《基因工程的基本操作程序》

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1、1.2 基因工程的基本操作程序,,,,,1、目的基因的獲取,2、基因表達載體的構(gòu)建,3、將目的基因?qū)胧荏w細胞,4、目的基因的檢測與鑒定,基因工程基本操作的四個步驟,有了目的基因,我們才能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性。,使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在,并可進行遺傳、表達和發(fā)揮作用,載體進入受體細胞穩(wěn)定表達,才能實現(xiàn)一種生物的基因在另一種生物中的轉(zhuǎn)化。,才能確定目的基因是否真正在受體細胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達。,一、目的基因的獲取,(一)、目的基因主要是______________________,編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因,請舉出三個以上的例子,(二)、獲取目的基因的常用方法有哪些?,1、從基因

2、文庫中獲取,2、利用PCR技術(shù)擴增,3、人工合成,一、目的基因的獲取,(一)從基因文庫中直接獲取,1.基因文庫:,2.基因文庫的分類:按外源DNA片段的來源分類,種類,,基因組DNA文庫:含有一種生物的全部基因,部分基因文庫:只包含了一種生物的部分基因, 如:cDNA文庫,3.基因文庫的目的,為了在不知目的基因序列的情況下,便于獲得所需的目的基因。,4.獲取目的基因的根據(jù):,提取某種生物的全部DNA,用適當?shù)南拗泼盖?一定大小的DNA片段,將DNA片段與載體連接,導入受體菌中儲存,,,基因組文庫,,5.基因文庫的構(gòu)建方法之一,(1)直接分離法(鳥槍法),某種生物的單鏈mRNA,單鏈

3、互補DNA,雙鏈cDNA片段,導入受體菌中儲存,與載體連接,,,,,cDNA文庫,反(逆)轉(zhuǎn)錄酶,DNA聚合酶,反轉(zhuǎn)錄法:cDNA的合成流程圖解,5.基因文庫的構(gòu)建方法之,,基因組文庫和部分基因組文庫(cDNA文庫)比較,2、利用PCR技術(shù)擴增目的基因,四種脫氧核苷酸(dNTP),一對引物:,熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶),模板DNA( 需含有目的基因 ),Mg2+(激活劑),條件:,緩沖溶液,一對寡核苷酸序列:與目的基因的起始段互補,一段已知目的基因的核苷酸序列,以便根據(jù)這一序列合成引物,前提:,,過程,高溫變性(解旋為單鏈),低溫退火(引物與單鏈互補結(jié)合),適溫延伸(在Taq酶的作用下合成

4、 與模板互補的DNA雙鏈),重復循環(huán),,,,預變性(增加DNA變性的概率),,2、具體過程,PCR(多聚酶鏈式反應), 概念:PCR全稱為_______________,是一項 在生物____復制___________的核酸合成技術(shù),條件:_______________________、 _______________、___________ 、 ___________.等,原理:__________,方式:以_____方式擴增,即____(n為擴增循 環(huán)的次數(shù)),結(jié)果:,聚合酶鏈式反應,體外,特定DNA片段,DNA復制,四種脫氧核苷酸,一對引物,DNA聚合酶,指數(shù),2n,使目的基因的

5、片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增,要有一段已知目的基因的核苷酸序列(前提條件),過程:,a、DNA變性(90-95):雙鏈DNA模板 在熱作用下,_____斷裂,形成___________,b、退火(復性55-65):系統(tǒng)溫度降低,引 物與DNA模板結(jié)合,形成局部________。,c、延伸(70-75):在Taq酶的作用下, 合成與模板互補的________。,氫鍵,單鏈DNA,雙鏈,DNA鏈,PCR技術(shù)擴增與DNA復制的比較,堿基互補配對,四種脫氧核苷酸,模板、能量、酶,DNA在高溫下變性解旋,解旋酶催化,體外復制,細胞核內(nèi),熱穩(wěn)定的DNA聚合酶,細胞內(nèi)的DNA聚合酶,大量的DNA片段,形成整

6、個DNA分子,目的基因的mRNA,單鏈DNA (cDNA),雙鏈DNA (即目的基因),反轉(zhuǎn)錄,合成,,,1)反轉(zhuǎn)錄法: 以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板,反轉(zhuǎn)錄成互補的單鏈DNA,然后在酶的作用下合成雙鏈DNA,從而獲得所需的基因。,蛋白質(zhì)的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列,目的基因,推測,推測,化學合成,,,,2)根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法 :,3、人工合成的目的基因,二、基因表達載體的構(gòu)建 基因工程的核心,1、目的: 所需物質(zhì):,使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在,并且可以遺傳給下一代,同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。,它們各自的作用是什么?,2、基因

7、表達載體的組成:,復制原點+目的基因+啟動子+終止子+標記基因,它們各自的作用是什么?,啟動子:位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷,它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位,有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA,最終獲得蛋白質(zhì) 終止子:位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷,能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄 標記基因的作用是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因,從而將有目的基因的細胞篩選出來,,載體與表達載體的區(qū)別:二者都有標記基因和復制原點兩部分DNA片段。表達載體在載體基礎上增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結(jié)構(gòu) 用到的工具酶:既用到限制酶切割載體,又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接,兩種酶作用的化學鍵都是磷

8、酸二酯鍵 啟動子、終止子對于目的基因表達必不可少 目的基因不能單獨進入受體細胞,必需以表達載體的方式攜帶進去。,注意,三、將目的基因?qū)胧荏w細胞,(一)轉(zhuǎn)化:,(二)方法,,將目的基因?qū)?植物細胞,將目的基因?qū)?動物細胞,將目的基因?qū)?微生物細胞,,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,基因槍法,花粉管通道法,顯微注射法,感受態(tài)細胞,目的基因進入_________內(nèi),并且在 受體細胞內(nèi)維持_____和_____的過程,受體細胞,穩(wěn)定,表達,1、將目的基因?qū)胫参锛毎姆椒ǎ?(1)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 農(nóng)桿菌特點:,易感染雙子葉植物和裸子植物,對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力,原理:Ti質(zhì)粒上的T---DNA可以轉(zhuǎn)移到

9、受體細胞,并整合到受體細胞染色體的DNA上。,過程:,優(yōu)點,(2)基因槍法 (3)花粉管通道法,2、將目的基因?qū)雱游锛毎?方法:顯微注射法 程序:,目的基因表達載體提純 取卵(受精卵) 顯微注射 受精卵 新性狀動物,,,,3、將目的基因?qū)胛⑸锛毎?原核生物特點:繁殖快、單細胞、遺傳物質(zhì)少 方法:,用Ca2+處理細胞 感受態(tài)細胞 表達載體與感受態(tài)細胞混合 感受態(tài)細胞吸收DNA分子,,,,四、目的基因的檢測與鑒定,檢查是否成功,(一)、檢測,1、檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因 (關(guān)鍵步驟),.首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA .用含目的基因

10、的DNA片段用放射性同位素等作標記,以此做探針 .使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明染色體已插入染色體DNA中,(1)方法:,DNA分子雜交,(2)過程:,歸納步驟,DNA分子雜交示意圖,采用一定的技術(shù)手段,將兩種生物的DNA分子的單鏈放在一起,如果這兩個單鏈具有互補的堿基序列,那么,互補的堿基序列就會結(jié)合在一起,形成雜合雙鏈區(qū);在沒有互補堿基序列的部位,仍然是兩條游離的單鏈。,P15思考與探究,(二)、鑒定(個體生物學水平),2、檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA,3、檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì),抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等,方法:,分 子 雜 交,方法:,抗原抗體雜交,

11、過程: 用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA,歸納步驟,(四)目的基因的檢測與鑒定,檢查是否成功,檢測,鑒定,,檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA 上是否插入了目的基因,檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA,檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì),抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等,方法,方法,方法,DNA分子雜交,分子雜交(注意與上不同之處),抗原抗體雜交,歸納: 基因工程的基本操作程序,獲取目的基因 從基因文庫 利用PCR 化學方法人工合成 構(gòu)建基因表達載體 目的基因、啟動子、終止子、標記基因 將目的基因?qū)胧荏w細胞 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法 目的基因的檢測與鑒定

12、檢測:是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯 鑒定:,練習1:(2008理綜山東卷)為擴大可耕地面積,增加糧食產(chǎn)量,黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注。我國科學家應用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。 (1)獲得耐鹽基因后,構(gòu)建重組DNA分子所用的限制性內(nèi)切酶作用于圖中的 處,DNA連接酶作用于 處。(填“a”或“b”),a,a,練習1:(2008理綜山東卷)為擴大可耕地面積,增加糧食產(chǎn)量,黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注。我國科學家應用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。 (2)將重組DNA分子導入水稻受體細胞的常用方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和 法。 (3)由導入目的基因的水稻細胞培養(yǎng)成植株

13、需要利用 技術(shù),該技術(shù)的核心是 和 。 (4)為了確定耐鹽轉(zhuǎn)基因水稻是否培育成功,既要用放射性同位素標記的 作探針進行分子雜交檢測,又要用 方法從個體水平鑒定水稻植株的耐鹽性。,基因槍法(花粉管通道法),植物組織培養(yǎng),脫分化和再分化,耐鹽基因,一定濃度鹽水澆灌,1)以下說法正確的是 ( ) A、所有的限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列 B、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運載體 C、運載體必須具備的條件之一是:具有多個限制酶切點,以便與外源基因連接 D、基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)出來,C,練習,2)不屬于質(zhì)粒被選為基因運載體的理

14、由是 A、能復制 ( ) B、有多個限制酶切點 C、具有標記基因 D、它是環(huán)狀DNA,D,練習,3)有關(guān)基因工程的敘述中,錯誤的是( ) A、DNA連接酶將黏性末端的堿基對連接起來 B、 限制性內(nèi)切酶用于目的基因的獲得 C、目的基因須由運載體導入受體細胞 D、 人工合成目的基因不用限制性內(nèi)切酶,A,練習,4)有關(guān)基因工程的敘述正確的是 ( ) A、限制酶只在獲得目的基因時才用 B、重組質(zhì)粒的形成在細胞內(nèi)完成 C、質(zhì)粒都可作為運載體 D、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料,D,練習,5)基因工程是在DNA分子水平上進行設計施工的。在基因操作的基

15、本步驟中,不進行堿基互補配對的步驟是 ( ) A、人工合成目的基因 B、目的基因與運載體結(jié)合 C、將目的基因?qū)胧荏w細胞 D、目的基因的檢測和表達,C,練習,,,知識點一:1.原核細胞的基因結(jié)構(gòu),,,,,,,非編碼區(qū),,非編碼區(qū),編碼區(qū),編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,與RNA聚合酶結(jié)合位點,啟動子,終止子,,啟動子:位于基因首端一段能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列。沒有啟動子,基因就不能轉(zhuǎn)錄。 終止子:位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷,它能阻礙RNA聚合酶的移動,并使其從DNA模板鏈上脫離下來,使轉(zhuǎn)錄終止。,RNA聚合酶:能夠識別啟動子上的結(jié)合位點并與其

16、結(jié)合的一種蛋白質(zhì).(以模板轉(zhuǎn)錄然后脫落),不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA,不能 編碼蛋白質(zhì)。,:能轉(zhuǎn)錄相應的信使RNA,能 編碼蛋白質(zhì),編碼區(qū),非編碼區(qū),原核細胞的 基因結(jié)構(gòu),,,有調(diào)控遺傳信息表達的核 苷酸序列,在該序列中, 最重要的是位于編碼區(qū)上 游的RNA聚合酶結(jié)合位點。,,,,,,,,,非編碼區(qū),,非編碼區(qū),編碼區(qū),編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,啟動子,終止子,,,,,,,,,,,,,,編碼區(qū),與RNA聚合酶 結(jié)合位點,,,內(nèi)含子,外顯子,能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子,不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子,啟動子,終止子,編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,內(nèi)含子:,外顯子:,知識點一:2.真核細胞的基因結(jié)構(gòu),真核細胞的 基因結(jié)構(gòu),,編碼區(qū),非編碼區(qū),,外顯子:能編碼蛋白質(zhì)的序列 內(nèi)含子:不能編碼蛋白質(zhì)的序列,:有調(diào)控作用的核苷酸序列, 包括位于編碼區(qū)上游的RNA 聚合酶結(jié)合位點等。,非編碼序列:,包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子,原核細胞與真核細胞的基因結(jié)構(gòu)比較,思考,編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì),原核細胞與真核細胞基因結(jié)構(gòu)一樣長嗎?,連續(xù),不連續(xù),編碼區(qū),非編碼,

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