duì)某些植物不僅沒有利，是補(bǔ)充，對(duì)某些植物有利、對(duì)某些植物不僅沒有利，還有害，實(shí)際工作中要具體分析。還有害，實(shí)際工作中要具體分析。生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)在生物體內(nèi)存在甚微，濃度很低，一生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)在生物體內(nèi)存在甚微，濃度很低，一般用般用ppm表示表示 1ppm=1mg/L2021/6/3065 瓊脂、瓊脂糖（用于原生質(zhì)體、細(xì)胞培養(yǎng)及某些瓊脂、瓊脂糖（用于原生質(zhì)體、細(xì)胞培養(yǎng)及某些作物的花藥培養(yǎng)）作物的花藥培養(yǎng)） 瓊

45、脂的用量一般在瓊脂的用量一般在4-10g/L4-10g/L，所購回的瓊脂要先，所購回的瓊脂要先試一下它的凝固力，一般只要能穩(wěn)定的凝固就不要試一下它的凝固力，一般只要能穩(wěn)定的凝固就不要多加。瓊脂以顏色淺、透明度好、潔凈的為上品。多加。瓊脂以顏色淺、透明度好、潔凈的為上品。 （四）固化劑（四）固化劑2021/6/3066培養(yǎng)基的種類（根據(jù)無機(jī)鹽的濃度）：培養(yǎng)基的種類（根據(jù)無機(jī)鹽的濃度）：1、高無機(jī)鹽含量培養(yǎng)基、高無機(jī)鹽含量培養(yǎng)基 鉀鹽、銨鹽及硝酸鹽含量較高，微量元素種類鉀鹽、銨鹽及硝酸鹽含量較高，微量元素種類齊全，比例適當(dāng)，離子平衡性好，具有較強(qiáng)的緩齊全，比例適當(dāng)，離子平衡性好，具有較強(qiáng)的緩沖性，

46、養(yǎng)分?jǐn)?shù)量及比例比較合適，廣泛用于植物沖性，養(yǎng)分?jǐn)?shù)量及比例比較合適，廣泛用于植物的器官、花藥、細(xì)胞及原生質(zhì)體的培養(yǎng)。主要有的器官、花藥、細(xì)胞及原生質(zhì)體的培養(yǎng)。主要有MS、LS、BL、BM、ER培養(yǎng)基。培養(yǎng)基。二、培養(yǎng)基的配方及培養(yǎng)基的選擇二、培養(yǎng)基的配方及培養(yǎng)基的選擇2021/6/30672、高硝態(tài)氮培養(yǎng)基、高硝態(tài)氮培養(yǎng)基 硝酸鉀含量高，氨態(tài)氮的含量低，含有較高硝酸鉀含量高，氨態(tài)氮的含量低，含有較高的的VB1。主要適合與木本植物、十字花科植物和。主要適合與木本植物、十字花科植物和單子葉植物的組織和花藥培養(yǎng)。主要有單子葉植物的組織和花藥培養(yǎng)。主要有B5、N6、SH培養(yǎng)基。培養(yǎng)基。2021/6/30

47、683、中等無機(jī)鹽含量培養(yǎng)基、中等無機(jī)鹽含量培養(yǎng)基大量元素約為大量元素約為MS培養(yǎng)基的一半，微量元素種類減少，培養(yǎng)基的一半，微量元素種類減少，但含量較但含量較MS的高，維生素種類比的高，維生素種類比MS多，如增加了多，如增加了生物素、葉酸等。適合于花藥培養(yǎng)，主要有生物素、葉酸等。適合于花藥培養(yǎng)，主要有Nitch，NT、H、Miller培養(yǎng)基。培養(yǎng)基。2021/6/30694、低無機(jī)鹽含量培養(yǎng)基、低無機(jī)鹽含量培養(yǎng)基大量元素含量大幅度降低而且種類減少，有機(jī)含量大量元素含量大幅度降低而且種類減少，有機(jī)含量相對(duì)也很低。多數(shù)用于生根培養(yǎng)基，主要有相對(duì)也很低。多數(shù)用于生根培養(yǎng)基，主要有White、Hell

48、er、WS、HE、HB。2021/6/30704、根據(jù)其營(yíng)養(yǎng)水平不同，培養(yǎng)基可分為基本培根據(jù)其營(yíng)養(yǎng)水平不同，培養(yǎng)基可分為基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基。養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基?；九囵B(yǎng)基基本培養(yǎng)基（就是通常稱呼的培養(yǎng)基）主要有（就是通常稱呼的培養(yǎng)基）主要有MSMS、WhiteWhite、 N6N6、B5 B5 、改良、改良MSMS、HellerHeller、NitshNitsh、SHSH、 MillerMiller等。等。完全培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基就是基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，根據(jù)試驗(yàn)就是基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，根據(jù)試驗(yàn)的不同需要，附加一些物質(zhì)，如生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)和的不同需要，附加一些物質(zhì)，如生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)和其他復(fù)雜有機(jī)物質(zhì)等。

49、其他復(fù)雜有機(jī)物質(zhì)等。MS+6-BA0.5+KT0.5+NAA0.5MS+6-BA0.5+KT0.5+NAA0.52021/6/3071 （一）、貯備液（母液）的配制（一）、貯備液（母液）的配制 為什么要配制母液？為什么要配制母液？ 1 1）、方便）、方便 2 2）、準(zhǔn)確（有些成分量太?。?zhǔn)確（有些成分量太?。?三、培養(yǎng)基的配三、培養(yǎng)基的配制制2021/6/30721 1、大量元素母液的配制、大量元素母液的配制各成分按照表各成分按照表1 1培養(yǎng)基濃度含量擴(kuò)大培養(yǎng)基濃度含量擴(kuò)大1010倍，按順序逐倍，按順序逐步混合。后用蒸餾水定容到步混合。后用蒸餾水定容到1000ml1000ml的容量瓶中，即為

50、的容量瓶中，即為1010倍的大量元素母液。到入細(xì)口瓶，貼好標(biāo)簽保存于倍的大量元素母液。到入細(xì)口瓶，貼好標(biāo)簽保存于冰箱中。配制培養(yǎng)基時(shí)，每配冰箱中。配制培養(yǎng)基時(shí)，每配1L1L培養(yǎng)基取此液培養(yǎng)基取此液100ml100ml。 2021/6/3073注意：注意：(1) (1) 某些無機(jī)成分如某些無機(jī)成分如CaCa2+2+、SOSO4 42 2一一、Mg Mg 2 2十十和和H H2 2POPO4 4一一等在一起可能發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生沉淀物。為避免此等在一起可能發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生沉淀物。為避免此現(xiàn)象發(fā)生，母液配制時(shí)要用純度高的重蒸餾水溶解，藥現(xiàn)象發(fā)生，母液配制時(shí)要用純度高的重蒸餾水溶解，藥品采用等級(jí)較高

51、的分析純，各種化學(xué)藥品必須先以少量品采用等級(jí)較高的分析純，各種化學(xué)藥品必須先以少量重蒸餾水使其充分溶解后才能混合，混合時(shí)應(yīng)注意先后重蒸餾水使其充分溶解后才能混合，混合時(shí)應(yīng)注意先后順序。特別應(yīng)將順序。特別應(yīng)將CaCa2+2+、SOSO4 42 2一一、Mg Mg 2 2十十和和H H2 2POPO4 4一一等離子錯(cuò)等離子錯(cuò)開混合，速度宜慢，邊攪拌邊混合。開混合，速度宜慢，邊攪拌邊混合。(2)CaCl(2)CaCl2 22H2H2 2O O要在最后單獨(dú)加入，在溶解要在最后單獨(dú)加入，在溶解CaClCaCl2 22H2H2 2O O時(shí)，蒸餾水需加熱沸騰，除去水中的時(shí)，蒸餾水需加熱沸騰，除去水中的COC

52、O2 2，以防沉淀。，以防沉淀。另外，另外，CaClCaCl2 22H2H2 2O O放入沸水中易沸騰，操作時(shí)要防止其放入沸水中易沸騰，操作時(shí)要防止其溢出。溢出。2021/6/3074、微量元素母液的配制、微量元素母液的配制MSMS培養(yǎng)基的微量元素?zé)o機(jī)鹽由培養(yǎng)基的微量元素?zé)o機(jī)鹽由7 7種化合物（除種化合物（除FeFe）組成。）組成。微量元素用量較少，特別微量元素用量較少，特別是是 CuSOCuSO4 45H5H2 2O O、 CoClCoCl2 26H6H2 2OO ，因此在配制中分微，因此在配制中分微量量、配制。按照表配制。按照表2 2，表，表3 3配方，用感量為配方，用感量為0.0001g

53、0.0001g的分析天平稱量，其它同大量元素。配制培養(yǎng)基時(shí)，的分析天平稱量，其它同大量元素。配制培養(yǎng)基時(shí)，每配制每配制1L1L培養(yǎng)基，取微量培養(yǎng)基，取微量10ml10ml，微量，微量mlml2021/6/30752021/6/30763 3、鐵鹽母液的配制、鐵鹽母液的配制鐵鹽不是都需要單獨(dú)配成母液，如檸檬酸鐵，只需和鐵鹽不是都需要單獨(dú)配成母液，如檸檬酸鐵，只需和大量元素一起配成母液即可。目前常用的鐵鹽是硫酸大量元素一起配成母液即可。目前常用的鐵鹽是硫酸亞鐵和乙二胺四乙酸二鈉的螯合物，必須單獨(dú)配成母亞鐵和乙二胺四乙酸二鈉的螯合物，必須單獨(dú)配成母液。這種螯合物使用起來方便，又比較穩(wěn)定，不易發(fā)液。這

54、種螯合物使用起來方便，又比較穩(wěn)定，不易發(fā)生沉淀。配制方法同上，直接用蒸餾水加熱攪拌溶解。生沉淀。配制方法同上，直接用蒸餾水加熱攪拌溶解。配制培養(yǎng)基時(shí)，配制配制培養(yǎng)基時(shí)，配制1L1L取此液取此液10ml10ml。2021/6/3077在配制鐵鹽時(shí)，如果加熱攪拌時(shí)間過短，會(huì)造成在配制鐵鹽時(shí)，如果加熱攪拌時(shí)間過短，會(huì)造成Fe Fe S 0S 04 4和和NaNa2 2EDTAEDTA鰲合不徹底，此時(shí)若將其冷藏，鰲合不徹底，此時(shí)若將其冷藏，F(xiàn)e S Fe S 0 04 4會(huì)結(jié)晶析出。為避免此現(xiàn)象發(fā)生，配制鐵鹽母液會(huì)結(jié)晶析出。為避免此現(xiàn)象發(fā)生，配制鐵鹽母液時(shí)，時(shí)，F(xiàn)e S 0Fe S 04 4和和NaN

55、a2 2EDTAEDTA應(yīng)分別加熱溶解后混合，并應(yīng)分別加熱溶解后混合，并置于加熱攪拌器上不斷攪拌至溶液呈金黃色置于加熱攪拌器上不斷攪拌至溶液呈金黃色( (約加熱約加熱20 - 30 min)20 - 30 min)，調(diào)，調(diào)pHpH值至值至5 .55 .5，室溫放置冷卻后，室溫放置冷卻后，再冷藏。再冷藏。2021/6/30784 4、有機(jī)母液的配制、有機(jī)母液的配制MSMS培養(yǎng)基的有機(jī)成分有甘氨酸、肌醇、煙酸、鹽酸硫培養(yǎng)基的有機(jī)成分有甘氨酸、肌醇、煙酸、鹽酸硫胺素和鹽酸吡哆素。培養(yǎng)基中的有機(jī)成分原則上應(yīng)分胺素和鹽酸吡哆素。培養(yǎng)基中的有機(jī)成分原則上應(yīng)分別單獨(dú)配制。配制直接用蒸餾水溶解，注意稱量時(shí)用別

56、單獨(dú)配制。配制直接用蒸餾水溶解，注意稱量時(shí)用電子分析天平。并貯存在棕色無菌瓶中電子分析天平。并貯存在棕色無菌瓶中 。配制生物素、葉酸，用稀氨水溶解，然后定容。配制生物素、葉酸，用稀氨水溶解，然后定容。2021/6/3079一般植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑母液的配制的終濃度以一般植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑母液的配制的終濃度以0.5mg/ml0.5mg/ml為好，需要注意的是：為好，需要注意的是：（）配制生長(zhǎng)素類，例如（）配制生長(zhǎng)素類，例如IAAIAA、NAANAA、2.4-D2.4-D、IBAIBA，應(yīng)先用少量應(yīng)先用少量95%95%乙醇或無水乙醇充分溶解，或者用乙醇或無水乙醇充分溶解，或者用1mol/L1mol/L的的N

57、aOHNaOH溶解，然后用蒸餾水定容到一定的濃度。溶解，然后用蒸餾水定容到一定的濃度。以后者效果好。以后者效果好。（）細(xì)胞分裂素，例如（）細(xì)胞分裂素，例如KTKT，應(yīng)先用少量，應(yīng)先用少量95%95%乙醇或乙醇或無水乙醇加無水乙醇加3434滴滴1mol/L1mol/L的鹽酸溶解，或直接用的鹽酸溶解，或直接用1mol/L HCl1mol/L HCl溶解，再用蒸餾水定容。溶解，再用蒸餾水定容。（）（）GA3GA3以以95%95%酒精溶解（不耐高溫，過濾滅菌）酒精溶解（不耐高溫，過濾滅菌）保存在棕色試劑瓶中。保存在棕色試劑瓶中。 5 5、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑母液配制、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑母液配制2021/6/30

58、80注意：注意：所有母液都要貼上標(biāo)簽，注明名稱、配制倍數(shù)、所有母液都要貼上標(biāo)簽，注明名稱、配制倍數(shù)、日期，所有的母液都應(yīng)保存在日期，所有的母液都應(yīng)保存在0404冰箱中，若冰箱中，若母液出現(xiàn)沉淀或霉團(tuán)則不能繼續(xù)使用。母液出現(xiàn)沉淀或霉團(tuán)則不能繼續(xù)使用。2021/6/30811 1、計(jì)量、計(jì)量 根據(jù)配制培養(yǎng)基的量和母液的濃度計(jì)算需要吸取母液根據(jù)配制培養(yǎng)基的量和母液的濃度計(jì)算需要吸取母液的量，計(jì)算公式：吸取量的量，計(jì)算公式：吸取量 ml=ml=培養(yǎng)基中物質(zhì)的含量培養(yǎng)基中物質(zhì)的含量（mg/Lmg/L）1000ml/1000ml/母液濃度（母液濃度（mg/Lmg/L）。）。2 2、移液、移液取醫(yī)用瓷缸一只

59、，加入少量的蒸餾水，按照計(jì)算吸取取醫(yī)用瓷缸一只，加入少量的蒸餾水，按照計(jì)算吸取母液的量依次吸取各母液置于醫(yī)用瓷量杯中備用。母液的量依次吸取各母液置于醫(yī)用瓷量杯中備用。（二）、培養(yǎng)基的配制（二）、培養(yǎng)基的配制 2021/6/3082注意注意 （1 1）用量筒或移液管量取培養(yǎng)基母液之前，）用量筒或移液管量取培養(yǎng)基母液之前，必須用所量取的母液將量筒或移液管潤(rùn)洗必須用所量取的母液將量筒或移液管潤(rùn)洗2 2次。次。（2 2）量取母液時(shí)，不要漏掉或多加。（）量取母液時(shí)，不要漏掉或多加。（3 3）移液）移液管不能混用。管不能混用。2021/6/30833 3、稱取瓊脂蔗糖備用、稱取瓊脂蔗糖備用4 4、融化、融

60、化用搪瓷量杯量取用搪瓷量杯量取600600700ml700ml的蒸餾水放在電爐上，的蒸餾水放在電爐上，加入瓊脂，邊加熱邊用玻璃棒攪拌，直到液體呈半加入瓊脂，邊加熱邊用玻璃棒攪拌，直到液體呈半透明狀將其取下，加入蔗糖。透明狀將其取下，加入蔗糖。大燒杯底的外表面不能沾水，否則加熱時(shí)燒杯容易大燒杯底的外表面不能沾水，否則加熱時(shí)燒杯容易炸裂，使溶液外溢，造成燙傷。炸裂，使溶液外溢，造成燙傷。 2021/6/30845 5、混合、混合將融化的瓊脂和母液充分混合，用蒸餾水定容到將融化的瓊脂和母液充分混合，用蒸餾水定容到1000ml1000ml，來回混合幾次。，來回混合幾次。6 6、調(diào)、調(diào)pHpH用滴管吸取

61、物質(zhì)的量濃度為用滴管吸取物質(zhì)的量濃度為1 mol/L1 mol/L的的NaOHNaOH或或HClHCl溶液，溶液，逐滴滴入溶化的培養(yǎng)基中，邊滴邊攪拌，并隨時(shí)用精逐滴滴入溶化的培養(yǎng)基中，邊滴邊攪拌，并隨時(shí)用精密的密的pHpH試紙?jiān)嚰?5.4(5.47.0)7.0)測(cè)培養(yǎng)基的測(cè)培養(yǎng)基的pHpH，一直到培養(yǎng)基，一直到培養(yǎng)基的的pHpH達(dá)到要求為止達(dá)到要求為止( (在調(diào)制時(shí)要比目標(biāo)在調(diào)制時(shí)要比目標(biāo)pHpH值偏高值偏高0.20.20.50.5個(gè)單位，因?yàn)榕囵B(yǎng)基在滅菌過程中由于糖等物質(zhì)的個(gè)單位，因?yàn)榕囵B(yǎng)基在滅菌過程中由于糖等物質(zhì)的降解，降解，pHpH值會(huì)下降值會(huì)下降0.20.20.50.5個(gè)單位左右個(gè)單位

62、左右) )。2021/6/30857 7、分裝、分裝溶化的培養(yǎng)基應(yīng)該趁熱分裝。注意不要讓培養(yǎng)基沾溶化的培養(yǎng)基應(yīng)該趁熱分裝。注意不要讓培養(yǎng)基沾到瓶口和瓶壁上。錐形瓶中培養(yǎng)基的量約為錐形瓶到瓶口和瓶壁上。錐形瓶中培養(yǎng)基的量約為錐形瓶容量的容量的1/51/51/41/4。每。每1L1L培養(yǎng)基，可分裝培養(yǎng)基，可分裝20203030瓶。瓶。8 8、包扎、包扎用封口膜封口，外邊可加一層牛皮紙，扎好繩子，用封口膜封口，外邊可加一層牛皮紙，扎好繩子，用鉛筆或碳素墨水筆在牛皮紙上寫上培養(yǎng)基的代號(hào)。用鉛筆或碳素墨水筆在牛皮紙上寫上培養(yǎng)基的代號(hào)。9 9、培養(yǎng)基的滅菌、培養(yǎng)基的滅菌2021/6/3086 培養(yǎng)中溫度、

63、光照、濕度等各種環(huán)境條件，培培養(yǎng)中溫度、光照、濕度等各種環(huán)境條件，培養(yǎng)基組成、養(yǎng)基組成、pHpH值、滲透壓等各種化學(xué)環(huán)境條件都值、滲透壓等各種化學(xué)環(huán)境條件都會(huì)影響組織會(huì)影響組織4 4 培養(yǎng)條件的選擇培養(yǎng)條件的選擇2021/6/3087一一. .光照的影響光照的影響 培養(yǎng)中光照也是重要的條件之一，主要表現(xiàn)在光強(qiáng)、培養(yǎng)中光照也是重要的條件之一，主要表現(xiàn)在光強(qiáng)、光質(zhì)、以及光周期等方面：光質(zhì)、以及光周期等方面： 光周期：黑暗與光照交替的時(shí)間光周期：黑暗與光照交替的時(shí)間 光光 量：光照強(qiáng)度量：光照強(qiáng)度 光光 質(zhì)：光的波長(zhǎng)質(zhì)：光的波長(zhǎng)2021/6/3088例例1 1：黑暗中培養(yǎng)的煙草花藥，其胚狀體的分化與

64、幼植物的：黑暗中培養(yǎng)的煙草花藥，其胚狀體的分化與幼植物的 生長(zhǎng)，同經(jīng)光照培養(yǎng)一樣的多生長(zhǎng)，同經(jīng)光照培養(yǎng)一樣的多例例2 2：短日照敏感的葡萄品種，它的莖切段，僅在短日照條：短日照敏感的葡萄品種，它的莖切段，僅在短日照條 件下才能分化成根件下才能分化成根例例3 3：對(duì)日照不敏感的葡萄品種，可在任何光周期下分化成：對(duì)日照不敏感的葡萄品種，可在任何光周期下分化成 根根結(jié)論：光周期的需要與否，應(yīng)根據(jù)植物種類、培養(yǎng)的目的來結(jié)論：光周期的需要與否，應(yīng)根據(jù)植物種類、培養(yǎng)的目的來決定決定1 1、光周期對(duì)植物細(xì)胞脫分化和再分化的效應(yīng)、光周期對(duì)植物細(xì)胞脫分化和再分化的效應(yīng)2021/6/3089最常用的周期是最常用的

65、周期是16h16h的光照，的光照，8h8h的黑暗。的黑暗。 愈傷組織誘導(dǎo)階段，一般采用三種做法：全暗、周期愈傷組織誘導(dǎo)階段，一般采用三種做法：全暗、周期性光照、散射性光照。依據(jù)植物種類不同做法不同，性光照、散射性光照。依據(jù)植物種類不同做法不同，多數(shù)植物適合全暗或周期性光照，多數(shù)植物適合全暗或周期性光照， 器官發(fā)生階段：一般給予周期性光照比較好。器官發(fā)生階段：一般給予周期性光照比較好。離體培養(yǎng)中光周期的調(diào)節(jié)離體培養(yǎng)中光周期的調(diào)節(jié)2021/6/3090光照強(qiáng)度對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的增殖和器官的分化有重要影響，從目光照強(qiáng)度對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的增殖和器官的分化有重要影響，從目前的研究情況看，光照強(qiáng)度對(duì)外植物體、細(xì)胞的最

66、初分裂有前的研究情況看，光照強(qiáng)度對(duì)外植物體、細(xì)胞的最初分裂有明顯的影響。明顯的影響。一般來說，光照強(qiáng)度較強(qiáng)，幼苗生長(zhǎng)的粗壯，而光照強(qiáng)度較一般來說，光照強(qiáng)度較強(qiáng)，幼苗生長(zhǎng)的粗壯，而光照強(qiáng)度較弱幼苗容易徒長(zhǎng)。弱幼苗容易徒長(zhǎng)。離體培養(yǎng)條件下常用的光量，一般為離體培養(yǎng)條件下常用的光量，一般為1000-4000lx1000-4000lx（勒克（勒克斯）。離體培養(yǎng)中通常難以達(dá)到斯）。離體培養(yǎng)中通常難以達(dá)到4000lx4000lx，一般光量在，一般光量在2000-2000-3000lx3000lx。光照強(qiáng)度的高低直接影響器官分化的頻率。光照強(qiáng)度的高低直接影響器官分化的頻率 高光量可以降低植物體內(nèi)生長(zhǎng)素水平，低光量使植物體內(nèi)生高光量可以降低植物體內(nèi)生長(zhǎng)素水平，低光量使植物體內(nèi)生長(zhǎng)素素水平較高，容易生根長(zhǎng)素素水平較高，容易生根2 2、光量的影響、光量的影響2021/6/3091 光質(zhì)對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)，培養(yǎng)組織的增殖以及器官的分化光質(zhì)對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)，培養(yǎng)組織的增殖以及器官的分化都有明顯的影響。如百合珠芽在紅光下培養(yǎng)，都有明顯的影響。如百合珠芽在紅光下培養(yǎng)，2 2周后，周后，分化出愈傷組織。但在藍(lán)光下培養(yǎng)，幾