環(huán)境生物技術(shù)

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1、第 八 章 污 染 物 生 物 毒 性 和 致 突 變 性 的微 生 物 學(xué) 監(jiān) 測(cè) 方 法第 一 節(jié) 污 染 物 生 物 毒 性 的 微 生 物 監(jiān) 測(cè) 方 法第 二 節(jié) 污 染 物 致 突 變 性 的 微 生 物 監(jiān) 測(cè) 方 法 生 物 測(cè) 試 （ Bioassay） 的 概 念 ： 指 系 統(tǒng) 地 利 用 生 物 的 反 應(yīng) 測(cè) 定 一 種 或 多 種 污 染 物 或 環(huán) 境因 素 單 獨(dú) 或 聯(lián) 合 存 在 時(shí) 所 導(dǎo) 致 的 影 響 或 危 害 。 注 釋 1： 所 利 用 的 生 物 反 應(yīng) 包 括 分 子 、 細(xì) 胞 、 組 織 、 器官 、 個(gè) 體 、 種 群 、 群 落 、

2、生 態(tài) 系 統(tǒng) 各 級(jí) 水 平 上 的 反 應(yīng) 。 注 釋 2： 生 物 測(cè) 試 不 同 于 常 規(guī) 的 物 理 、 化 學(xué) 檢 測(cè) 。 前 者能 夠 測(cè) 定 污 染 物 對(duì) 生 物 機(jī) 體 的 影 響 ， 而 后 者 只 能 測(cè) 定 污染 物 的 濃 度 。 例 如 ： 通 過(guò) 水 污 染 的 生 物 測(cè) 試 可 獲 得 以 下 數(shù) 據(jù) ： 各 種 環(huán)境 因 素 如 DO、 pH、 溫 度 、 混 濁 度 等 對(duì) 生 命 的 有 利 以 及不 利 的 濃 度 或 強(qiáng) 度 ； 污 染 物 對(duì) 受 測(cè) 生 物 的 毒 性 ； 各 種 水生 生 物 對(duì) 污 染 物 的 相 對(duì) 敏 感 性 ； 廢

3、水 所 應(yīng) 處 理 的 程 度 ；允 許 的 污 染 物 排 放 濃 度 等 。 毒 性 試 驗(yàn) 常 用 參 數(shù) 致 死 劑 量 或 致 死 濃 度 （ Lethal Dose， Lethal Concentration） 絕 對(duì) 致 死 劑 量 或 致 死 濃 度 （ LD100、 LC100） 半 數(shù) 致 死 劑 量 或 濃 度 （ LD50、 LC50） 最 小 致 死 劑 量 或 濃 度 （ MLD、 MLC） 最 大 耐 受 劑 量 或 濃 度 （ LD0、 LC0 ） 最 大 無(wú) 作 用 劑 量 （ Maximum No effect Level） 每 日 容 許 攝 入 量 （

4、Acceptable Daily Intake） 最 高 容 許 濃 度 （ Maximum Allowable Concentration） 毒 作 用 帶 急 性 毒 作 用 帶 （ Acute toxic Effect Zone） 慢 性 毒 作 用 帶 （ Chronic toxic Effect Zone ） 半 數(shù) 效 應(yīng) 濃 度 （ EC50） 和 半 數(shù) 抑 制 濃 度（ IC50） :影 響 或 抑 制 微 生 物 正 常 生 理 指 標(biāo)值 50%所 需 的 待 測(cè) 物 濃 度 。 檢 測(cè) 毒 性 的 手 段 ： 動(dòng) 物 檢 測(cè) 、 微 生 物 檢 測(cè)l動(dòng) 物 檢 測(cè) 急 性

5、 毒 性 ： 研 究 化 學(xué) 物 質(zhì) 大 劑 量 一 次 染 毒或 24小 時(shí) 內(nèi) 多 次 染 毒 動(dòng) 物 所 引 起 的 毒 性 的 試 驗(yàn) 。 其 目 的 是 短 期 內(nèi) 了 解 該 物 質(zhì) 的 毒 性 大 小 和 特 點(diǎn) ，并 為 進(jìn) 一 步 開 展 其 他 毒 性 試 驗(yàn) 提 供 設(shè) 計(jì) 依 據(jù) 。 急 性 毒 性 試 驗(yàn) 類 型l哺 乳 動(dòng) 物 急 性 毒 性 試 驗(yàn) 水 生 生 物 急 性 毒 性 試 驗(yàn) 蚯 蚓 急 性 毒 性 試 驗(yàn) 觀 察 時(shí) 間 為 2周 ， 以 半 數(shù) 致 死 濃 度 LC 50表 示 。 微 生 物 檢 測(cè) 選 擇 一 項(xiàng) 或 幾 項(xiàng) 生 理 指 標(biāo) 為

6、 指 征 ， 根 據(jù)代 謝 物 影 響 或 抑 制 這 些 指 征 的 程 度 來(lái) 判 斷 毒 性 的 強(qiáng)度 。 評(píng) 價(jià) 指 標(biāo) 多 為 EC50或 IC50 一 、 發(fā) 光 細(xì) 菌 細(xì) 菌 生 物 發(fā) 光 抑 制 試 驗(yàn)細(xì) 菌 生 物 發(fā) 光 的 生 物 學(xué) 機(jī) 制 ：FMNH2 + RCHO +O2 FMN + H2O + RCOOH + 光420-670nm的 可 見 光 細(xì) 菌 生 物 發(fā) 光 抑 制 試 驗(yàn) 是 國(guó) 際 標(biāo) 準(zhǔn) 化 組 織 認(rèn) 可 ， 也 列為 我 國(guó) 水 質(zhì) 評(píng) 價(jià) 的 國(guó) 家 標(biāo) 準(zhǔn) 方 法 。第 一 節(jié) 污 染 物 生 物 毒 性 的 微 生 物 監(jiān) 測(cè) 方 法

7、細(xì) 菌 熒 光 素 酶 （ 一 ） 試 驗(yàn) 原 理 毒 物 細(xì) 菌 熒 光 素 酶 活 性 或 細(xì) 胞 呼 吸 受 到 抑 制 發(fā) 光 能 力 減 弱 （ 比 例 關(guān) 系 ） 光 電 測(cè) 定 裝 置 測(cè)出 發(fā) 光 強(qiáng) 度 的 變 化 菌 株 ： 應(yīng) 用 最 多 的 是 明 亮 發(fā) 光 桿 菌 美 國(guó) 貝 克 曼 (Beckman) 公 司 制 造 的 微 量 毒 性 分析 儀 就 是 一 種 發(fā) 光 細(xì) 菌 檢 測(cè) 儀 ， 操 作 極 為 方 便 ，測(cè) 定 一 個(gè) 樣 品 不 到 半 小 時(shí) ， 所 得 結(jié) 果 與 魚 類 毒 性試 驗(yàn) 一 致 。 （ Microtox） ,國(guó) 際 通 用 ，

8、 使 用 最 為 廣泛 的 微 生 物 學(xué) 檢 測(cè) 方 法 。 凍 干 菌 種 ： 篩 選 、 培 養(yǎng) 的 明 亮 發(fā) 光 桿 菌 ， 真 空 冷凍 干 燥 （ 加 保 護(hù) 劑 ， 緩 沖 物 質(zhì) ， NaCl等 ） ， -2025 C保 存 。 （ 二 ） 試 驗(yàn) 方 法 菌 種 復(fù) 蘇 ： 2%NaCl， 懸 液 樣 品 處 理 ： 系 列 稀 釋 ， 調(diào) pH6-8， 滲 透 壓 2%NaCl 毒 性 測(cè) 定 ： 測(cè) 試 管 加 入 樣 品 和 菌 液 ， 以 苯 酚 作 陽(yáng)性 有 機(jī) 毒 物 對(duì) 照 ， 以 ZnSO4.7H2O作 陽(yáng) 性 無(wú) 機(jī) 毒物 對(duì) 照 ， 蒸 餾 水 為 陰

9、性 對(duì) 照 。 15oC培 養(yǎng) 5min或15min。 光 量 抑 制 百 分 率 ： （ 陰 性 對(duì) 照 組 指 標(biāo) 值 -實(shí) 驗(yàn) 組 指 標(biāo) 值 ） 陰 性 對(duì) 照 組 指 標(biāo) 值 通 過(guò) 回 歸 方 程 計(jì) 算 IR為 50%時(shí) 的 樣 品 劑 量 ， IC 50 質(zhì) 量 控 制 ： 同 一 劑 量 平 行 管 間 的 發(fā) 光 強(qiáng) 度 差 異 值 小 于 20%，苯 酚 和 硫 酸 鋅 的 IC50有 一 定 范 圍 。 x100%IR= （ 三 ） 方 法 評(píng) 價(jià) 與 傳 統(tǒng) 魚 類 96h毒 性 試 驗(yàn) 相 比 具 有 良 好 的 一 致 性 。 1991年 Diane對(duì) 100種

10、化 學(xué) 物 質(zhì) 的 毒 性 測(cè) 試 結(jié) 果表 明 兩 者 的 相 關(guān) 系 數(shù) 達(dá) 0.85。 可 以 根 據(jù) 細(xì) 菌 生 物 發(fā) 光 試 驗(yàn) 的 發(fā) 光 抑 制 率 進(jìn) 行 毒性 分 級(jí) 。 各 實(shí) 驗(yàn) 室 間 結(jié) 果 的 重 現(xiàn) 性 好 可 用 于 生 物 傳 感 器 分 析 國(guó) 際 標(biāo) 準(zhǔn) 化 組 織 將 該 方 法 作 為 檢 測(cè) 化 合 物 或 廢 水 毒性 的 標(biāo) 準(zhǔn) 方 法 之 一 （ ISO 9509） 。（ 一 ） 試 驗(yàn) 原 理 毒 性 污 染 物 抑 制 硝 化 作 用 的 酶 類 ， 導(dǎo) 致 對(duì) 底 物 的利 用 能 力 或 產(chǎn) 物 的 生 成 量 下 降 。 通 過(guò) 測(cè)

11、 定 底 物 或產(chǎn) 物 的 變 化 來(lái) 檢 測(cè) 毒 性 作 用 的 程 度 。 利 用 亞 硝 化 單 胞 菌 或 硝 化 桿 菌 屬 ， 或 用 活 性 污 泥 。二 、 硝 化 細(xì) 菌 硝 化 作 用 抑 制 試 驗(yàn) （ 二 ） 試 驗(yàn) 方 法 （ 以 硝 化 桿 菌 屬 為 例 ） 增 殖 細(xì) 菌 至 108個(gè) /ml。 加 入 菌 液 、 NaNO2溶 液 及 樣 品 （ 不 同 濃 度 ） ， 以蒸 餾 水 為 對(duì) 照 。 培 養(yǎng) （ 30oC4h)、 檢 測(cè) NO2- 比 較 樣 品 組 與 對(duì) 照 組 硝 化 作 用 強(qiáng) 度 ， 可 得 IC50與 Microtox靈 敏 度 相

12、 當(dāng) ， 與 魚 類 毒 性 試 驗(yàn) 結(jié) 果 的 相關(guān) 性 為 0.45。 美 國(guó) 國(guó) 家 環(huán) 保 局 認(rèn) 可 的 毒 性 測(cè) 試 方 法 。（ 一 ） 實(shí) 驗(yàn) 原 理 藻 類 對(duì) 水 體 污 染 反 應(yīng) 十 分 敏 感 。 毒 物 抑 制 光 合 作 用 ，藻 類 生 長(zhǎng) 量 減 少 。 常 用 硅 藻 、 柵 藻 、 小 球 藻 。（ 二 ） 試 驗(yàn) 方 法 繁 殖 藻 種 配 制 培 養(yǎng) 基 ， 滅 菌 。 加 入 待 測(cè) 物 ， 接 種 。 培 養(yǎng) 。 恒 溫 （ 28-30 C） ， 光 照 。 測(cè) 定 生 長(zhǎng) 量 （ 或 其 他 指 標(biāo) ） ， 繪 制 生 長(zhǎng) 曲 線 。 計(jì) 算

13、最 大 生 長(zhǎng) 率 。 （ max）（ 三 ） 結(jié) 果 與 評(píng) 價(jià) 三 、 藻 類 生 長(zhǎng) 抑 制 試 驗(yàn) 又 稱 為 微 型 生 物 群 落 監(jiān) 測(cè) 法 ， 廣 泛 用 于 水 環(huán) 境 的 毒 性監(jiān) 測(cè) 與 評(píng) 價(jià) 。 微 生 物 包 括 細(xì) 菌 、 真 菌 、 原 生 動(dòng) 物 、 藻類 及 小 型 輪 蟲 。 國(guó) 家 標(biāo) 準(zhǔn) ： 水 質(zhì) 微 型 生 物 群 落 監(jiān) 測(cè) PFU法 ( (GB/T 12990-91) （ 一 ） 試 驗(yàn) 原 理 正 常 條 件 下 自 然 水 環(huán) 境 的 微 型 生 物 群 落 種 類 、 分 布 、構(gòu) 成 有 一 定 規(guī) 律 ， 外 界 環(huán) 境 因 素 的

14、干 擾 下 ， 群 落 的 平衡 被 破 壞 ， 結(jié) 構(gòu) 特 征 也 隨 之 變 化 。 通 過(guò) 分 析 微 型 群 落結(jié) 構(gòu) 和 功 能 參 數(shù) ， 判 斷 水 環(huán) 境 的 質(zhì) 量 狀 況 或 污 染 物 質(zhì)的 毒 性 特 征 。 檢 測(cè) 結(jié) 果 有 很 強(qiáng) 的 生 態(tài) 學(xué) 意 義 。 PFU法是 在 群 落 水 平 上 的 ,是 較 物 種 水 平 、 種 群 水 平 更 高 的 ,因 此 它 能 提 供 較 大 的 環(huán) 境 真 實(shí) 性 。四 、 原 生 動(dòng) 物 微 尺 度 群 落 級(jí) 毒 性 試 驗(yàn) 最 常 用 的 方 法 是 PFU（ 聚 氨 酯 泡 沫 塑 料 塊 ） 法 。 聚 氨

15、 酯 泡 沫 塑 料 塊 的 孔 徑 100-150um， 微 型 生 物 可以 進(jìn) 入 其 內(nèi) ， 能 收 集 到 85%的 種 類 ， 具 有 環(huán) 境 真 實(shí)性 。 一 定 時(shí) 間 內(nèi) ， 原 生 動(dòng) 物 種 群 構(gòu) 成 會(huì) 達(dá) 到 平 衡 ，而 有 害 物 會(huì) 破 壞 這 一 平 衡 ， 比 較 試 驗(yàn) 組 和 對(duì) 照 組 的群 落 結(jié) 構(gòu) 和 功 能 參 數(shù) ， 即 可 評(píng) 價(jià) 水 體 質(zhì) 量 與 污 染 程度 。 （ 二 ） 試 驗(yàn) 方 法 與 評(píng) 價(jià)把 PFU分 別 浸 入 對(duì) 照 水 體 和 調(diào) 查 水 體 ， 不 同 時(shí) 段 后 ，擠 出 液 體 ， 對(duì) 原 生 動(dòng) 物 鑒 定

16、 和 計(jì) 數(shù) 。PFU中 微 型 生 物 的 結(jié) 構(gòu) 與 功 能 參 數(shù) ： 異 養(yǎng) 性 指 數(shù) （ HI） =微 型 生 物 灰 份 量 /葉 綠 素 a量 原 生 動(dòng) 物 群 落 多 樣 性 指 數(shù) （ d） =（ S-1） /lnN (S為 原 生 動(dòng) 物 種 類 數(shù) ， N為 10ml擠 出 液 中 原 生 動(dòng)物 個(gè) 數(shù) ） T90 ： 達(dá) 到 90%Seq所 需 的 時(shí) 間 （ Seq： 平 衡 時(shí) 原生 動(dòng) 物 種 數(shù) ） G:原 生 動(dòng) 物 群 集 速 度 常 數(shù)評(píng) 價(jià) ： 污 染 程 度 高 ， S、 d降 低 嚴(yán) 重 污 染 的 水 域 中 ， 原 生 動(dòng) 物 的 群 集 速

17、 度 亦 很 低 ，隨 著 水 質(zhì) 的 清 潔 程 度 提 高 ， 原 生 動(dòng) 物 的 群 集 速 度亦 迅 速 提 高 。 溢 流 口 24小 時(shí) 內(nèi) 僅 群 集 了 3種 耐 污鞭 毛 蟲 。 而 通 惠 河 沿 岸 的 站 點(diǎn) ， 如 24小 時(shí) 內(nèi) ， 雙橋 站 點(diǎn) 群 集 了 19種 ， 東 關(guān) 站 點(diǎn) 群 集 了 33種 ， 對(duì) 照站 點(diǎn) 溫 榆 河 群 集 了 37種 。 檢 測(cè) 待 測(cè) 物 的 毒 性 （ 種 類 損 傷 法 ） ： 清 潔 水 體 中 浸 泡 的 PFU擠 出 液 （ 接 近 平 衡 期 的 、未 成 熟 的 群 落 。 未 成 熟 群 落 要 比 成 熟 群

18、 落 對(duì) 污 染的 毒 性 反 應(yīng) 敏 感 得 多 ） 混 合 不 同 濃 度 的 待 測(cè) 物 ，培 養(yǎng) 一 定 時(shí) 間 后 鏡 檢 原 生 動(dòng) 物 種 數(shù) ， 計(jì) 算 待 測(cè) 物影 響 原 生 動(dòng) 物 種 數(shù) 的 EC50（ median effect concentration ， 半 數(shù) 效 應(yīng) 濃 度 ） （ 一 ） 脫 氫 酶 活 性 試 驗(yàn)原 理 ： 脫 氫 酶 作 用 下 ， 無(wú) 色 的 氯 化 三 苯 基 四 氮 唑 （ TTC）受 氫 后 變 為 紅 色 的 三 苯 甲 基 （ TF） ， 分 光 光 度 計(jì)485nm處 比 色 ， 通 過(guò) 標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線 求 的 TF產(chǎn) 生

19、 量 ， 計(jì)算 脫 氫 酶 活 性 。 可 以 得 出 待 測(cè) 物 的 EC50.五 、 活 性 污 泥 毒 性 檢 測(cè) 法 （ 二 ） 呼 吸 抑 制 試 驗(yàn) 有 毒 物 抑 制 微 生 物 呼 吸 作 用 ， 使 耗 氧 量 和 CO2的產(chǎn) 生 量 下 降 。 檢 測(cè) 化 合 物 和 廢 水 毒 性 。 瓦 勃 氏 呼 吸 儀 測(cè) 定 消 耗 的 氧 量 ： 堿 溶 液 吸 收 CO2， 反 應(yīng) 瓶 中 壓 力 的 降 低 完 全 是 氧 消耗 的 結(jié) 果 。 溶 解 氧 電 極 測(cè) 定 耗 氧 量 ： 瓶 塞 上 的 溶 解 氧 電 極 記 錄 溶 解 氧 ； 相 對(duì) 耗 氧 速 率 =

20、污 泥 的 呼 吸 好 氧 速 率 /內(nèi) 源 性 呼 吸好 氧 速 率 x100% 優(yōu) 點(diǎn) ： 簡(jiǎn) 便 靈 敏 快 速 經(jīng) 濟(jì)缺 點(diǎn) ： 檢 測(cè) 結(jié) 果 有 一 定 范 圍 的 變 異 性 ； 不 能 完 全 代 替 哺 乳 動(dòng) 物 毒 性 試 驗(yàn) 。適 用 ： 快 速 篩 選 大 批 量 樣 品 用 細(xì) 菌 生 物 發(fā) 光 抑 制 試 驗(yàn) ， 廢 水 處 理 影 響 效 果 用 活 性 污 泥 毒 性 檢 測(cè) 法 ， 評(píng) 價(jià) 水 質(zhì) 的 生 態(tài) 學(xué) 特 征 用 微 尺 度 群 落 級(jí) 毒 性 試 驗(yàn) 。微 生 物 學(xué) 檢 測(cè) 方 法 的 評(píng) 價(jià) 一 、 基 因 突 變 試 驗(yàn)（ 一 ） 鼠

21、傷 寒 沙 門 氏 菌 /哺 乳 動(dòng) 物 微 粒 體 試 驗(yàn)（ Ames試 驗(yàn) ）1、 原 理野 生 型 his+ 營(yíng) 養(yǎng) 缺 陷 性 his+ 致 突 變 物 可 使 該 菌 的 基 因 發(fā) 生 回 復(fù) 突 變 。美 國(guó) Ames教 授 1975年 正 式 建 立 的 方 法第 二 節(jié) 污 染 物 致 突 變 性 的 微 生 物 檢 測(cè) 方 法正 向 突 變回 復(fù) 突 變 試 驗(yàn) 菌 株 ： 曾 推 薦 的 5株 ： TA1535、 TA1537、 TA1538、 TA98、TA100 83年 修 訂 之 后 ： TA97、 TA98、 TA100、 TA102 賦 予 其 他 附 加 突

22、變 ： uvrB突 變 ： 失 去 DNA切 割 修 復(fù) 能 力 ， 敏 感 性 增 加 ； rfa突 變 ： 脂 多 糖 屏 障 卻 失 ， 大 分 子 透 入 ； 組 入 某 些 質(zhì) 粒 提 高 回 變 能 力 。后 來(lái) 一 套 6株 組 氨 酸 缺 陷 型 菌 株 ： TA7001、 TA7002、 TA7003、 TA7004、 TA7005、 TA7006.方 便 檢 出 堿 基 的變 異 。每 次 試 驗(yàn) 可 使 用 一 種 或 幾 種 菌 株 ， 只 要 有 任 何 一 株 發(fā) 生 大 量的 回 復(fù) 突 變 ， 即 為 陽(yáng) 性 結(jié) 果 。 哺 乳 動(dòng) 物 微 粒 體 酶 ： 微

23、粒 體 中 含 有 混 合 功 能 的 氧 化 酶 系 ； 有 降 解 作 用 ： 把 化 學(xué) 物 變 成 低 毒 或 無(wú) 毒 物 排 出 ； 有 激 活 作 用 ： 使 化 學(xué) 物 變 成 具 有 親 電 子 性 質(zhì) ， 導(dǎo)致 毒 性 增 強(qiáng) ， 成 為 致 突 變 物 或 致 癌 物 。 哺 乳 動(dòng) 物 微 粒 體 酶 系 統(tǒng) （ 簡(jiǎn) 稱 S9混 合 液 ） ： 從 肝勻 漿 中 制 取 ； 加 入 S9混 合 液 使 體 外 測(cè) 試 條 件 更 接 近 于 人 體 內(nèi) 代謝 條 件 。 2、 試 驗(yàn) 方 法紙 片 點(diǎn) 試 法 ：基 礎(chǔ) 培 養(yǎng) 基 +菌 液 +S9+表 層 培 養(yǎng) 基紙

24、片 蘸 取 待 測(cè) 物 至 于 培 養(yǎng) 皿 中 間培 養(yǎng) 37oC,48h,觀 察 結(jié) 果 。長(zhǎng) 出 密 集 菌 落 的 為 陽(yáng) 性 ， 只 長(zhǎng) 出 少 量 散 在 菌 落 的 為陰 性 。平 皿 摻 入 法 ： 最 高 的 誘 發(fā) 回 變 菌 落 數(shù) 為 自 發(fā) 回 變 菌落 數(shù) 的 2倍 或 以 上 屬 陽(yáng) 性 結(jié) 果 。 3、 應(yīng) 用 與 評(píng) 價(jià) 175種 已 知 致 癌 物 進(jìn) 行 試 驗(yàn) ， 發(fā) 現(xiàn) 157種 為 陽(yáng) 性 ，陽(yáng) 性 吻 合 率 90%； 陰 性 吻 合 率 87%。 初 篩 報(bào) 警 手 段 。 已 被 我 國(guó) 食 品 安 全 毒 理 學(xué) 評(píng) 價(jià) 程 序 、 農(nóng) 藥 登

25、 記 毒理 學(xué) 試 驗(yàn) 方 法 、 新 藥 毒 理 學(xué) 研 究 指 導(dǎo) 原 則 、 化 妝品 安 全 性 評(píng) 價(jià) 程 序 和 方 法 等 列 為 評(píng) 價(jià) 致 突 變 性 的必 做 試 驗(yàn) 。 1、 原 理 致 突 變 物 使 發(fā) 光 細(xì) 菌 暗 變 異 菌 株 突 變 ， 恢 復(fù) 一 定的 發(fā) 光 能 力 。 菌 株 ： 蝠 魚 發(fā) 光 桿 菌 的 暗 變 異 菌 株 SD-18和 RC93、費(fèi) 氏 弧 菌 的 暗 變 異 株 Pf-13、 明 亮 發(fā) 光 桿 菌 T3小 種的 暗 變 異 株 T9171。2、 方 法細(xì) 菌 復(fù) 蘇 、 增 殖 、 分 裝 測(cè) 試 管 培 養(yǎng) （ 20 C、

26、） 、 24h后 開 始 測(cè) 發(fā) 光 強(qiáng) 度 ， 以 后 每 隔 3-4天 測(cè) 定 一 次 。發(fā) 光 強(qiáng) 度 為 對(duì) 照 管 發(fā) 光 強(qiáng) 度 的 3倍 或 以 上 即 為 陽(yáng) 性 。（ 二 ） 發(fā) 光 細(xì) 菌 試 驗(yàn) （ 一 ） SOS顯 色 試 驗(yàn) SOS修 復(fù) 是 指 DNA受 到 嚴(yán) 重 損 傷 、 細(xì) 胞 處 于 危 急狀 態(tài) 時(shí) 所 誘 導(dǎo) 的 一 種 DNA修 復(fù) 方 式 ， 修 復(fù) 結(jié) 果 只是 能 維 持 基 因 組 的 完 整 性 ， 提 高 細(xì) 胞 的 生 存 率 ，但 留 下 的 錯(cuò) 誤 較 多 ， 故 又 稱 為 錯(cuò) 誤 傾 向 修 復(fù)（ error-prone rep

27、air） ， 使 細(xì) 胞 有 較 高 的 突 變 率 。 致 突 變 物 DNA損 傷 細(xì) 菌 SOS修 復(fù) 測(cè) 定SOS修 復(fù) 能 力 （ 通 過(guò) 大 腸 桿 菌 PQ37菌 株 的 顯色 反 應(yīng) ） 二 、 DNA損 傷 修 復(fù) 試 驗(yàn) PQ37菌 株 的 特 點(diǎn) ： 操 縱 子 融 合 方 法 構(gòu) 建 的 ， 將SOS反 應(yīng) 網(wǎng) 絡(luò) 中 的 sfiA基 因 與 編 碼 -半 乳 糖 苷 酶的 基 因 lacZ融 合 在 一 起 （ 報(bào) 告 基 因 ） ， -半 乳糖 苷 酶 通 過(guò) Xgal培 養(yǎng) 基 和 ONPG培 養(yǎng) 基 來(lái) 顯 色 ，分 別 產(chǎn) 生 藍(lán) 色 和 黃 色 。 定 性

28、試 驗(yàn) ： Xgal培 養(yǎng) 基 平 板 ， 紙 片 點(diǎn) 試 ,出 現(xiàn) 藍(lán) 色 色 素 即 為 陽(yáng) 性 。 定 量 試 驗(yàn) ： 液 體 培 養(yǎng) 基 （ 含 待 測(cè) 樣品 ） ,37C,2h ,加 入 ONPG顯 色 一 定 程度 ， 終 止 反 應(yīng) ， 420nm處 測(cè) 吸 光 度 。 R大 于 2且 具 有 劑 量 關(guān) 系 ， 則 為 陽(yáng) 性 結(jié) 果 。 應(yīng) 用 評(píng) 價(jià) ： 敏 感 性 與 準(zhǔn) 確 性 與 Ames試 驗(yàn) 相當(dāng) ， 某 些 方 面 優(yōu) 于 后 者 ， 可 以 相 互 補(bǔ) 充 。 （ 二 ） 聚 合 酶 缺 陷 型 菌 株 試 驗(yàn)致 癌 物 使 DNA受 損 ， 聚 合 酶 缺

29、陷 型 菌 株 在 DNA受 損后 無(wú) 修 復(fù) 能 力 ， 不 能 生 存 ， 抑 菌 圈 出 現(xiàn) 。 E.coli P3478(polA-),對(duì) 照 為 野 生 型 菌 株 E.coli W3110(polA+)。 點(diǎn) 試 法 、 混 菌 法 ， 分 別 出 現(xiàn) 抑 菌 圈 和 有 空 白 的 生長(zhǎng) 線 （ 抑 菌 現(xiàn) 象 ） 。 對(duì) 直 接 突 變 作 用 的 烷 化 劑 較 為 敏 感 ， 對(duì) 需 要 代 謝活 化 的 化 合 物 不 敏 感 。 （ 三 ） 重 組 缺 陷 型 菌 株 試 驗(yàn)重 組 缺 陷 型 菌 株 失 去 修 復(fù) 能 力 ，致 癌 性 物 質(zhì) 使 DNA受 損 ，

30、重 組 缺 陷 型 菌 株 不 能 生 長(zhǎng) ，原 理 與 聚 合 酶 缺 陷 型 菌 株 試 驗(yàn) 相 似 。枯 草 芽 孢 桿 菌 H17(recA+） 對(duì) 照 ， 全 線 生 長(zhǎng)枯 草 芽 孢 桿 菌 M45(recA-） 試 驗(yàn) ， 抑 菌 現(xiàn) 象 （ 四 ） 溶 源 性 細(xì) 菌 試 驗(yàn)原 理 ： 原 噬 菌 體 誘 變 劑 烈 性 噬 菌 體 （ 噬 菌 體 誘 導(dǎo)現(xiàn) 象 ） 裂 解 非 溶 源 性 細(xì) 菌 （ 作 為 指 示 菌 ） 固 體 培 養(yǎng) 基上 出 現(xiàn) 噬 菌 斑菌 株 ： E.colik12( ) 溶 源 性 E.colik12(S) 指 示 菌方 法 ： 同 時(shí) 將 兩

31、菌 株 接 種 于 一 個(gè) 培 養(yǎng) 基 平 板 上 ， 加入 受 試 物 ， 經(jīng) 一 夜 培 養(yǎng) ， 觀 察 噬 菌 斑 。 三 、 DNA重 組 試 驗(yàn)致 突 變 物 DNA損 傷 整 個(gè) 基 因 組 的 有 絲 分 裂 重 組增 強(qiáng) 釀 酒 酵 母 D7的 異 點(diǎn) 等 位 基 因 (trp5-12/trp5-27)突 變 體 （ trp-)轉(zhuǎn) 變 為 野 生 型 四 、 微 生 物 致 突 變 試 驗(yàn) 與 致 癌 物 的 確 定 大 多 數(shù) 致 癌 物 具 有 致 突 變 作 用 ， 非 致 癌 物 不 具 有致 突 變 作 用 。 致 癌 可 能 性 需 要 一 組 試 驗(yàn) 配 套 進(jìn) 行 檢 測(cè) ， 包 含 5種 遺 傳 學(xué) 終點(diǎn) 試 驗(yàn) ： 完 整 性 的 改 變 ， 重 排 或 交 換 ， 堿基 序 列 改 變 （ 突 變 ） ， 染 色 體 畸 變 ， 染 色 體 分 離改 變 。 粗 篩 、 報(bào) 警 ， 快 速 、 靈 敏 、 經(jīng) 濟(jì) 。