基因組序列詮釋ppt課件

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1、單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,*,問題,基因組序列所包含的全部遺傳信息是什么？,基因組作為一個整體如何行使其功能？,用什么方法尋找基因、研究基因的功能呢？,問題基因組序列所包含的全部遺傳信息是什么？,1.,尋找基因,1.1,根據(jù)開放讀碼框預測基因,A,起始密碼子,ATG,第一個,ATG,的確定,(,依據(jù),Kozak,規(guī)則,);,Kozak,規(guī)則是基于已知數(shù)據(jù)的統(tǒng)計結(jié)果,.,所謂,Kozak,規(guī)則，即第一個,ATG,側(cè)翼序列的堿基分布所滿足的統(tǒng)計規(guī)律,.,1.尋找基因1.1 根據(jù)開放讀碼框預測基因,Kozak,規(guī)則,:,若將第一個,ATG,中

2、的堿基,A,，,T,，,G,分別標為,1,，,2,，,3,位，則,Kozak,規(guī)則可描述如下：,(1),第,4,位的偏好堿基為,G,；,(2)ATG,的,5,端約,15bp,范圍的側(cè)翼序列內(nèi)不含堿基,T,；,(3),在,-3,，,-6,和,-9,位置，,G,是偏好堿基；,(4),除,-3,，,-6,和,-9,位，在整個側(cè)翼序列區(qū)，,C,是偏好堿基。,Kozak規(guī)則:,B,信號肽分析,信號肽分析軟件,(SignalP http:/www.cbs.dtu.dk/services/signalP),把預測過程中證實含完整,mRNA 5,端的序列翻譯為蛋白序列,;,然后用,SignalP,軟件對前,5

3、0,個氨基酸序列,(,從第一個,ATG,對應的甲硫氨酸,Met,開始,),進行評估，如果,SignalP,分析給出正面結(jié)果，則測試序列有可能為信號肽,;,B 信號肽分析,C,終止密碼子,終止密碼子,:TAA,TAG,TGA,GC%=50%,終止密碼子每,64 bp,出現(xiàn)一次；,GC%50%,終止密碼子每,100,200 bp,出現(xiàn)一次；,由于多數(shù)基因,ORF,均多于,50,個密碼子，因此最可能的選擇應該是,ORF,不少于,100,個密碼子。,C 終止密碼子,D 3,端的確認,3,端的確認主要根據(jù),Poly(A),尾序列,若測試,DNA,片段不含,Poly(A),序列，則根據(jù)加尾信號序列,“,A

4、ATAAA,”,和,BLAST,同源性比較結(jié)果共同判斷。,D 3端的確認,E,非編碼序列、內(nèi)含子,高等真核生物多數(shù)外顯子長度少于,100,個密碼子，有的不到,50,個密碼子甚至更少；,E 非編碼序列、內(nèi)含子,F,密碼子偏愛性,編碼同一氨基酸的不同密碼子稱為,同義密碼,，其差別僅在密碼子的第,3,位堿基不同。,不同種屬間使用同義密碼的頻率有很大差異，如人類基因中，丙氨酸（,Ale,）密碼子多為,GCA,GCC,或,GCT,而,GCG,很少使用。,F 密碼子偏愛性,G,外顯子內(nèi)含子邊界,外顯子和內(nèi)含子的邊界有一些明顯的特征，,如,:,內(nèi)含子的,5,端或稱供體位（,donor site,）常見的順序

5、為,5,AG,GTTAAGT-3,；,3,端又稱受體位（,acceptor site),多為,5PyPyPyPyPyPyCAG-3(“Py”,嘧啶核苷酸，,T,或,C),；,G 外顯子內(nèi)含子邊界,H,上游控制序列,幾乎所有基因（或操縱子）上游都有調(diào)控序列，它們可與,DNA,結(jié)合蛋白作用，控制基因表達。,通過同源性比較來預測,mRNA,的,5,端，最常用的與轉(zhuǎn)錄起始位點相關(guān)的數(shù)據(jù)庫是真核啟動子數(shù)據(jù)庫,(The TRADAT Project,Eukaryotic Promoter Database,EPD.http:/www.epd.unil.ch/),。,另外個別生物基因組的,特有組成,也可作為

6、判別依據(jù)，如脊椎動物基因組許多基因的上游都有,CpG,島。,H 上游控制序列,I,軟件預測,采用,NCBI,的,ORF,預測軟件,(ORF finder:http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi),判斷,ORF,的可能范圍。,I 軟件預測,1.2,同源查詢途徑,通過已存入數(shù)據(jù)庫中的基因順序與待查的基因組序列進行比較，從中查找可與之匹配的堿基順序及其比例，用于界定基因的方法稱為同源查詢。,1.2 同源查詢途徑,同源有如下幾種情況：,A DNA,序列某些片段完全相同；,B,開放讀碼框（,ORF,）排列類似，如有長外顯子；,C,開放讀碼框翻譯成氨基酸序列的相

7、似性；,D,模擬多肽高級結(jié)構(gòu)相似,同源有如下幾種情況：,1.3,試驗分析,Northern,雜交確定,DNA,片段是表達序列,.,注意事項：,a,當某一基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行,可變剪接,時，由于連接的外顯子不同，會產(chǎn)生好幾條長度不一的雜交帶,;,如果該基因是某一,基因家族,的成員也會出現(xiàn)多個信息；,b,考慮,組織專一性,和,發(fā)育階段,的問題；,1.3 試驗分析,基因組序列詮釋ppt課件,基因組序列詮釋ppt課件,c,基因表達產(chǎn)物豐度的問題,如果風度較低，用擬,Northern,雜交和動物雜交（,Zoo-blotting,）分析。,擬,Northern,雜交,根據(jù)已知的,DNA,順序設計引物，從,m

8、RNA,群體中擴增基因產(chǎn)物，再以,DNA,為探針與之雜交。,c 基因表達產(chǎn)物豐度的問題,動物園雜交,根據(jù)親緣關(guān)系相似的物種，其基因的,編碼區(qū)相似性較高,，而,非編碼區(qū)的同源性很低,的原理。如果某一物種的,DNA,順序與來自另一親緣物種的,DNA,片段雜交產(chǎn)生陽性信號，該區(qū)段可能含有,1,個或多個基因，這種方法又稱為動物園雜交。,動物園雜交 根據(jù)親緣關(guān)系相似的物種，其基因的編碼區(qū)相似性,基因組序列詮釋ppt課件,2,獲取基因全長,cDNA,序列,A,構(gòu)建,cDNA,文庫，用目的基因,DNA,片段篩選文庫。,2 獲取基因全長cDNA序列A 構(gòu)建cDNA文庫，用目的基因,cDNA,文庫構(gòu)建,(CLO

9、NTECH),cDNA文庫構(gòu)建(CLONTECH),cDNA,文庫構(gòu)建,cDNA文庫構(gòu)建,B,根據(jù)已知片段設計引物，,RACE,技術(shù)得到基因的全長,cDNA,序列。,B 根據(jù)已知片段設計引物，RACE 技術(shù)得到基因的全長cDN,5,RACE,(CLONTECH),5RACE,3,RACE,(CLONTECH),3RACE,基因組序列詮釋ppt課件,基因組序列詮釋ppt課件,3.,確定,DNA,序列中基因的位置,A,通過對全長,cDNA,序列的測序、對比，以及與基因組,DNA,的比較，確定基因所在的區(qū)域；,B,通過物種已建立遺傳圖和物理圖來確定基因的位置；,3.確定DNA序列中基因的位置A 通過

10、對全長cDNA序列的測,4.,實驗確認基因功能,4.1,基因剔除,(knock-out),最簡便的基因失活的方法,.,主要原理,:,在一段無關(guān),DNA,片段的兩側(cè)連接與代換基因,兩側(cè),相同的序列,將這一構(gòu)建導入目的細胞,由于,同源片段之間的重組,可使,無關(guān)片段取代靶基因,整合到染色體中,.,為了便于篩選,用于取代的外源,DNA,中,含有報告基因,.,4.實驗確認基因功能4.1 基因剔除(knock-out),4.2,基因超表達,通過增加基因的,拷貝數(shù),和采用,強啟動子,促使基因,超表達,致使受體表現(xiàn)出生長與發(fā)育的異常,來研究基因的功能,.,4.2 基因超表達,4.3,反義,RNA,反義,RNA

11、,是由基因的負鏈編碼,可與正義,RNA(sense RNA),或,DNA,編碼順序結(jié)合,干擾,mRNA,的轉(zhuǎn)錄,加工和轉(zhuǎn)運,調(diào)控基因的表達,.,4.3反義RNA 反義RNA是由基因的負鏈,構(gòu)建反義,RNA,表達載體,:,將全目的基因或部分目的基因反向插入表達載體,轉(zhuǎn)化目標生物 獲得轉(zhuǎn)基因個體或品系 分析轉(zhuǎn)基因植株在生理、生化、形態(tài)等方面的變異 判別目的基因的功能,構(gòu)建反義RNA 表達載體:,正義表達載體,反義表達載體,正義表達載體反義表達載體,反義,RNA,作用機理：,A,干擾翻譯的起始與延伸,，可與翻譯起始順序及編碼序列結(jié)合形成雙鏈,RNA,，隨之被細胞降解。,B,與,mRNA,的引導順序結(jié)

12、合，阻止核糖體的附著，使,翻譯無法啟動,。,C,反義,RNA,與,mRNA,形成雙鏈分子后，使,RNA,多聚酶脫離模板,轉(zhuǎn)錄終止,。,反義RNA 作用機理：,4.4 RNAi,干涉,RNAi,干涉是通過,雙鏈,RNA,的介導,特異性地降解相應序列的,mRNA,從而阻斷相應基因表達的,轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機制,.,4.4 RNAi干涉 RNAi干涉是通過雙鏈,RNAi,作用機理,A dsRNA,核酸內(nèi)切酶,Dicer,被激活,它把,dsRNA,加工成,21,25,個核苷酸長的,RNA,鏈,;,B,這些小片段,RNA(siRNA),作為另一個核糖核酸復合體,RISC(RNA-induce sile

13、ncing complex,RNA,誘導沉默復合體,),的指引物,結(jié)合到,RISC,上,使之識別并降解,mRNA,從而導致與雙鏈,RNA,同源的基因沉默,;,RNAi 作用機理A dsRNA核酸內(nèi)切酶Dicer被激活,基因組序列詮釋ppt課件,RNAi,設計方法及應用,A Fraser,合成,與開放讀碼框相對應的雙鏈,RNA,或利用,細菌克隆表達,這些雙鏈,RNA,微量注射和喂食,干擾同源基因的表達,B Chuang,等設計出嵌合體結(jié)構(gòu) 連接強啟動子大量表達雙鏈,mRNA,干擾同源基因的表達,RNAi設計方法及應用,HbF,基因的,RNAi,載體構(gòu)建,HbF基因的RNAi載體構(gòu)建,RNAi,技

14、術(shù)的優(yōu)缺點,RNAi,最根本的特點是特異性,RNAi,具有特殊的,穿越能力,如將雙鏈,RNA,注射在線蟲,性腺,里,它也會干擾到,體細胞,里的基因表達,而且干擾作用會,傳給后代,;,RNAi,對一些低水平表達的基因的,RNAi,現(xiàn)象并不明顯,而且?guī)讉€有相同或相似序列的基因,RNAi,也會同時作用與它們,.,RNAi技術(shù)的優(yōu)缺點RNAi最根本的特點是特異性,4.5,酵母雙雜交（,yeast two-hybridization,）,原理：,其原理涉及轉(zhuǎn)錄因子與啟動子之間的互作。,正常條件下,：,轉(zhuǎn)錄因子（包括兩個功能區(qū)域）,結(jié)合功能域,同基因上游的區(qū)段結(jié)合,激活功能域,激活,RNA,多聚酶 將基因轉(zhuǎn)錄為,mRNA,4.5 酵母雙雜交（yeast two-hybridizat,酵母雜交系統(tǒng)中：,融合表達載體,1,融合表達載體,2,DNA,結(jié)合功能域,+,目的片段,激活功能域,+,多種未知,cDNA,融合表達載體,1,同一細胞,融合表達載體,2,形成聚合物，啟動報告基因的表達,表達載體共轉(zhuǎn)化,酵母雜交系統(tǒng)中：DNA結(jié)合功能域激活功能域+,